生物技术制药第2版酶工程制药

1、生物技术制药第2版 酶工程制药学习要求掌握：酶的来源和生产、酶纯化的主要方法、固定化酶和固定化细胞的制备方法、酶反应器的基本类型熟悉：酶分离纯化的一般过程、固定化酶的性质和指标、酶反应器的性能评价及操作了解：酶工程的研究现状、酶工程在制药中的应用、治疗性的酶类药物本章主要内容概述1酶工程技术2酶工程研究新技术3酶工程在制药工业中的应用4第一节 概 述一、酶与酶工程1. 酶（Enzyme）具有催化活性和高度专一性的生物催化剂。催化特点： 高效性 专一性 可调控 不稳定1. 酶（Enzyme）根据化学本质分为： 蛋白酶（P酶） 核酸酶（R酶）蛋白酶单纯酶结合酶（全酶）= 酶蛋白 + 辅因子辅酶辅基

2、酶工程：酶学、微生物学与工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。化学酶工程（初级酶工程）： 通过化学修饰、酶的固定化、化学合成等改善酶的性质，提高催化效率生物酶工程（高级酶工程）： 通过DNA重组技术生产目标酶，定向修饰与改造获得突变酶、合成全新的酶等2. 酶工程（enzyme engineering）二、酶工程研究的产生与发展1894年，日本科学家首次从米曲霉中提炼出淀粉酶，并将淀粉酶用作治疗消化不良的药物，从而开创了人类有目的的生产和应用酶制剂的先例。1908年，德国科学家从动物胰脏中提取出胰酶（胰蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶的混合物），并将胰酶用于皮革的鞣制。1911年，美国科学

3、家从木瓜中提取出木瓜蛋白酶，并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。酶工程的名称出现在20世纪20年代，主要指自然酶制剂在工业上的规模应用。二、酶工程研究的产生与发展1953年，Grubhoger 和 Schleith 提出了酶固定化技术 。1969年，日本科学家在工业上利用固定化氨基酰化酶拆分了DL-氨基酸。1971年，第一届国际酶工程会议提出酶工程的主要内容：酶的生产、分离纯化、酶的固定化、酶及固定化的反应器、酶和固定化酶的应用。二、酶工程研究的产生与发展20世纪90年代，借助基因工程技术，可经过酶基因重组，利用微生物表达生产酶制剂。基因工程+发酵技术+发酵设备二、酶工程研究的产生与发

4、展三、现代酶工程的研究内容1. 酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应用开发；2. 酶和细胞的固定化及酶反应器的研究3. 酶的分子改造和化学修饰；4. 有机相中酶反应的研究；5. 酶抑制剂、激活剂的开发与应用研究；6. 模拟酶、合成酶的研究；7. 抗体酶、核酸酶的研究；8. 酶的定向进化技术。（一）疾病诊断（二）疾病治疗（三）药物生产（四）分析检测四、酶在医药领域的应用1. 通过酶活力变化进行疾病诊断酶疾病与酶活力变化淀粉酶胰脏疾病，肾脏疾病时升高；肝病时下降胆碱酯酶肝病、肝硬化、有机磷中毒、风湿等，活力下降酸性磷酸酶前列腺癌、肝炎、红血球病变时，活力升高碱性磷酸酶佝偻病、软骨化病、骨瘤、甲状

5、旁腺机能亢进时，活力升高；软骨发育不全等，活力下降谷丙转氨酶/谷草转氨酶肝病、心肌梗塞等，活力升高-谷氨酰转肽酶（-GT）原发性和继发性肝癌，活力增高至200单位以上，阻塞性黄疸、肝硬化、胆道癌等，血清中酶活力升高胃蛋白酶胃癌，活力升高；十二指肠溃疡，活力下降磷酸葡糖变位酶肝炎、癌症，活力升高端粒酶癌细胞中含有端粒酶，正常体细胞内没有端粒酶活性肌酸磷酸激酶（CK）心肌梗塞，活力显著升高；肌炎、肌肉创伤，活力升高2. 用酶测定物质的量的变化进行疾病诊断酶测定的物质用途葡萄糖氧化酶葡萄糖测定血糖、尿糖，诊断糖尿病尿素酶尿素测定血液、尿液中尿素的量，诊断肝脏、肾脏病变谷氨酰胺酶谷氨酰胺测定脑脊液中谷

6、氨酰胺的量，诊断肝昏迷、肝硬化胆固醇氧化酶胆固醇测定胆固醇含量，诊断高血脂等DNA聚合酶基因通过基因扩增，基因测序，诊断基因变异、检测癌基因3. 酶在疾病治疗方面的应用酶 来 源用 途淀粉酶胰脏、麦芽、微生物治疗消化不良，食欲不振溶菌酶蛋清、细菌治疗各种细菌性和病毒性疾病尿激酶人尿治疗心肌梗塞链激酶链球菌治疗血栓性静脉炎，咳痰，血肿，下出血，骨折青霉素酶蜡状芽孢杆菌治疗青霉素引起的变态反应L-天冬酰胺酶大肠杆菌治疗白血病超氧化物歧化酶微生物，植物，动物预防辐射损伤，治疗红斑狼疮，皮肌炎，结肠炎胶原酶细菌分解胶原，消炎，化脓，脱痂，治疗溃疡溶纤酶蚯蚓溶血栓核糖核酸酶胰脏抗感染，祛痰，治肝癌4.

