课题3　血红蛋白的提取和分离 (2)

1、课题3 血红蛋白的提取和分离P64阅读课本P64-66“基础知识”完成：了解感知（一）、（二）、（三） 在课本中勾画出相应的知识点自主阅读，独立思考P64分离蛋白质的原理P64先收集到的是分子量大的物质P65还记得人体血液中的缓冲液吗？H2CO3 /NaHCO3 NaH2PO4 /Na2HPO4本实验使用的是磷酸缓冲液保证血红蛋白的正常结构和功能P65 哪种分子迁移速度最快？球形小分子、带电荷量多P66阅读课本P66-70“操作提示” 了解感知（四）、（五） 深入学习1、2、3 在课本中勾画出相应的知识点自主阅读，独立思考完成实验操作步骤样品处理粗分离纯化纯度鉴定P66P67速度越高和时间越长

2、会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白P67P67P67粗分离：除去样品中相对分子质量较小的杂质P67打孔挖穴安管覆网纱包插管纯化：除去样品中相对分子质量大的杂质蛋白质P68固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱洗涤平衡P68调节缓冲液面滴加透析样品样品渗入凝胶床洗脱收集分装蛋白质P69纯度鉴定P66洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心收集血红蛋白溶液透析去除分子量较小的杂质凝胶色谱法除去相对分子质量大的杂质蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定P69P70思考课本P70“结果分析与评价”1、2、3独立思考P70 看处理的血液样品是否分层。如果分层不明显，可能是洗涤次

3、数少、未能除去血浆蛋白；或者离心速度过高和时间过长，使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到纯净的红细胞。凝胶装填均匀、没有气泡、色素带均匀平整则成功如果红色区带均匀、狭窄、平整，则分离效果好；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，则分离效果不好。课本练习和导学提纲答案课本P70练习 5、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？ 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 一、了解感知(一)凝胶色谱法 1、概念：也称做 ；是根据 分离蛋白质的有效方法。 2、原理（1）由 构成

4、的凝胶，内部有许多贯穿的的 。（2）当 不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ，而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程 ，移动速度 ，从而使 不同的蛋白质分子得以分离。分配色谱法相对分子质量的大小多糖类化合物通道相对分子质量较小较长较慢较大凝胶外部较短较快分子质量(二)、缓冲溶液1、作用：在一定范围内，抵制 的 对溶液pH的影响，维持pH 。2、配制：由 种缓冲剂溶解于 中配制而成，通过调节缓冲剂的 就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。(三)、电泳 1、概念：指 在电场的作用下发生 的过程。2、原理：在一定的 下，

5、 、 等生物大分子的可解离基团会带上 或 ，在 的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷 的电极移动。3、作用：电泳利用了待分离样品中各种分子 的差异及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中 的分离。4、方法：常用的电泳方法有 和 。测定蛋白质分子量时通常使用 。外界酸和碱基本不变12水使用比例带电粒子迁移pH多肽核酸正电负电电场相反带电性质大小形状移动速度各种分子琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(四)、实验操作1.样品处理及粗分离目的：去除 。方法： 离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），重复洗涤 次，直至上

6、清液中已没有 ，表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。(2)血红蛋白的释放加 到 体积，再加40体积的 （溶解细胞膜），置于 上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min ，试管中的溶液分为4层:第1层（最上层）： 甲苯层第2层（中上层）： 的沉淀层， 色薄层固体第3层（中下层）： 的水溶液层， 的液体第4层（最下层）：其它杂质 的沉淀层杂蛋白低速短时间三呈现黄色蒸馏水原血液甲苯磁力搅拌器无色透明脂溶性物质白血红蛋白红色透明暗红色(4)透析，方法：将血红蛋白溶

7、液装入 ，将 放入一定量适宜浓度的 中，透析 。目的：将 的杂质除去。2.凝胶色谱制作(3)样品的 。3、纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是 。 五、操作提示1、红细胞的洗涤： 、 与 十分重要。 过少，无法除去血浆蛋白； 过高和 过长会使 等一同沉淀，达不到分离效果。2、色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在 中膨胀，可以将加入其中的 用 加热，加速膨胀。3、凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的 ，降低 。4、蛋白质的分离：如果红色区带 地移动，说明色谱柱制作成功。透析袋中透析袋磷酸缓冲液12h相对分子质量较小加入和洗脱SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳洗涤次数离心速度离心时间洗涤次数离心速度时间白细胞洗脱液洗脱液的湿凝胶沸水洗脱次序分离效果均匀一致二、深入学习1、人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？2、洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水? 3、在血红蛋白释放过程中。加入蒸馏水和甲苯的目的是什么? 鸡的红细胞具有