苛养菌及少见菌分离培养与鉴定

1、1苛养菌及少见菌分离培养与鉴定苛养菌是指对营养要求苛刻，在普通培养 基上不生长或难以生长的一类细菌；体外 培养需添加特殊因子或其它营养成分。苛养菌的分离鉴定是衡 量一个细菌室技术水平 的重要标志。苛养菌肺炎链球菌卡他莫拉菌流感嗜血杆菌淋病奈瑟菌（一）肺炎链球菌来源肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）简 称肺炎球菌（pneumococcus）。1881年首次由 巴斯德（Louis Pasteur）及G. M. Sternberg分别 在法国及美国从患者痰液中分离出。为革兰染色 阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌， 5%10%正常人上呼吸道中携 带此菌。肺炎链

2、球菌(Streptococcus pneumoconia， SP) 是儿童和成人肺炎的重要病原菌之一，存在于正 常人口腔、鼻咽部，在机体抵抗力下降时致病。 它引起肺炎、中耳炎、乳突炎、鼻窦炎、细菌性 脑膜炎、败血症等疾病，尤其对婴幼儿构成严重 威胁。临床意义易感人群任何人，皆可被肺炎链球菌感染，但以下3类人士特别容易受到侵袭：65岁以上人士；5岁以下儿童，特别是2岁以下的幼童；高危人群，如长期病患者等。以年龄层论，受肺炎链球菌侵袭，引致侵犯性肺炎链球菌疾病的最高危 者，是5岁以下的小儿，特别是2岁以下的幼童。一旦受到侵袭，死亡率最 高的是年长的老人家及有长期病患的高危人群。中国2011年妇幼卫

3、生事业发展报告指出，肺炎位列中国五岁以下儿童 死因的第二位，在重症肺炎中，约有50%是由肺炎链球菌引起的。肺炎链 球菌不仅是小儿肺炎的主要“元凶”，也是引起肺炎死亡的重要病原。婴 儿从6月龄起母传抗体逐渐消失，因此6月龄到2岁是儿童侵袭性肺炎链球 菌性疾病发病率最高的时期。肺炎链球菌的荚膜在细菌的侵袭力上起主要作用，有荚膜 的SP有毒力，失去荚膜则独力减低或丧失。还可产生溶血 素、紫斑产生因子、杀细胞素、皮肤致死毒素等。根据肺炎链球菌荚膜多糖抗原的不同可分为90个血清型，与疾病相关的血清型分布随时间、地点、年龄不同而变化。致病力标本来源痰肺泡灌洗液脓液耳分泌物外阴分泌物胸腔积液脑脊液血液等标本

4、应采用从深部咳出，选择铁锈色部分或脓性分泌物痰。培养基血琼脂平板：胰大豆蛋白胨琼脂或哥 伦比亚琼脂加5%绵羊血；加庆大霉素的血琼脂平板：在普通血 琼脂中加入抑制剂庆大霉素注射液，混 匀倾倒平板，琼脂中庆大霉素最后浓度 相当于1.25 mg/250mL。标本接种及培养条件用鼻咽拭子采取患者鼻咽分泌物、痰、咽 拭子、肺泡灌洗液等呼吸道标本接种庆大 霉素血平板或普通血平板，置于35， 510% CO 2 温箱培养 18-24血液、脑脊液标本等无菌体液标本可直接 采用血培养瓶进行培养。典型的肺炎链球菌菌落细小、圆形、呈脐 窝状、较湿润、边缘整齐，直径0.5 1.5mm的菌落。不典型的肺炎链球菌菌落有水

5、滴样，菌落 较大，边缘不整齐；还有细小、似草绿色 链球菌但较湿润的菌落也需注意。菌落特点粘液型脐窝状细菌染色形态革兰氏染色阳性，呈矛头状，成双或链状 列，有荚膜；在痰标本中大多数成双排列。鉴别要点Optochin敏感胆汁溶菌荚膜肿胀试验菊糖分解试验阳性Optochin(OP)敏感试验挑取被检菌，密涂于血平板上，贴上 含 5 g/ 片 的 Optochin 纸 片 ， 置 510%CO2 的大气中（或烛缸），35孵育过夜。抑菌环直径=14mm为敏感， 推断为肺炎链球菌。抑菌环直径14mm 时参照胆汁溶菌试验。胆汁溶菌试验（1）试管法 取新鲜培养物分装于两支试管内（每支1ml）， 其中一支加入10

