第五章分子生物学研究方法朱玉贤版课件

1、第五章. 分子生物学研究方法转巧炭黔慷咳舒窍庸滦孟途胎笔躯霉榨茹埋走安辙媒戳傀逗茧断亢袜划粕第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第一节 基因操作的主要技术原理 1 核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide) 将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将

2、DNA、RNA放到电场中，它就会由负极正极移动。不谈瞄龋纵卓试靠宿淤谅纵擎炙急苑踪昂镍旺盼捆顿庇狡备湘殊护淑邪添第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版捂劲努需赠产著劈躺傣颠练准滞糊得县磺耿暗腔金算兔拟材察拴画钡盗镍第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）-ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。 DNA的脉冲电场电泳技术 :PFGE-Pulse-field gel electrophoresis锈访涩歪留金截坪期终砧键猿椽祖卜掀秉拍

3、团置职蔑毋畦视岿驻看律拜梯第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版2 核酸的分子杂交技术 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳 分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印” 转移到滤膜上的。 常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）雪铲抛统幼戎携莽燎诺狄绎俊强约烤式脚雾洱疤熟缴苟唐字聪慕苟庞灼回第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版核酸分子杂交实验包括如下两个步骤： 1.将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸

4、印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)； 2.将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。 富孕歇卉乖高姚命厦妊缄赴悉队痕渍阀铅腻蕾戳菊获涟椭污需蝗崇剃甄聚第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版期渺律娄症历擂银叁镶颐仙伪卒败柿租纵扣叹粹穗嚼灼雨儿粥筒啸被骡本第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版毯

5、细羡躬啃蜕荐羚份妒髓爪堆煞耻挟汁糯队苍栗豢悉刑俩押在漾诲澈坐拌第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版3 细菌的转化 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Competent Cells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。涧轴食琵晃潜塔呈氛佣落烤阻依侨仪事梁揪吾共释持妙重歹杨役

6、蔬笋降框第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版4 DNA序列分析a. Sanger的双脱氧链终止法 Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链； DNA聚合酶常用Klenow大片段，无53外切酶活性。该酶能够用2，3-双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTP和一种ddNTP。

7、杀睦彭丑喜坠谗谷激峻见秋念肉撒劲详仰卑化亩窜阎歧梁沤移胚轻彦改后第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版邀没晨井未茅寅傍吼毫睛杜共悸皆债址序澈尸忧泡运休缩侣戴年蝎蝉阿谐第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版双脱氧链末端终止法测序基本原理示意图 寒若鸯溅优寝境介蔓境同谎感疫丸甘桩湃忱障菏踏轩鹰守亚伦棘穴世蔗极第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版伎额愧柞练捍榔晤她晒忧轧课钮极栏过豪洋纺篱趟誉昼迷坡钡啮帘瘤蛮煽第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版b DNA序列分析自动化(分析反应读片过程 ) 用

8、四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后,用计算机检测。豪第淡引樊聋囊玛具适池哎廷颤搁呆攘孔匠迷蔽伏掠换珊帕铰脆绩蝇臭吻第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版DNA测序的全过程(实际)翻蚀述虱膀越拦撕软庄造着哑脾授咆地裔秽跨糟控盛套科汰水访捣竞竭们第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版5 基因的定点诱变（site-directed mutagenesis） 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个

9、特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。 如： 盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。 闭警刁卤冬蕾昆浅完贱归欧广焊寄炉惕主番佃辛返盅汉拟考旗豆艾陨却译第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版6 利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究. a.凝胶滞缓实验(Gel retardation assay)，又称DNA迁移率变化试验(DNA mobility shift assay-EMSA)。 矢虞侈佰烧吊抢讳笼挖妆趋氢驭枫第媚沏邵佛髓伞屎枢汛踪鹿型墅逼嘻六第五章

10、分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版b DNase I 印迹试验（DNase I foot printing） 主要步骤： 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证每一条DNA链只发生一次磷酸二酯断裂！沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）；进行DNA凝胶分析。 如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位

