分子生物学技术在AML规范化诊断中的价值课件

1、分子生物学技术在AML规范化诊断中的价值陈 苏 宁苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所急性白血病的分型AML的诊断技术及进展AML的细胞和分子遗传学异常AML的微小残留病检测2011年美国发病率和死亡率最高的10种肿瘤类型CA Cancer J Clin 2011CA Cancer J Clin 20112011年美国血液肿瘤预期发病率和死亡率发病率：淋巴瘤(NHLHL)白血病(CLLAMLALLCML)MM死亡率：白血病(AMLCLLALLCML)淋巴瘤(NHLHL)MM2007年美国各年龄和性别组报告死亡数排名前五位的 肿瘤类型CA Cancer J Clin 2010中国白血病发病率白血

2、病发病率:2.1-6.9/10万AML(1.85/10万)ALL (0.69/10万)CML(0.36/10万) CLL(0.05/10万)日本白血病发病率2001年全国白血病中心AML(1.2-2.9/10万)ALL (0.5-1.5/10万)CML(0.3-1.1/10万) CLL(0.1-0.8/10万)1827年， 法国的Alfred Velpeau 描述第一例白血病1847 年，Virchow首次提出了“白血病”这个名称1976年，法、美、英3国7位血液学家以光镜下的形态为主，参照细胞化学染色，制定了FAB分型标准，标志着现代白血病诊断与分型的开端 80年代末至90年代初，随着免疫学

3、、细胞遗传学和分子生物学理论和技术的发展，出现了MICM（形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学）分型WHO造血和淋巴组织肿瘤分类方案（2001， 2008）FAB分型及WHO分类FAB：主要建立在形态学基础上WHO (2001和2008)骨髓或外周血原始细胞比例20%将一些有明确诊断及预后指导意义的细胞或分子遗传学异常作为诊断和分型的重要标志将患者诊断之前的疾病状态和治疗措施纳入考量FAB和WHO分类方案的主要区别急性白血病的WHO分型急性髓细胞白血病（AML）和相关肿瘤 系列不明的急性白血病（ ALAL)前体淋巴肿瘤B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤急性髓细胞白血病（AM

4、L）和相关肿瘤 伴再现性遗传学异常的AML伴MDS相关改变的AML 继发于MDS或MDS/MPN伴有MDS相关细胞遗传学异常2或3系50%以上的细胞有发育异常治疗相关性AML 不另作分类的AML髓细胞肉瘤Downs综合征相关髓系增生疾病母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤伴再现性遗传学异常的AMLAML with t(8;21)(q22;q22)RUNX1-RUNX1T1AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)CBFB-MYH11APL with t(15;17)(q22;q12)PML-RARAAML with t(9;11)(p22;q23)MLLT3-MLLA

5、ML with t(6;9)(p23;q34)DEK-NUP214AML with inv(3)(q21q26.2) or t(3;3)RPN1-EVI1AML -M7 with t(1;22)(p13;q13)RBM15-MKL1? AML with mutated NPM1? AML with mutated CEBPA通常AML的诊断标准，原始细胞比例20%，但如果t(8;21)、t(15;17)或inv(16)阳性，则不论原始细胞比例为多少，AML诊断成立急性髓细胞白血病微分化型 (M0)急性髓细胞白血病未成熟型 (M1)急性髓细胞白血病成熟型 (M2)急性粒单核细胞白血病(M4)急性

6、单核细胞白血病(M5)急性红白血病 (M6)急性巨核细胞白血病(M7)急性嗜碱粒细胞白血病(ABL)急性全髓增殖性疾病伴骨髓纤维化不另作分类的AML急性白血病的WHO分型急性髓细胞白血病（AML）和相关肿瘤 系列不明的急性白血病（ ALAL)前体淋巴细胞肿瘤B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤急性白血病的WHO分型急性髓细胞白血病（AML）和相关肿瘤 系列不明的急性白血病（ ALAL)前体淋巴细胞肿瘤B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤T淋巴母细胞白血病/淋巴瘤B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤无法分类的B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤伴有再现性遗传学异常的B淋巴母细胞白血病/淋巴瘤t(9;22)(q

7、34;q11) BCR/ABLt(v;11q23)如t(4;11) 如MLL/AF4t(12;21(p12;q32)TEL/AML1t(1;19)(q23;p13) E2A/PBX1t(5;14)(q31;q32)IL3-IGH超二倍体核型亚二倍体核型T 淋巴母细胞白血病/淋巴瘤骨髓淋巴母细胞20%且无髓外肿块，如伴有t(12;21)、 t(1;19)等 B淋巴母细胞白血病特征性的细胞遗传学异常，可诊断为B淋巴母细胞白血病急性白血病的分型AML的诊断技术及进展AML的细胞和分子遗传学异常AML的微小残留病检测急性白血病的诊断和分型依赖于多种检测方法的联合使用形态学：外周血片、骨髓（涂片活检）细