6、%的去氧胆酸钠溶液0.1ml或纯牛胆汁0.2ml， 另一支加入无菌盐水两滴（对照），15min后，阳性者细菌 被溶解，试管内液体呈透明状，阴性者无变化。（2）平皿法 加一滴10%的去氧胆酸钠溶液或纯牛胆汁于被 检菌菌苔上，15min后，阳性者细菌菌苔被溶解，阴性者无 变化。试验应有已知肺炎链球菌作阳性对照。荚膜肿胀试验取一滴抗血清与一滴菌悬液混匀，加少量 美蓝液混合后加盖片，室温1020min后， 用油镜检查，如查到菌体呈兰色，周围绕 有界限明显未染色的膨大空白圈为阳性。可用于肺炎链球菌的分型。（二）流感嗜血杆菌临床意义流感嗜血杆菌常寄生在人的咽喉及口腔粘 膜，少见于消化道和生殖道，在呼吸道定

7、植者 可达人群的50%。当机体 抵抗力下降时引起疾 病。可随血液入侵组织内部，引起脑膜炎、关 节脓肿和其它部位化脓性感染。标本接种处理痰、咽拭子、血、分泌物、脑脊液等标本 划线接种于流感嗜血杆菌选择性培养基， 放入5CO2培养箱 3537孵育1824h, 菌落细小，可延长培养时间至48小时。与临床有关的有9个：流感嗜血杆菌副流感嗜血杆菌溶血嗜血杆菌副溶血嗜血杆菌杜克雷嗜血杆菌埃及嗜血杆菌嗜沫嗜血杆菌副嗜沫嗜血杆菌迟缓嗜血杆菌代表菌：流感嗜血杆菌培养特性营养要求比较特别，需要、因子存在及 5 10%的CO2气体，最适生长温度37。培养基采用哥伦比亚琼脂加5%马血或兔血制成巧 克力琼脂，加入去甲万

8、古霉素注射液或杆菌肽作 为抑制剂，终浓度分别为6mg/300mL 、 76mg/250mL。用绵羊血做巧克力时，需加入添加剂（OXOID公 司产品，剂量按产品说明书）。培养特性需氧菌培养较为困难培养基中需加入血液， 提供X、V因子X因子血红素V因子辅酶I或辅酶II510%的CO2流感嗜血杆菌的纯培养形态在巧克力平板上形成 微小、无色透明、呈 露滴样小菌落。48h 后可形成灰白色、较 大菌落。革兰染色形态特征流感嗜血杆菌为革兰氏阴 性细小杆菌，从病灶中分 离的菌株多呈球杆状或双 球状，有时可呈短链；在 陈旧培养物中成多形态性， 有长杆状和丝状；无芽孢、 无鞭毛。鉴定方法卫星试验X、V因子需求试验

9、卫星试验原理有溶血性的细菌在羊血琼脂培养基上生长时可破坏红细胞释 放出血红素(即X因子)和维生素B类物质(即V因子)，从而促进了 流感嗜血杆菌的生长；金黄色葡萄球菌在生长过程中能合成V因 子释放于培养基中，当嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌一起培养时， V因子会促进嗜血杆菌的生长，出现靠近葡萄球菌菌落的嗜血杆菌菌落较大，而远 离葡萄球菌菌落的嗜血杆菌菌落较小的现 象称为“卫星现象”；在不含血红素琼脂 平板上进行的卫星试验，称为“琼脂卫星 试验”。X、V因子需求试验取无色透明，边缘整齐，露滴状菌落在哥伦比亚 琼脂平板上均匀密划线，在划线上贴X、 V因子纸 片，两纸片间距为2022mm。经 510%的CO

10、2培养箱， 3537孵育1824h，在 两纸片中央出现细小菌落生长现象为阳性。嗜血杆菌属主要菌种X因子V因子溶 血CO2触酶G+C(mol%)+（+）+39393942384041+DD4041菌名流感嗜血杆菌埃及嗜血杆菌溶血嗜血杆菌嗜沫嗜血杆菌*杜克雷嗜血副溶血嗜血杆菌副流感嗜血杆菌副嗜沫嗜血杆菌+42 *常见在次代培养不需要血红素; D.不同结果.生化反应氧化酶试验阳性，分解葡萄糖，不分解蔗 糖和乳糖，触酶和硝酸盐还原试验均为阳 性。有荚膜的菌株能产生吲哚，无荚膜菌 株则不行致病性致病物质为内毒素、荚膜、菌毛和酶类通过呼吸道感染，引起原发性或继发性感染原发性感染多由b型荚膜强毒株引起，为急