7、酶在药物制造方面的应用 酶来源用途青霉素酰化酶微生物制造半合成青霉素和头孢菌素11-羟化酶霉菌制造氢化可的松L-酪氨酸转氨酶细菌制造多巴（L-二羟苯丙氨酸）-甘露糖苷酶链霉菌制造高效链霉素酰基氨基酸水解酶微生物生产L-氨基酸5-磷酸二酯酶桔青霉等微生物生产各种核苷酸多核苷酸磷酸化酶微生物生产聚肌胞，聚肌苷酸无色杆菌蛋白酶细菌由猪胰岛素（Ala-30）转变为人胰岛素（Thr-30）核糖核酸酶微生物生产核苷酸蛋白酶动物、植物、微生物生产L-氨基酸-葡萄糖苷酶黑曲霉等微生物生产人参皂甙-Rh25. 酶在分析检测方面的应用（1）酶试剂盒过氧化氢酶检测试剂盒 (Catalase Assay Kit)通过

8、显色反应来检测细胞、组织或其它样品中过氧化氢酶活性 （2）酶联免疫(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay , ELISA)免疫检测：让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。 间接法ELISA检测 夹心法ELISA检测 竞争法ELISA检测 5. 酶在分析检测方面的应用（3）酶标基因探针将酶与DNA直接进行交联, 杂交后只要与酶的底物显色便能观察结果。检测乙肝病人血清中的HBV DNA检测转基因材料及其后代5. 酶在分析检测方面的应用（4）酶传感器5. 酶在分析检测方面的应用第二节 酶工程技术1. 液体酶制剂：稀酶液/浓缩酶液，纺织工业2. 固体粗酶制剂：粗酶液处

9、理获得，皮革处理/纤维素水解等3. 纯酶制剂：结晶、分离纯化后获得，分析试剂/药用酶酶制剂的类型学生授课结合课本和酶工程所学内容，请各位同学按照以下分组情况准备20min左右的授课内容及ppt（下周一每组选1位同学在课堂上进行讲授），计入平时成绩。酶制剂的来源及制备（1-10号）酶的分离纯化（11-20号）酶与细胞的固定化（21-30号）酶反应器（31-41号）第三节 酶工程研究新技术本节内容核酶/脱氧核酶抗体酶有机相的酶反应酶分子的定点改造酶分子的定向进化酶分子的化学修饰一、核酶（ribozyme）(一) 核酶的发现(一) 核酶的发现上世纪80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的Thoma

10、s Cech和美国耶鲁大学的Sidnery Altan各自独立地发现RNA具有生物催化功能，从而改变了生物催比剂的传统概念。和共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。的研究工作的研究工作启示：为什么能发现RNA的催化作用并获得诺贝尔奖？如果你是一个不为常识所束缚的人，那么，你有可能获诺贝尔奖 为什么能发现RNA的催化作用并获得诺贝尔奖？如果你能根据别人刚刚发表的成果马上修正自己的研究工作，那么，你有可能获诺贝尔奖。 认真做实验认真看文献1. 核酶：具有生物催化功能的RNA。 生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶 enzyme 极端酶 extremozyme 抗体酶 abzyme 生

11、物工程酶其它： 模拟酶 model enzyme 核酸类:核酶 ribozyme脱氧核酶 deoxyribozyme（二）核酶的概念和分类核酶与蛋白质酶的比较蛋白质酶的一级结构比核酶复杂蛋白质酶具有一定空间构象，酶的活性中心具有刚性，核酶不具备蛋白质酶的活性中心由氨基酸组成，核酶的活性中心是金属离子核酶可以既是催化剂又是底物，蛋白酶只是催化剂；核酶可以传递遗传信息，蛋白酶不可以 I型内含子剪接型核酶 mRNA前体自我拼接 II型内含子 内切核酸酶+连接酶 锤头核酶剪切型核酶 发夹核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶 RNA切割 蛋白质-RNA复合酶 2. 核酶的分类（三）核酶在医药领域的应用 核酶