8、胞化学染色免疫表型检测：多参数流式细胞仪细胞遗传学检测常规核型分析FISH、CGH、SKY、染色体涂染分子遗传学检测融合基因检测（RT-PCR）：PML-RARA、AML1-ETO、CBFB-MYH11、MLL-、BCR-ABL基因突变：FLT3-ITD、CEBPA、NPM、TET2、IDH1、NOTCH1、IKZF1、FBXW7拷贝数变化（CNV）:array-CGH、SNP-array高通量测序技术1950196019701980199020002010确定染色体数目=46发现Ph；发现+21各种显带技术出现；发现多数AL患者伴有染色体异常FISH出现；阐明某些染色体异常的分子学改变SKY

9、CGHPCR技术FLT3-ITD(1996)c-KIT突变（1993）.芯片技术：cDNA arrayArray-CGH、SNP-array、测序技术的发展大量基因突变的发现：JAK2、NPM、CEBPA、PAX5、IKZF1、FLT3、RUNX1、WT1、RAS、NOTCH1.新一代高通量测序技术；各种遗传学改变间的相互作用白血病遗传学研究的历史G 带labeldenatureXXXXXXdenatured chromosomesAnneal/hybDNARP11-438N5G248P8432B2der(X)normal(11)WCP3WCP5FISH-2p,-3p,+3q23-q29 (3

10、q25),-4,+5,-7p15-p22,+7p11.2,-8p,-8q11.2-q21.2,+8q21.3-q23,-8q24,-10,-12p,+12p11,-14q24-q32,-15,-16p,-19Chromosomal CGH69-71,XXYY,+1,del(1)(p11),del(2)(p?),der(3)t(3;11)(p24;?),-4,-4,+6, +der(7)t(7;10)ins(10;8)(q22;?),-8,-8, ins(10;8)(q22;?),-10,+11,der(12)t(8;12)(?;p13)t(8;12)(?;?),der(14)t(3;14)(?

11、;q21),-16,+17,+18,-19cp5 SKYOligosArray Oligos on glassOligo array-CGH分辨率高，可发现5kb的CNV样本要求量小：0.5ug费用更低AgilentNimbleGen不能检测单亲二倍体（UPD）、LOH不能检测平衡性染色体重排APL：STAT5B-RARAT-ALL患者：UTX 缺失SNP-array分辨率高，Affymetrix、Illumina可检出CNV、单亲二倍体、LOH，可推算样本嵌合度del(11)(p13p13):33.86Mb-36Mb Removal of NRE LMO2 activationtelcene

12、1e3-4e2e5e6LMO2NREproximal promoterdistal promoterbreakpoint测序技术的快速发展带来价格的下降19902001200720102012摩尔定律13年，30亿美元已经进入数千美元测一个全基因组的时代5色的MFC可部分弥补这一缺陷LAIP在疾病发展过程中可发生转化，导致假阴性，应用多种抗体组合可减少假阴性一、免疫标志二、染色体易位和融合基因三、基因突变四、异常表达的AML相关基因AML患者的MRD检测标志AML常见染色体异常t(8;21)10%t(15;17)8%inv(16)/t(16;16)5-10%11q23异常3-5%3045205

13、单一异常：45%2种异常：55%-5/5q-；-7/7q-；8；-Y；+11；+13；+21; +223q26； del(9q)t(6;9)； t(9;22)等伴再现性遗传学异常的AMLAML with t(8;21)(q22;q22)RUNX1-RUNX1T1AML with inv(16)(p13.1q22) or t(16;16)CBFB-MYH11APL with t(15;17)(q22;q12)PML-RARAAML with t(9;11)(p22;q23)MLLT3-MLLAML with t(6;9)(p23;q34)DEK-NUP214AML with inv(3)(q21

14、q26.2) or t(3;3)RPN1-EVI1AML -M7 with t(1;22)(p13;q13)RBM15-MKL1? AML with mutated NPM1? AML with mutated CEBPA一、免疫标志二、染色体易位和融合基因三、基因突变四、异常表达的AML相关基因AML患者的MRD检测标志发生率高在病程中稳定存在突变集中于热点部位目前以NPM1基因A型突变最为常用基因突变在MRD检测中应用的要求PHF6基因突变类型AML患者常见基因突变及其预后意义NPM1基因突变类型一、免疫标志二、染色体易位和融合基因三、基因突变四、异常表达的AML相关基因AML患者的MRD

15、检测标志异常表达的AML相关基因及其预后意义MRD的概念及其检测技术AML患者的MRD检测标志AML患者MRD检测的临床意义一、FCM检测LAIP二、RQ-PCR检测遗传学标志AML患者MRD检测的临床意义美国西雅图移植中心99例CR1接受同胞相合或无关供体HSCT的AML患者移植前采用10色MFC检测骨髓标本MRD水平75例患者未检出MRD，24例患者检出不同程度MRD0.1%：14例评估移植前MRD水平对预后的影响HSCT前MRD水平对AML患者预后的影响J Clin Oncol 2011; 29(11):1190-1197.2年总生存率：移植前MRD阴性患者显著高于阳性患者（76.6%