11、性化脓感染，如脑 膜炎、鼻咽炎、咽喉会厌炎、化脓性关节炎、心包炎等继发性感染主要在流感、麻疹、百日咳、肺结核等后发生， 多为无荚膜菌株引起。如慢性支气管炎、鼻窦炎等（三）卡他莫拉菌卡他莫拉菌（M.catarrhalis）原属奈瑟菌属，1970年 分类为布兰汉菌(Branhamella)，1984年（伯杰分类细菌 学手册）列为莫拉菌属(Moraxella)的一个亚属（Subgenus Branhamella）。该菌寄居于人类的鼻烟部， 也可引起人类多种感染。如急性中耳炎、上颌窦炎和下呼 吸道感染，也可引起脑膜炎、心内膜炎、尿道炎，婴儿和 儿童眼结膜炎、角膜炎和败血症等。该菌产生 -内酰胺酶的菌株

12、渐多，为临床治疗带来一定困难。临床意义培养特点本菌生长不需要特殊营养条件，需氧，在血平板、巧 克力平板及营养琼脂平板上均能生长。在510%CO2环境 中，35培养过夜，可形成直径13mm的菌落。菌落圆 形、凸起、无色、不溶血，推刮易碎不沾环，用接种环刮取的菌苔可呈淡奶色，在盐水中 不易乳化。有些菌株在初分离时， 菌落可微微凹陷在琼脂中。革兰染色形态特征本菌为革兰阴性球菌，直径 0.61.0m，无芽孢、无鞭毛， 呈单或成双存在，成双时，两 菌相对呈肾形。生化反应特点本菌不分解碳水化合物，硝酸盐还原试 验阳性，氧化酶及触酶试验均阳性，DNA 酶和乙酰脂酶阳性。DNA酶试验鉴别方法乙酰脂酶试验DNA

13、酶试验挑取可疑菌落，涂抹接种于DNA琼脂平板上(涂 抹菌斑直径5-10mm)，以金黄色葡萄球菌ATCC 25923作为阳性对照，放入35孵箱培养24-48h 后，于DNA琼脂上加1N HCL溶液1-2ml(铺满琼脂 表面)，10分钟后观察结果：菌斑周围或菌斑下(刮去菌 斑)出现无色透明区即为 DNA酶阳性。乙酰脂酶试验用无菌生理盐水将3-乙酰吲哚纸片沾湿， 取待检菌落涂在纸片上，3分钟内出现蓝绿 色为阳性反应。以卡他莫拉菌ATCC 25238， 全国临检中心质控菌株9602、9707、0101作为阳性对照。少见菌44棒状杆菌属棒杆菌属的细菌为革兰阳性直或微弯曲的杆菌， 纵边不平行，有的末端略膨

14、大呈棒形。棒杆菌常成对并排，V形，栅栏状或呈簇状排列， 细胞很少着色不均，不分枝，无抗酸性。通常细胞内有异染颗粒，与医学相关的种均无动 力。培养特性棒杆菌需氧或兼性厌氧，杰氏棒杆菌不 能在厌氧条件下生长。与医学相关的棒杆菌均可在含有5的羊血琼脂平 板上良好生长。最适生长温度为3537。不能 在麦康凯琼脂上生长。45棒状杆菌属杰氏棒杆菌革兰染色接近棒杆菌血平皿菌落46棒状杆菌属以下情况分离到棒杆菌更具有临床意义：多份标本部分离到同样的棒杆菌。标本直接涂片革兰染色镜下见到棒杆菌，并观察到强 烈的白细胞反应。从同一标本中分离到的其他细菌的致病性低。以下情况下分离到的棒杆菌需要鉴定到种的水平：从无菌的

15、体液标本中分离出的捧杆菌(多份标本中只 有一份为阳性时除外)。严格按操作规程采集的标本中分离出的棒杆菌，而且 是优势菌时。从尿标本分离出单一的棒杆菌，细菌计数大于104CFU/ml，或是优势菌细菌计十数大于105CFU/ml时。47单核细胞增生李斯特菌李斯特菌为革兰阳性短杆菌，不分枝，无芽胞， 长0 5-2um，宽0.4-0.5um，菌体细胞呈单个 或短链状，培养时间延 长或粗糙型培养物可 呈丝状菌体(6-20um)。有1-5根周鞭毛， 在室温下运动活泼，在35 时失去动力或运动非常缓慢，此特 征可作为 初步判定。李斯特菌为兼性厌氧菌，在含5羊，马兔血 的胰大豆胨琼脂平皿上生长良好。最适生长温