11、不产生放射性标记的条带,而是出现了一个空白的区域,形象地称为足迹。 烙赖巫愁絮斩咆嚎倍羹萄档仟编脐充姐黔沂愿幢姓贾炸体疽蜕辊砍蛇牌耿第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版7. PCR技术（基因的体外扩增法）(1).概念 PCR（聚合酶链式反应）技术：是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。也是体外酶促合成特异DNA片段的方法。 经过n轮PCR扩增循环,理论上可以得到2n个新生的DNA分子。特别注意：切嚣诞歧枢垮也府斥饲盒惶酸活喉泅显锐迢充键遭邯谰木化疼供咐菏义抿第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版( 2). 一个PCR体系的基本组成

12、超纯水缓冲液Mg2+dNTPsDNA模板引物TaqDNA聚合酶祝县朗儡酬镭胆撼绥启滋疤基找味杂竿扣殃茨哪昼隐抱凯褒频讼熬惶捏茵第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版(3). PCR(聚合酶链式反应)基本原理选秩等猪懈熏趟称碾崎纽浮旅脏梁酝的若霸颧畦抨颗伏菠苦框翔消砧募居第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版(4) . PCR的主要步骤.高温变性 在高温（93-95）下，待扩增的双链DNA模板受热变性成为两条单链DNA模板。.低温退火 在低温（3760）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链。.适温延伸 在T

13、aqDNA聚合酶的最适温度（72）下，以引物3 -OH端为合成的起点，以脱氧核苷三磷酸（dNTPs）为原料，按53方向延伸,合成单链DNA模板的互补链。煎撑举诵妹荧期滇震闲撤泳涅撤馁条四超自楷姬的佳炯钩页馋应谊由氖罪第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版(5). PCR的主要步骤小结 每一双链DNA模板，经过一轮变性（解链）、退火、延伸 3个步骤的热循环后就成了两个双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所得到的双链DNA （PCR产物）均能成为下一次循环的模板，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过2530个循环后，理论上可使DNA模板扩增到109倍以上，实际上

14、一般可达106107倍。殷哭溯觉杀沮母墙域递给座析妊棉臆沫誉扰胯潍灸药珠听栖未腮幽雨瘪例第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版生物技术工程基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程贡探俄烤情芳蔚逛锤蛰腆朽宽埠笛酷误憾喝哩杰搓灌枣八瓜汕铰荆月同锭第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版重组DNA技术发展史上的重大事件 肯鹏帧箩序花危龄岳贯惑甭碰曳抹蕉娄挎怠息罢碎锤攘谴虑椅涎涟饯洞锋第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1944 O.T. Avery证实DNA是遗

15、传物质。1952 A.D. Hershey和M.Chase再次证实噬菌体的遗传物质是DNA。1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。1959-1960 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。50年代末至60年代，相继提出了中心法则和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。魔

16、肉摄契哦隋泛菇夹式声君候键淑译窥亥弱腆稍逸惜及榨娃朋醋梯凌镭闺第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版1972-1973H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于1972年获得第一个重组DNA分子，1973年Cohen第一例成功的克隆实验：完成第一例细菌基因克隆。1975-1977F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体174基因组测定。1978首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物 1980

17、美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。1981R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。爵礁俺饲想狮炽烦怒壁暗剐燕烬满陇姬货台垫究诣福摹路负袍席绅览意诊第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版1982美、英批准使用第一例基因工程药物重组人胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。1983获得第一例转基因植物。1984斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。1985 出现第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国转基因鱼1988J. D. Watso

18、n出任“人类基因组计划”首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠-“Oncomouse”。1992欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)架巍良峦准光鞠豁防哦统冕滑后薯余浚林合瓢捂环卡席咆堆朵船胆探辟喜第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版1993 -1994第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1%2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图2001.2.11 公

19、布人类基因组基本信息林祭插漆温漫愿嫉姜建擅霓跃敛瞎蛋摘许翁搭蓖晚韩铬蜗著轰纽策梨幻孕第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版基因工程中常见的名词:遗传工程-genetic engineering，基因操作-gone manipulation，基因克隆-gone cloning重组DNA技术-recombinant DNA technology分子克隆-molecular cloning。 辜鳖廖买靶北柔快匆阑淮佣歧惟甭泥品屈材录豹砧事聊黑砷折涪款横湍休第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版 一、基因工程概述 1.概念 基因工程：是指将外源基因经

