重组DNA技术1概述ppt课件

1、 DNA重组技术概述天津科技大学：罗学刚 第一节 DNA的重组 DNA Recombination基因表达的分子生物学根底一个典型的原核细胞基因构造表示图原核细胞的基因是由成百上千个核苷酸对组成的。组成基因的核苷酸序列可以分为不同区段。在基因表达的过程中，不同区段所起的作用并不一样。有的区段可以转录为相应的信使RNA，进而指点蛋白质的合成，也就是说可以编码蛋白质的区段叫做编码区。有的区段不能转录为信使RNA，也就是说不能编码蛋白质的区段叫做非编码区。一个典型的真核细胞基因构造表示图真核细胞的基因是由编码区和非编码区两部分组成的。在非编码区上，同样有调控作用的核苷酸序列，但是真核细胞的基因构造要

2、比原核细胞的基因构造复杂。与原核细胞比较，真核细胞基因构造的主要特点是：编码区是间隔的、不延续的。也就是说，可以编码蛋白质的序列被不可以编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的方式。其中，可以编码蛋白质的序列叫做外显子，普通不可以编码蛋白质的序列叫做内含子。53加强子CAAT框TATA框转录起始点外显子1外显子2外显子3内含子1内含子2AATAAA转录终止点真核细胞基因构造表示图启动子：主要包括两个序列1在5端转录起始点上游约2030个核苷酸处有TATA框，它是一个短的核苷酸序列，是启动子中的一个顺序，它是RNA聚合酶的重要接触点，能使酶准确识别转录的起始点并开场转录。当TATA框中的碱基顺序

3、有所改动时，mRNA的转录就会从不正常的位置开场。53加强子CAAT框TATA框转录起始点外显子1外显子2外显子3内含子1内含子2AATAAA转录终止点真核细胞基因构造表示图启动子：主要包括两个序列2在5端转录起始点上游约7080个核苷酸的地方，有CAAT框，是启动子中另一个短的核苷酸序列，是RNA聚合酶的另一个结合点，它的作用还不一定，普通以为它控制着转录的起始频率，而不影响转录的起始点。当框中的碱基顺序改动后，mRNA的构成量会明显减少。53加强子CAAT框TATA框转录起始点外显子1外显子2外显子3内含子1内含子2AATAAA转录终止点真核细胞基因构造表示图加强子：在5端转录起始点上游约

4、100个核苷酸以远处的位置，能使转录活性加强上百倍。终止子：在3端终止密码的下游有一个核苷酸顺序为AATAAA，AATAAA顺序和下游的反向反复顺序合称为终止子，是转录终止的信号。终止子的特殊碱基陈列顺序可以妨碍RNA聚合酶的挪动，并使其从DNA模板链上脱离下来。反向反复顺序AUUU5533ATT AAAGGCTCC TTTT GGAGCCTTT TTTTTTAA TTTCCGAGG AAAA CCTCGGAAA AAAAA模板链转录UUUUCCCCCGGGGG35UUUUUAAAUUAU某基因终止子的反向反复顺序与发卡构造的构成图解DNA重组包括：同源重组细菌的基因转移与重组位点特异重组转座

5、重组接协作用转化作用转导作用发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称根本重组。是最根本的DNA重组方式，经过链的断裂和再衔接，在两个DNA分子同源序列间进展单链或双链片段的交换。 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组受体四、转座重组 由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座transposition。 第二节 重组DNA技术 DNA Recombination Technique基因工程诞生的历史背景： 1973年是基因工程诞生的元年。1. 1944年Oswald T.Avery等的肺炎球菌

6、转化证明了DNA是遗传信息携带者。2. 1953年James Watson和Francis Crick 两人提出了DNA构造的双螺旋模型，提示了遗传物质自我复制的机制。3. 1961-1965年,科学家破译了生物界全部64个遗传密码,发表了划时代的遗传密码字典，提出了遗传信息由DNARNA蛋白质传送的中心法那么。4. 1970年发现了反转录酶，丰富了中心法那么，为cDNA的制备奠定了根底。5. 染色体外DNA质粒的深化研讨，为第一批重组DNA载体提供了资料。6. 1968-1970年，限制性内切酶的发现和纯化，为DNA的体外重组提供了有力的工具。7. 1972年，Berg.D等人初次用限制性内