16、 度为30-37能在4下缓慢生长。48单核细胞增生李斯特菌单核细胞增生李斯特菌伊氏李斯特菌49单核细胞增生李斯特菌CAMP实验是鉴定单核细 胞增生李斯特菌及其他李 斯特菌的重要试验之一。 本菌CAMP试验的加强溶 血区不是箭头状而是长方 形。用马红球菌做CAMP试验 时单核细胞增生李斯特菌 呈阴性或弱阳性，伊氏李 斯特菌为阳性。50诺卡菌属革兰氏染色：革兰氏阳性或不定，无芽孢和鞭毛。菌体呈多向的分枝丝状，直径0.5-1.2 m。 培养早期可见丰富的菌丝体，常有次级分枝。培养后期菌体裂解为球形或杆状。星形奴卡菌巴西奴卡菌星形奴卡菌51星形奴卡菌 24 h星形奴卡菌 72 h诺卡菌属52改良抗酸染

17、色为弱阳性（1%硫酸水溶液），呈不均匀性，易被脱色呈阴性。奴卡菌星形奴卡菌星形奴卡菌诺卡菌属53痰标本直接涂片革兰氏染色可见典型的分枝菌丝，菌丝呈90 分枝角。有时 不易着色或不均匀。痰涂片 菌丝呈90 分枝痰涂片 菌丝团痰涂片 着色不均诺卡菌属54组织中细菌易聚集形成团块或微粒，在脓性分泌物中肉眼可见“硫磺颗粒”痰涂片 弱抗酸染色血培养涂片 革兰氏染色诺卡菌属55诺卡菌属星形诺卡菌培养2d56属间鉴定诺卡菌属于其他需氧放线菌属如链霉菌属、拟诺卡菌属、红球菌属、马杜拉放 线菌属以及棒状杆菌等形态形似的革兰氏阳性杆菌的属间鉴定：与链霉菌属、放线菌属和拟诺卡菌属的鉴别四者镜下形态均为分枝丝状，但诺

18、卡菌属改良抗酸染色弱阳性，后者阴性。革兰氏染色菌丝与孢子链诺卡菌属57白色链霉菌拟诺卡菌 MHA，9d，气生菌丝诺卡菌属58与红球菌属的鉴别两者均可呈现弱抗酸性，但马红球菌不产生气生菌丝。马红球菌 48h 粘液型马红球菌 SBA 粗糙型诺卡菌属59马红球菌 24h 弱抗酸马红球菌 5d 革兰氏染色诺卡菌属60与棒状杆菌的鉴别棒状杆菌不形成菌丝，菌体呈栅栏状排列。诺卡菌属61诺卡菌属临床意义：诺卡菌在自然界分布广泛，多为腐生寄生菌，与人类关系最大的 是星形诺卡菌复合体（星形、鼻疽和新星，引起90%的非皮肤部 位感染）；巴西诺卡菌（热带的足分枝菌病和非热带肺部感染， CNS），多为外源性感染足分枝

19、菌病：巴西诺卡菌，热带地区，可通过损伤的皮肤侵犯皮 下组织，产生慢性化脓样肉芽肿，表现为脓肿及多发性瘘管，好 发于足和腿部。孢子丝菌病：星形诺卡菌，皮肤淋巴肺部-吸入性：星形诺卡菌，慢性，X光显示渗入性结节，空洞， 多结节，类似结核病。星形诺卡菌肺炎患者的痰标本呈肺结核样 乳酪样痰。播散性：由肺部感染引起，90%为星形诺卡菌，CNS占40%，脓 肿或肉芽肿；其他部位：眼，肾，关节，心脏。62诺卡菌属鉴定要点：弱抗酸染色（改良抗酸染色）必须标准化。 涂片染色与分离培养必须结合取长补短。加强与临床沟通使检验结果转化为临床治疗 更能及时有效。63形态学检查在细菌鉴定中的关键作用菌体形态观察通过观察菌

20、体形态 为鉴别细菌提供手段 细菌菌体形态结合 菌落形态特征可对细菌进行鉴别。例如，在选择性巧克力平 板（加万古霉素）上生长的草绿色溶血菌落，是乳杆菌还是 肠球菌（VRE）只要涂片镜检就很容易区分；鲍曼不动杆与 克雷白菌属细菌的菌落形态相似，区别在于前者为革兰阴性 球杆菌（接近球菌），后者为革兰阴性杆菌；丹毒丝菌在血 平板上的菌落形态与草绿色链球菌很相像，但镜下形态差别 很大。64形态学检查在细菌鉴定中的关键作用肺炎克雷伯菌拉丝现象诺卡菌65形态学检查在细菌鉴定中的关键作用菌体特殊结构的观察荚膜 荚膜是某些细菌在细胞壁外包裹的一层粘液性物质， 不同的细菌其荚膜成分也有一定差异，一般由多糖、多 肽或蛋白质组成。荚膜作为细菌的毒力因子有必要对其 染色