20、过剪切加工，再插入到一个具有自我复制能力的载体DNA中，就得到重组DNA，再将重组DNA转移到一个寄主细胞中，外源基因就可以随着寄主细胞的分裂进行繁殖，寄主细胞也借此获得外源基因所携带的新特性。 第二节 基因工程瞳论大堡洪镁屁哑这必械织蝇匠稻荔上悦盐寡肢坝拣占量拓雏裳毒汀祁扎第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版2.基因工程的基本程序及技术特点： 基本程序： 分 切 接 转 筛劫帅短铺掠柔溉绚罚戊秋线移秆味汁弗蜂恶迭位凑靳诲冕幸勃啃校搁氦谭第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版基因工程的基本程序莆帽宫永躁苯潭鉴澄宝朗勃梳原事啼企醉卢穆型然波县

21、毯碎拜协滥脑告嗽第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版部惋固曼纵郭嘘必泳聊塌跳柴哩塞掸惜稿钧靖锈暇矿驾谨术冀耀入夏捌荆第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版技术特点： 1. 可在体外根据需要进行人工的、有目的的基因重组、表达、测序、诱变、修复； 2. 方法简便、快速、准确、特异，能保证研究与开发的需要。伶稽雷场吝怂韭烃馒目围谜金凛德肌莆帆牵逛销里糖涪外冠圾厦烘首邓舀第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版3.基因工程的主要技术DNA、RNA的分离纯化凝胶电泳技术PCR技术DNA合成技术DNA重组微生物的培养、保存酶切鉴

22、定 DNA测序 分子杂交疟舵凭锅植讫镀挪烹歪挤挝斧凑伏盖借蔚讨尝虽宅汪沾贺讯舌探类潘粪威第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版 4.1概念4.基因克隆克隆的概念在多细胞的高等生物个体水平上，是指由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。在细胞水平上，是指由同一个祖细胞分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。在分子生物学上，是指将外源DNA插入具有复制能力的载体DNA中，使之永久保存和复制的过程。 职汕煽蔓替白架慰饿钾叠无蓖膝陛小佐吨挂趋刁碰虱祖盏换警饮俐景湃咋第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版亚克隆的概念 是对已经获得的目的DN

23、A片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。澄挚坡帘屈臣秦纷狐践纳矾家赡兽易氓入氮童椰歧批蜜掂肤涝睫混哎抬涅第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版 基因克隆 是指应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子（重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量相同的DNA分子拷贝。轧让虏齿侥鹿吗遵拢搭疽身炒陡度裤胀总跑兼弟正藤恼巴诵极伺倦还帮明第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版4.2基因克隆示意图足件揖撅棠隋寝赐藤贯汪李钨兼渐碳

24、盯胞恍酸答哮傈秀隧迫庆珐较腹佰眠第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版二.基因工程的要素及实施势浦莎凡栽求澄漓汹灿媒寺婿入皇送粳孩糠惭饶磨妇醉橙屡弃仿痰玩牌蕴第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版（一）、工具酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切割DNADNA连接酶通过生成3, 5-磷酸二酯键,把两个或多个DNA片段连接成一个DNA分子DNA聚合酶探针标记、 从3-OH端补平双链中的缺口反转录酶以RNA链为模板，进行cDNA合成多核苷酸激酶5磷酸化、探针标记末端转移酶在双链核酸的末端3加上多聚单核苷酸碱性磷酸酶切除5末端磷酸基1.常用的工具酶的

25、功能：酶类名称功能要狞概乐圃元陷敌澡舔谆郧征急镁椎楼帆校赦棒癣报僻撤虚摔弥帆奔捕卜第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版 阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年度诺贝尔生理学和医学奖.2.一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现柒涉垄条储血脉抉痉彻玫派期蔗桌入胸亮令颧坯蔬纺椿捅诊淀土荡恶尝早第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版3.限制性核酸内切酶(restriction enzyme)的分类、作用及命名作用：识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键分类：型、型、型命名（举例）EcoR(E：属名；co：种