7、切酶EcoRI切割噬菌体和SV40病毒DNA分子，将这两种不同来源的DNA片段胜利地在体外衔接成杂合DNA分子。 至此，用重组DNA技术改动生物学性状的尝试在1973年由Cohen等人完成。从此，这项技术为生物学带来了一场深化的革命，这类技术本身也迅速地开展起来，并广泛地浸透到各个学科的研讨领域。 一、重组DNA技术相关概念 一DNA克隆 克隆clone 来自同一始祖的一样副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化cloning,即无性繁衍。技术程度： 分子克隆molecular clone 即DNA克隆 细胞克隆 个体克隆动物或植物内切核酸酶内切核酸酶，维持细菌遗传性状的稳定。限制性内

8、切核酸酶或DNA结合蛋白所特异识别、结合的DNA位点的核苷酸序列，呈二元旋转对称，通常将这种特殊的构造顺序称为回文构造palindrome。 识别序列可以是四核苷酸、六核苷酸或八核苷酸；产生的切口可以是粘性末端、平头或钝性末端、配伍末端。 。 (三)目的基因 目的基因：用来扩增作研讨或消费某一种蛋白质的基因。就是在重组DNA时，人们感兴趣的基因或DNA序列，又称目的DNA(target DNA)。 类型： cDNA(complementary DNA)：指经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA，经聚合可合成双链cDNA。 基因组DNA(genetic DNA)：指代表一个细胞或生物体整套遗传

9、信息(染色体及线粒体)的一切DNA序列。大容量载体 柯斯质粒载体 酵母人工染色体载体质粒DNA的提取及鉴定 1收获细菌2碱裂解法小量抽提质粒1将细菌沉淀上述步骤3所得重悬于100l预冷的溶液50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA中，猛烈振荡。2加200l新配制的溶液0.2mol/l NaOH, 1%SDS，缓和振荡，水浴5min。3加150l预冷溶液50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml，缓和振荡，冰浴5min。44以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。5可作不可作：加等量饱和酚，氯仿

10、，振荡混匀6用2倍体积无水乙醇室温沉淀DNA，室温放置2min。74以12000g离心5min。8小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。9用75%乙醇于4洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。10加50l的1TE含20g/ml无DNA酶的胰RNA酶，振荡，储存于-20。聚合酶链反响PCRPolymerase Chain Reaction根本原理： 变性、 退火、 延伸感受态细胞：指具备接受外源DNA才干的宿主细胞导入大肠杆菌1. 氯化钙转化法2. 电击法3. 体外包装感染法导入哺乳动物细胞1. 显微注射法2. 电穿孔法3. DNA-磷酸钙共沉淀4. DEAE-葡聚糖转

11、染法5. 病毒感染法6. 脂质体介导法7. 细胞交融法8. 原生质体交融法9. 微细胞介导法大肠杆菌感受态的制备 1接种单菌落于2ml LB培育液中， 37过夜。2取0.25ml过夜菌入25ml LB培育液中，37振摇46h至A590=0.40.6。3倒入50ml管内，水浴10min，以25003000rpm离心5min，弃上清。4缓慢参与75mmol/L预冷CaCl2 5ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。5缓慢参与75mmol/L预冷CaCl2 1.0ml悄然混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200l，冰浴12h。重组DNA的转化 1将3只Eppendorf管按以下组作好标志，然后按下述进展：转化组：受体菌重组DNA阴性对照组：受体菌阳性对照组：受体菌阳性DNA 2冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。34290s。437水浴5min。5参与无相应抗生素的Lb 200l，混匀后，37水浴3060min。6分别取3组反响物各50l在含相应抗生素的固体LB培育基平皿上涂布，室温下枯燥，然后倒置于37温箱中培育过夜。(五)重组体的挑选 直接选择法1. 抗药性选择2. 标志补救3. 分子杂交法间接挑选法 核酸程度*1. 酶切图谱