12、治疗疾病的原理 核酶的给药途径外源性给药：直接将抗核酸酶降解的核酸注射到组织或细胞内。内源性给药：利用基因疗法，借助逆转录病毒载体和腺伴随病毒运送核酶 核酶的给药途径 核酶在医学上的应用 展望二、脱氧核酶（deoxyribozyme ）利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力 对于脱氧核酶的研究有望成为基因功能研究、核酸突变分析、治疗肿瘤、对抗病毒及肿瘤等疾病的新型基因治疗药物的新型核酸工具酶。 核酶/脱氧核酶面临的问题三、抗体酶（abzyme）（一）抗体酶的概念与特点1. 抗体酶/催化抗体（catalytic antibody）利用酶反应中

13、底物过渡态类似物作为半抗原刺激免疫系统所产生的一类能够专一识别和催化酶反应中的底物反应过渡态的一类单克隆抗体，本质上是一类具有催化活性的免疫球蛋白。2. 抗体酶的特点 相同点：都是蛋白质，都有特异性。 不同点：1）抗体无催化活力，酶有催化活力。2）酶是能与反应过渡态选择结合的催化物质，抗体是和基态紧密结合的物质。3）酶的活性和合成受到代谢调节，抗体只有在抗原存在时才产生。抗体与酶的异同： 酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障（反应的活化能）。 以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。 直接免疫动物/杂交瘤技术/基因工程技术

14、3. 抗体酶的制备方法（1） 诱导法动物免疫技术+杂交瘤技术利用底物过渡态类似物制备抗体酶示意图原理：掌握现有单克隆抗体的抗体结合部位的氨基酸顺序的基础上，对编码抗体酶结合部位的基因碱基序列进行定点突变，在结合部位换上有催化作用的氨基酸残基，进而改变抗体酶的催化效率。 噬菌体抗体库技术/噬菌体展示技术（2） 基因工程法（1） 前药的设计和活化 抗肿瘤药物：喜树碱、阿霉素、依托泊苷4. 抗体酶的应用（2） 疾病治疗 治疗可卡因上瘾 有机磷中毒 甲状腺疾病肿瘤治疗抗体介导前药治疗(ADEPT)：向体内注射能够与肿瘤组织特异性结合的抗体酶，当其结合到靶部位后，再注入前药，当药物扩散至肿瘤细胞表面或附

15、近时，抗体酶可快速将其水解并释放出抗肿瘤药物，从而提高局部药物浓度，实现靶向治疗。催化抗体38C2戒毒阻断可卡因、鸦片和受体的结合可卡因水解的过渡态类似物磷酸单酯单克隆抗体酶15A10：在可卡因到达作用位点前将其降解，从而降低其毒性（1） 应用 有机合成中的应用 基础理论研究 在医疗上的应用5. 抗体酶的发展前景（2） 待解决问题 催化效率 抗体酶筛选 抗体酶专一性 底物抑制 催化基团的最适装配四、有机相的酶反应（一）有机相酶反应的特点有利于疏水性底物的反应可提高酶的热稳定性，提高反应温度加速反应可改变反应平衡移动方向可改变底物专一性可防止由水引起的副反应酶易于实现固定化酶和产物易于回收可避免

16、微生物污染（二）有机相酶反应具备条件 保证必需水含量。选择合适的酶及酶形式。选择合适的溶剂及反应体系。选择最佳pH值。四、有机相的酶反应（三）有机相酶反应的溶剂体系单相共溶剂体系（水-水溶性溶剂均相体系）两相体系（水-水不溶性溶剂两相体系）反相胶束体系低水有机溶剂体系（单相有机溶剂体系）四、有机相的酶反应（四）有机相酶工程的应用手性药物的拆分手性高分子聚合物的制备多肽的合成甾体转化五、突变酶（mutational enzyme）在已知酶的结构与功能的基础上，有目的地改变酶的活性位点或基团，从而产生具有新性状的突变酶。理性分子设计思路：利用定点突变技术有目的地在已知DNA序列中取代、插入或删除特

17、定的核苷酸方法1. 寡核苷酸介导的定点突变：用含有突变碱基的寡核苷酸片段做引物，在体外以原基因序列为模板进行复制，诱变合成少量完整的突变基因，再体内扩增2. 盒式突变：利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。应用1. 提高酶活性及稳定性阐明酶分子中某一基团的功能2. 研究酶的功能基团 酶同源序列的比较选择突变靶标 化学修饰 酶的二、三级结构六、酶分子的定向进化以已知的亲本野生酶为起点，经过随机的基因突变或重组，构建一个包括多种突变酶基因的蛋白酶文库，在此基础上进一步通过定向的选择性筛选，从中获得具有某些定向功能或性状的酶分子非理性分子设计原理：人为模拟自然进