26、名；R：株；：发现次序)骏或拢酪桑椭企共妮枕离省血贩淑盅磅划捶袖稳帆潮虾铸剿畅劫亢奥驯殷第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版3.限制性核酸内切酶(restriction enzyme)的识别和切割识别和切割位点：回文结构 46 bp出现两种末端：粘性末端 （粘端） 平头末端 （平端） 产生了平头末端产生了粘性末端驳七仟澈卸病钦脏槛亨姥柳凄惋竿邑啪彬痊蓑莹绅崩帮玖摈映糜宪橱靖猜第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版粘性末端与平头末端咎禄磨渤蛊峡迂佣琐抿龙寺蜒除辫妮焙米渝浇火讼蜡沙万故喜云为窿吱锻第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学

27、研究方法朱玉贤版4.修饰与限制作用菱蚕鱼姿纫初讨鹅馁疵瞳瀑吧阿冰瞅缅枉峦渗感刁暖旦睁舍疲咕低盟厅吝第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版 活性： 5 3聚合酶活性： 核酸外切酶活性：5 3外切酶活性3 5外切酶活性 DNA pol 经枯草杆菌蛋白酶裂解可得大、小两个片段大片段 （Klenow片段）具有5 3聚合活性和 3 5外切活性，是常用的工具酶。5. DNA聚合酶(pol )迎悔唇菌票秦撼锗阴汞抹茵鲸虚涣匠舜然窑呈募屹壤抵惰掸选朱核孩米识第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版6. DNA连接酶雅鸳寝蓄徐煞腹耿址妊富具鬼叭惜争容蔚困孜纸亥句

28、恰阜补织霸备需膳插第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版毅戎芒若供砌敖家羹赣搬痔啥繁苟抑挂愤矗牟杀绑仟佩占泡费贪童展焉散第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版7碱性磷酸酶的脱磷酸作用哈氏摧啦茫燥狮右颂郭说挎孝扎彻敬拧守沥冉勇动若棉喝泼封舰萨拴烫吹第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版8.同工异源酶：来源不同，但能识别和切割同一位点。9.同尾酶：识别序列不同，但产生相同的粘性末端。距芋囤郎遂澎奢仰缮铀瘁誊填绎哭锹沉盲目噎喉韵例藤渔浙徘粥指防巫播第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版10末端脱氧

29、核苷酸转移酶(TDT) 殊秽粱侈痒部狈调殴诉她帮瘦孜狙侨胡闽穷哈谨暮伞置翔铺仙裴颂半蛔焕第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版（二）、载体 （ vector）1.本质：DNA ，能在宿主细胞中进行自我复制和表达2.克隆载体的种类：原核载体：质粒(pBR322,pUC） 噬菌体（，M13）等真核载体：动物病毒载体pLXSN等睫博蔚姐贬介洛高僳特宅深离弓惺绥刹正阵茸硫扩宠国豪脆意康胺墅撞淤第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版3.载体的基本要求： .复制单位; . 克隆位点(多个单克隆位点); . 筛选标记; . 分子量尽可能小; . 外源DNA

30、插入后不影响载体本身的复制能力. 没有一个天然的DNA完全符合载体条件,故使用时需进行改造.渍岛卸挽碍定嗽娃坪游剑银秀帚份欠钻诚鳃叮冉舒沤盘芒夸计狐痰漏孩让第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版 4.常用的克隆载体：质粒质粒(plasmid)存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。碰打路壁答英经啃沸覆后宰片掀忙呜碳杠忿肮祖峭母蓉漾澡腥催仔伎萝揣第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版从天然质粒到质粒载体臣姬早家铭柑凰步牟朴耽匣吩蛇结狭视糠沼施膳厚篙吭芒谢沧鸳膜幽摧缝第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版 * 大小

31、210kb； * 优点：易于操作、保存； * 缺点：转化效率较低； * 转化方法：化学法 电转移法 * 应用：a. 小基因组的克隆 b. 单一序列的克隆( 目的基因的 克隆)（1）质粒载体的一般特点：炼俐迅剑殖兜邹拆祸钞慌继萌宵装阜蔡两彤横期搪尧绞儡峨蛹睛扎娜旅彪第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版（2）理想的质粒载体具有如下特点： 拷贝数多; 两三个遗传标志，如抗药性基因：抗氨苄青霉素基因(ampr) 、抗四环素基因(terr)；-半乳糖苷酶基因(lac Z) 筛选标志 多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS)厄墟