16、vs 30.2%）2年复发率：移植前MRD阴性患者显著低于阳性患者（17.6% vs 64.9%）移植前MRD水平有助于提示移植预后J Clin Oncol 2011; 29(11):1190-1197.荷兰、英国多中心协作组，94例儿童AML患者68%的患者可检出2个以上LAIP，26%的患者可检出1个LAIP，6%的患者无LAIPFCM检测LAIP在儿童AML患者中的应用Leukemia (2010) 24, 15991606随着巩固治疗的进行，MRD的水平呈逐渐降低的趋势Leukemia (2010) 24, 15991606诱导化疗后MRD水平可作为判断患者预后的独立因素，不同组别3年

17、无病生存期或总生存期有显著差异Leukemia (2010) 24, 15991606一、FCM检测LAIP二、RQ-PCR检测遗传学标志一项406例APL的动态RQ-PCR检测结果显示，MRD持续阳性或由阴性转为阳性为APL复发的指证RQ-PCR检测PML-RARA基因的敏感性为10-3-10-5，分子复发患者PML-RARA基因的上升速度约为1 log/月PB和BM的对照试验显示，BM检测的敏感性约为PB的1.5倍每隔3个月进行BM的PML-RARA检测是理想的MRD检测策略，可提前发现复发迹象，并尽早砷剂治疗，防止血液学复发RQ-PCR检测PML-RARA融合基因J Clin Oncol

18、 2009; 27:36503658.MRC AML-15方案对APL患者每隔3个月进行BM的PML-RARA检测，发现复发迹象后给予砷剂治疗，白血病复发率明显低于未常规进行MRD检测的AML 12方案组J Clin Oncol 2009; 27:36503658.RQ-PCR检测PML-RARA融合基因可早期提示APL复发J Clin Oncol 2009; 27:3650-3658.动态RQ-PCR检测结果显示，AML1-ETO、CBFB-MYH11融合基因的表达水平与复发密切相关经过巩固治疗后，在长期缓解的核心结合因子白血病患者中，常可检测到低水平的融合基因转录以104个ABL1基因拷贝

19、作为内参照， AML1-ETO融合基因低于10-12个拷贝预示患者可达长期缓解RQ-PCR检测AML1-ETO、CBFB-MYH11对早期发现AML复发的意义Blood 2010; 115:453-474不同遗传学背景的AML细胞，其克隆增殖速度和分子水平复发的变化存在较大差异Ommen HB等采用RQ-PCR技术对74例伴有分子标志（PML-RARA、AML1-ETO、CBFB-MYH11融合基因和NPM1突变）的复发AML患者进行MRD动态监测CBFB-MYH11阳性克隆的倍增时间明显长于其他克隆AML分子水平复发的动态差异Blood 2010; 115:453-474Ommen, H.

20、B. et al. Blood 2010;115:198-205RQ-PCR检测显示，AML1-ETO、CBFB-MYH11、PML-RARA、NPM突变等分子标志在血液学复发前可观察到逐渐升高的趋势， CBFB-MYH11白血病克隆的倍增时间（36天）长于AML1-ETO（14天）、PML-RARA（12天）、NPM突变（11天）由于CBFB-MYH11相关白血病复发时白血病细胞增殖缓慢，有学者认为PB检测MRD足以提早发现复发迹象，并及时进行干预近期的一项研究对53例AML1-ETO相关白血病患者进行了长期随访，结果显示巩固治疗期间及治疗完成后一年内，每3个月1次MRD检测足以早期鉴别出复

21、发患者Blood 2010;115:198-205J Clin Oncol. 2010 Aug 10;28(23):3724-9.AML1-ETO、CBFB-MYH11、PML-RARA等特异性的融合基因是最理想的MRD检测标志RQ-PCR技术是检测上述标志的理想手段WT1是常用于AML患者MRD检测的泛白血病标志有关WT1是否是可行MRD标志仍存在不一致的结论J Clin Oncol 2008; 26: 5429-35J Clin Oncol 2008; 26: 4595-602Blood 2009; 113: 4505-11引起争议的部分原因是不同的引物设计方案6.8%的AML存在WT1基

22、因突变，且集中于3端，若将探针设计于WT1基因3端，可能导致假阴性结果WT1基因作为MRD标志的价值Current Opinion in Oncology 2010, 22:656663Cilloni等通过系统性的分析和评估，最终选定于WT1基因的5端设计引物，并对正常外周血、骨髓和白血病患者样本中WT1的表达进行了大样本的研究504例AML患者的RQ-PCR检测结果显示，由于PB和BM的WT1基因表达背景较高，因此WT1基因作为MRD标志的敏感性并不高WT1基因更适合作为诱导化疗后早期评价的指标，作为长期微量MRD动态检测的准确性有限Current Opinion in Oncology 2010, 22:656663J Cl