18、化机制，利用分子生物学手段结合灵敏的筛选技术，获得具有某些预期特征的进化酶。方法1. 随机突变易错PCR：通过改变PCR的反应条件使碱基一定程度上随机错配，导致目的基因随机突变，构建突变库，筛选突变体。2. 同源改组有性PCR：亲本基因群中的优化突变3. 非同源改组渐进切割杂合酶技术：用核酸外切酶对两个亲本基因分别进行消化，再将两组片段化基因互相连接方法4. 结构域改组利用内含子之间的重组使独立的外显子组装成编码新蛋白质的基因5. 其他技术酶法体外随机-定位诱变技术酵母细胞重组增强组合文库技术筛选策略底物显色反应改变培养条件利用蛋白固有性质高通量筛选 固相筛选 放射性染料筛选 荧光筛选 ELI

19、SA 七、酶分子的化学修饰限制药用酶临床应用的因素：对生产条件的要求高具有一定免疫原性受体内蛋白酶水解影响理化和生物稳定性差酶分子修饰的种类1. 金属离子置换修饰2. 酶分子的化学修饰3. 酶分子的物理修饰1. 酶的表面化学修饰（1）大分子结合修饰（2）侧链基团修饰2. 酶分子内部修饰（1）肽链有限水解修饰（2）核苷酸链剪切修饰（3）氨基酸置换修饰（4）核苷酸置换修饰酶分子的化学修饰大分子修饰酶的应用 PEG-超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD） PEG-溶血类蛋白质（链激酶Streptokinase, SK;尿激酶urokinase, UK等） PEG-天门冬

20、酰胺酶（Asparaginase, ASNase） 消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期 用Dextran修饰-淀粉酶，-淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶：提高了酶的热稳定性。第四节 酶工程技术在制药工业中的应用酶工程制药优点 工艺简单、效率高、生产成本低。 环境污染小、产品收率高、纯度好。一、在生物转化中的应用二、在药用酶生产中的应用6-氨基青霉烷酸 （6-APA）：青霉素G水解除去侧链后的产物，也称无侧链青霉素。生产半合成青霉素的最基本原料。 （一）在抗生素工业中的应用例：固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸青霉素酰化酶：用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变pH等条件，既可催化生成6-APA，也可

21、催化6-APA与其他的羧酸衍生物进反应合成具有不同侧链基团的青霉素固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸 技术路线固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸 斜面 细胞 固定化细胞 青霉素G 转化液 滤液 6-APA 粗品培养固定转化过滤抽提填充床反应器pH 7.5-7.8 40明胶包埋法氨基酸：用于医药、食品以及农业。合适比例的混合液可直接注入体内补充营养，氨基酸作为增味剂，可增加香味促进食欲，还可作为饲料，还可用于制造人造纤维、塑料等。（二）在氨基酸工业中的应用例：固定化酶法生产L-氨基酸氨基酸类的分类1蛋白质氨基酸：编码氨基酸非蛋白氨基酸：D型氨基酸、-氨基酸、-氨基酸等

22、2衍生氨基酸：谷氨酰胺、硫酸甘氨酸、磷葡精氨酸等 34必需氨基酸：赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸等8种 非必需氨基酸及半必需氨基酸 5（二）固定化酶法生产L-氨基酸氨基酰化酶：世界上第一种工业化生产的固定化酶，可以用于生产各种L-氨基酸药物。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸。用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸，生产成本仅为用游离酶生产成本的60左右。固定化酶法生产L-氨基酸固定化酶法生产L-氨基酸 R-CH-COOH R-C

23、H-COOH DL- NH-CO-R + H2O L- NH2 R-CH-COOH D- NH-CO-R氨基酰化酶 两种产物的溶解度不同，很容易分离。 未水解的N-酰化-D-氨基酸经过外消旋作用后又成为DL型，可再次进行拆分。泵储罐反应产物离心机消旋反应器晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala酶法生产L-Ala结 构分子量等电点性 质溶解性L-AspL-Ala 酸性氨基酸中性氨基酸溶于水和盐酸，不溶于乙醇和乙醚在水中有一定溶解性，不溶于丙酮及乙醚例：L-天冬氨酸和L-丙氨酸的生产（1） L-天冬氨酸和L-丙氨酸的性质+CO2天冬氨酸酶L-Asp脱羧酶（2）酶转化反应（延胡索酸）+NH3（L-丙氨酸）（L-天冬氨酸）（3）工艺路线固定化L-Asp脱羧酶转化液B延胡索酸+ NH3固定化天冬氨酸酶转化液AL-Asp粗品L-Asp精品L-Ala粗品L-Ala精品泵储罐反应产物离心机母液回收固定化酶柱子晶体 L-AspL-Asp延