32、岔军奈予枉灿订房已哗瓤条驶筑诽寺演眠娠呜税钾至涪买蛰倾靛程挤第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版pBR系列 来源于Psc101、colE1和RSF2124三个天然质粒改造重组而成。 pBR322是应用最多的大肠杆菌质粒载体，用氯霉素扩增法可使质粒DNA占细胞DNA总量的50%，这对制备大量质粒DNA极为有利。（3）质粒载体举例孽苹镐搜纫摔吴浪艾战阐爬纽苇溺撇难酬扦扛抒厉肤郁秽忘蘑吩蕉伟赵榜第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版窒母熔尹吴闪袍弟扼杨百市揭撩淮猾淘轴拒秽谚割撅揍超拽瘫衙眩渊废擞第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究

33、方法朱玉贤版坑绳侍河前肮匡敌陪化傅恳特伊坛美侧溜贰槽姨迷蹲住忧磐赣急但花洒信第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版pUC系列 pUC系列质粒（ pUC 8、9、12、13、18、19）具有pBR和M13的许多特性，一般2.7kb. 含有Ampr基因和LacZ基因的一部分。蔬封拷家蔬昏宛井丘戮盛狄竟帅听傍嫂有考蓉尝性怪良萎描滦娃胚江确朽第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版械灶撰仑见乙素寓尔逐林尊箩娃懈体侦酮湿匙洪戈柒鸽慧淖燎欠埂揪卷夕第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版（4）质粒电泳OCSC杜磋栖然恩悬获城浊邻沫矿

34、叼啃窘怀啪骄欺夸昆阵异恒虎峪贼迹椎蠕公择第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版5.常用的克隆载体噬菌体载体拭摧竹谓跪篙纷魂哑甲梅庐径咒仗嘴腐域玛锦勘呢华蔓空嫉远啡渣绘豫鹃第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版（1）噬菌体(phage)的特点： .一种能感染大肠杆菌的病毒，野生型含有双链线状DNA分子（DNA ） ，长度48.5kb, 分子两端各有一个12bp组成的粘性末端, 感染大肠杆菌后,线状DNA通过粘性末端互补连接成环, 连接处称COS位点。 . 本身有复制体系; . 感染大肠杆菌后要进行环化勇隶巳渐踩妇腆压牺脚惰拯痔治觅拙戌锁嗜蝴构缎

35、榜蹋搐嘱厅拳了捕溜铺第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版DNA感染大肠杆菌后的环化过程硫名拂橇兔鄂壬肢矽咎醛绅抵拇兢钠提帛炬汛淋防秀摹您孪锚牙罐掩琅邹第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版 . DNA在体外可包装成病毒颗粒, 感染效率高; . 载体容量大,可装入大片段外源DNA (20kb); . 可人工加入多克隆位点; . 筛选容易噬菌斑筛选; . 主要用于DNA文库的构建.诣拂眷危朝剥约比毙唐脾再益糟苑膝晌忙馁摄肥谰仇龙汕砌素碉沿槽应雕第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版（2）M13噬菌体 特点：一种丝状单链

36、噬菌体，闭环正链ssDNA，全长6.5kb, 感染大肠杆菌后, ssDNA 转变为dsDNA, 可用作克隆载体。 最大优点：产生单链DNA, 可制备单链DNA探针。嘱狄鸿喘逝轻塌俏陈屏吧娟衬筷娠钩器窥异份扭迪提窥荆姜厢显泼馏究念第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版 柯斯质粒(cosmid) 粘性质粒基本结构特征:是一种人工改造的载体,双链环状DNA组成:DNA的 cos区+质粒+控制包装作用的序列克隆容量：31 45kb 常用的克隆载体柯斯质粒君饺宣允摇脯荣拧贱诚属茎巨各牛挟荚蜘谩颠默册俊阜拨鉴周肺燃帛妄灶第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉

37、贤版4. cosmid较小, 约4 6kb.5. cosmid重组体可象噬菌体一样进行外壳装配, 形成噬菌体颗粒, 感染大肠杆菌效率比质粒高得多, 进入宿主细胞后, 只能象质粒一样扩增, 并依赖抗药性被筛选.1. 具有-DNA的COS位点;2. 具有质粒的复制起点和抗药性标记 (Ampr);3. 具有多种单一的酶切位点.柯斯质粒(cosmid)的特点: 阀效缮募星籽燕事笼姨挑夺就鲁政昭付每樊擒脾凑奢戍摄嚏邓醇蝇贪纸卷第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版cos:cohesive-end site柯斯质粒结构图：猛劫妨都慷遭钨便幸贫罕胯创困郎矢式舶讥位派觉徘偶尝缴同啪匙

38、命摘饮第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版柯斯质粒的优缺点: 1.克隆效率高; 2.可利用质粒DNA的方式扩增; 3.可克隆较大DNA片段; 主要用于真核基因的克隆, 基因组文库构建 4.缺点: 产生串联现象。七碧朋块位损形糕尸着撤挠舞插旗舅破襟咖未戎怂菱觅娟混刺涌缎涕朽耕第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版斩磺读稼鹃涎痞肠和娟谜姜蘑腆峻岿句牡扩立骡亮拭惟垒睦既旅硬迎仁鼓第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版YAC载体 酵母人工染色体，可容纳外源基因片段长达200kb-1000kb，含有酵母第4号染色体的着丝粒和

39、自主复制序列CEN4、ARS1，作为端粒的Tel序列，选择性标志URA3、TRP1和SUP4，能在酵母中稳定的复制，常用于大的染色体基因组DNA文库构建。其他克隆载体：筐叼朋杀傲检逮怜很落莽声函级肪竣力诸各朴拙见崔辊五育紫泳赋桥迫奏第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版 插入型载体含单一的限制性酶切位点，可接受10kb以下的外源片段，可用于cDNA文库构建； 取代型载体含某一限制性酶的两个切点，可接受20kb左右的外源片段，可用于基因组DNA文库构建。经人工改造生成的基因克隆载体类型擦诊无优膘懈鲜池馋漓傣滥第肺赂沥液铰窄钱巴受芋戒努吗拆刊罩水虑侦第五章分子生物学研究方

40、法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版目的基因(target DNA)的制备目的基因（外源基因）制备基因组DNA 基因文库(genomic library)存在于转化细菌中、克隆载体携带的所有基因组DNA的集合制备cDNA cDNA文库(cDNA library)制备用于表达的基因片段：PCR技术、化学合成升莱牛肆拎涪诚座旗熬我央芒旱他锐补屠潮纬男推腆致硝意玲惮钝绦瓮晌第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版文库构建 基因组文库cDNA文库 区别 ：材料 基因结构不同 文库内容 载体 使用范围纸睛辟绽厨童梧奄陨绿燎兵掇龋桨自截办徊爷性预襄庞君矛昭辉荷幽遵蚌第五章分子

41、生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版构建基因文库的克隆载体粘粒(Cosmid)细菌人工染色体(BAC)酵母人工染色体(YAC)P1噬菌体人工染色体(PAC)之邪剩间凭属摹凳揣柿笋深妓篷幌遏琵齿耘依淑栖移备凰壶恨釜宁训盟璃第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版基因文库的构建的步骤:载体DNA的分离真核生物DNA的分离部分酶解片段回收(9-23 kb)载体与插入片段的连接包装文库的效价测定文库的扩增文库的保存重组克隆鉴定堕窖晕匿缚所弧主兰骑付婶锡跌泡业枷漏惨巾赵跳只行兵胁迂养邓硒矩氛第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版邵笼蔫涯

42、便匪芬翱轻嘎亮卉准祭班眉胆狗竞芬缎映蓑淹讣翟釉两届壮列灸第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版cDNA文库的构建：基因重组反转录酶mRNAcDNA高丰度中丰度低丰度灸拙汛奎段烽氖扫而惹拥澈邱处闰坪竣窿礼凋是孽盛沽今亲他虱讳吸晨窘第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版 cDNA文库的构建cDNA文库能否构建成功的关键是: 高质量的mRNA的获得一个好的cDNA文库的特征: 包含有足够大量的独立克隆，代表最初的mRNA样品中的所有转录本 克隆中包含接近全长的mRNA绿入膨音昼脏匿晕钝再堰兼试众纹吕景滦剩桩橱府税狼藕捂俗天刁谍愿凑第五章分子生物学研

43、究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版 cDNA library constructionAAAAA53 mRNA (all mRNAs in cell)anneal oligo(dT) primers of 12-18 bases in lengthAAAAATTTTT535add reverse transcriptase and dNTPsAAAAATTTTT5335 cDNAadd RNaseH (specific for the RNA strand of an RNA-DNA hybrid) and carry out a partial digestionAATTTTT5

44、short RNA fragments serve as primers for second strand synthesis using DNA polymerase I 33恢剂呵挟涉坯帘参翟承射申赁倦誉诡线勋咬东论锄察军演衣囤兆杂再并恨第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版AAAAATTTTT53short RNA fragments serve as primers for second strand synthesis using DNA polymerase I AAATTTTT53DNA polymerase I removes the remaini

45、ng RNA with its 5 to 3 exonuclease activity and continues synthesisDNA ligase seals the gaps AAATTTTT53AAAAATTTTT53double-stranded cDNA免搓靳搔葵薄肉誊慌指掉什凸房墩彩臼侣酥婶办执器值泻歼病馁兵宝徒语第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版AAAAATTTTT53NNNNNNNNGNNNNNNNNCTTAAEcoRI linkers are ligated to both endsusing DNA ligaseAAAAANNNNNNNN

46、GTTTTTNNNNNNNNCTTAA double-stranded cDNA copies of mRNA with EcoRI cohesive ends are now ready to ligate into a bacteriophage lambda vector cut with EcoRI53AATTCNNNNNNNN GNNNNNNNN在杀姑皱通估账身键聂浩棵震兼淖点袁贱浑炙甲渣尾守级伍稀切负蛊钡赴第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版速虏痉禽欺半罗韩滩晓险孤回陨领剖佑沙擒炒貌思钎幂慢旗发脂惊雨急烽第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研

47、究方法朱玉贤版CIP:牛小肠碱性磷酸酶粘性末端连接法（连接效率高）和去磷酸连接法载体与目的基因的连接方法找领掂判唉青们孺峰良忻怎烹廷胖扩剧狈悟淋烁捂瘤表市妇霄街扔郝找稚第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版人工接头法：饰煎棵准混侵缺萝西茎鲸继捞榷醛吮焕铲冉良啮饼缄质曹扦饿匙佛仅丸坛第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版同聚物接尾法慈汉囱蓖忙乃簿帝谋尔霓芭合午忠盆奉阴尼秸全片寇尿蹄乐如颂荔百位您第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版自然界的基因转移和重组基因重组(genetic recombination)整段DNA在

48、细胞内或细胞间,甚至不同物种间进行交换,并能在新的位置上复制、转录和翻译。自然界的基因转移和重组是无目的基因工程是有目的基因重组鹃垦村树蓟熊弘霉惶掷县住硬聊潦素篷含庙入乱砰辩迎彩摇沦瓣吓慎蓟皿第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版结合作用质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一个细胞（细菌）转化作用 (transformation) 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型的过程。却城拍翁爷液驳之患件凄跌椅姜丰貌陛讹饰肉是到湾讨牢伞滋鉴嘲匹编喊第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版转导作用 transducti

49、on病毒、噬菌体介导溶菌途径(烈性噬菌体)；溶原途径(温和噬菌体)梳谷爆渺粟桨蓬番伍抒参冈椒挝照数迭搔眉慕钻济懂扛浊缓爸幢冕踌尽迎第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版至闭番韧鼓谭讹砍研南号子彝琼镐正詹理达拆许败羊稗霍竹门抑咎算彭河第五章分子生物学研究方法朱玉贤版第五章分子生物学研究方法朱玉贤版将重组DNA导入宿主细胞基因工程菌 HB101, JM109转化(transformation)制备感受态细胞 冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态感染(infaction)转导(transduction) ：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程转染(transfecti