单基因遗传病的遗传方式课件

1、Diagnosis of Single-gene disorders 单基因遗传病的诊断由于单个基因突变引起的遗传病称为单基因遗传病。(single-gene disorders)这些突变的基因就是致病基因。 (diseases causing gene) 目前，已发现的单基因性状或遗传病的种类已超过10,000种。OMIM Statistics for January 15, 2007Number of EntriesAutosomalX-LinkedY-LinkedMitochondrialTotal*Gene with known sequence10636495483711216+Ge

2、ne with known sequence and phenotype3533200385#Phenotype description,molecular basis known18461672262041%Mendelian phenotype or locus, molecular basis unknown1411135401551Other, mainly phenotypes with suspected mendelian basis2016144202162Total16262881566317355单基因遗传病的诊断一、家系分析方法（一）常用系谱符号（二）单基因遗传病的遗传方

3、式（三）遗传方式的判断二、基因诊断技术 (一）分子杂交技术（二）PCR技术（三）PCR-SSCP技术（四）DNA测序技术（五）生物信息学技术（DNA芯片技术）单基因遗传病的诊断一、家系分析方法（一）常用系谱符号（二）单基因遗传病的遗传方式（三）遗传方式的判断（二）单基因遗传的方式1、常染色体显性遗传(Autosomal Dominant Inheritance) AD2、常染色体隐性遗传(Autosomal Recessive Inheritance) AR3、X伴性显性遗传 (X-linked Dominant Inheritance) XD4、X伴性隐性遗传(X-linked Recess

4、ive Inheritance) XR5、Y伴性遗传Y-linked inheritance1、常染色体显性遗传(AD)例1：Huntington舞蹈病大脑基底神经节变性导致进行性加重的不自主舞蹈样动作，进行性加重的智能障碍，痴呆。致病基因定位于4p16.3(CAG)n 正常人 n=11-34 患者 n=42-66返回例2：Marfan综合征纤维蛋白原的缺陷引起骨骼、心血管、眼的症状。致病基因定位于15q14-q21,FBN1基因长约110kb,65个外显子返回AD遗传模式系谱遗传特点：每一代均有患者，在连续世代中呈垂直分布；遗传与性别无关，男女受累机会均等，有父传子现象；患者父母中必有一方是

5、患者；两种关键的婚配提示或排除AD遗传（1）双亲是患者，出生正常孩子，提示为AD遗传；（2）双亲均正常，出生患儿，排除AD遗传。例1：囊性纤维化（cystic fibrosis,CF） 主要累及器官是胰腺和肺破坏胰腺外分泌功能累及支气管腺体，导致慢性支气管炎及肺部感染合并肺气肿胆道系统阻塞引起胆汁性肝硬化累及肠道腺体时出现胎粪性肠梗阻2、常染色体隐性遗传(AR)例2：白化症(Albinism)皮肤白皙毛发色浅羞明返回例3：早老症(progeny)呈侏儒状呈老年人的面容提前发生动脉硬化智力发育延迟例4：软骨发育不全症II型(Grebe-Quelce-Salgado软骨发育不全,Grebe型,巴西

6、型)主要累及四肢骨骼短肢侏儒,前臂和小腿显著缩短,小腿尤甚指(趾)端呈球状突起AR遗传模式系谱 遗传特点：遗传与性别无关，男女均可得病；一般不会每代出现患者，患者可在同胞间呈水平分布；患者父母往往是表现型正常的杂合子，在这种情况下，每胎再显危险率是1/4；近亲婚配出生患儿的机会高于随机婚配。3、X-伴性显性遗传(XD)例：低磷酸盐血症(抗维生素D佝偻病)身材矮小可伴有佝偻病或骨质疏松症的各种表现XD遗传模式系谱遗传特点：每一代均有患者，在连续世代中呈垂直分布；患者父母中必有一方是患者；女性患者多于男性患者；男性患者其女儿全部有病,儿子全部正常女性患者其女儿和儿子均有1/2机会得病。4、X-伴性

7、隐性遗传(XR)例：假肥大型进行性肌营养不良(Duchenne型进行性肌营养不良)进行性加重的肌肉萎缩和无力通常儿童期发病,首发症状通常是腰带肌肉无力,走路缓慢无力特征性的Gower征假性肥大性肌营养不良XR模式家系遗传特点：呈隔代遗传和斜行分布（男性患者不育的只呈斜行分布）；患者多为男性，其双亲表型正常，但母亲必为隐性致病基因携带者；在父为患者，母为携带者时，子女有1/2机会得病。5、Y伴性遗传 目前已知Y伴性遗传 （Y-linked inheritance)性状和遗传病只有27种。为全男遗传。（三）遗传方式的判断显性遗传具有以下二个特点：（1）每一代都有患者，或者说，患者在家系里呈垂直分布

8、；（2）患者的双亲一般来说至少有一个是患者。而隐性遗传一般不具备这二个特点，接下来在显性遗传中再区分AD还是XD就不难了。主要看男性患者的子代，若男性患者的子代中女儿全部得病而儿子全部正常，则可考虑XD, 若男性患者的子代中男女均可得病，无明显的性别差异，则可考虑AD。 （三）遗传方式的判断若明显不符合显性遗传的特点，则可考虑是隐性遗传，在隐性遗传中要区分AR还是XR也并不十分困难，一般来说，XR有隔代遗传（外祖父和外孙均为患者）和斜行分布（舅甥均为患者）的特点，而且男性患者明显地多于女性患者。而AR则与性别无关，也没有明显的隔代遗传和斜行分布的特点，据此，我们可把AR和XR区分开来。请写出下

9、列家系最可能的遗传方式，理由是什么？ 请写出下列家系最可能的遗传方式，理由是什么？请写出下列家系最可能的遗传方式，理由是什么？请写出下列家系最可能的遗传方式，理由是什么？请写出下列家系最可能的遗传方式，理由是什么？请写出下列家系最可能的遗传方式，理由是什么？二、基因诊断技术 (一）分子杂交技术（二）PCR技术（三）PCR-SSCP技术（四）DNA测序技术（五）生物信息学技术（DNA芯片技术）（一）分子杂交技术核酸分子杂交核酸分子杂交是指不同来源的两条互补核酸单链，在一定条件下形成双链分子的过程。核酸分子杂交发生在两条DNA单链之间者称为DNA杂交；发生于RNA链和DNA单链之间的称为RNA：D

10、NA杂交。无论是DNA杂交还是DNA/RNA杂交都涉及到两种不同来源的核酸分子：一是用来检测特定核酸的探针，另一是待测核酸分子。变性与复性探针（probe）是一个DNA或RNA片段，可用某种方法标记，用于杂交检测另外的DNA（RNA）序列。探针可以是单链或双链分子，但杂交时必须是单链形式。1、DNA探针：DNA探针可以来自DNA克隆或体外扩增产生，通常是双链。通常在体外采用DNA合成方式进行标记。2、RNA探针：RNA探针可从DNA克隆中通过体外转录制备。在RNA合成过程中加入标记物就可以使探针进行标记。3、寡核苷酸探针：用化学合成法制成的短单链DNA片段。一般长15-50个核苷酸。通常采用末

11、端标记方法标记。1.斑点印迹杂交（dot hybridization） 检测重组体克隆的斑点杂交技术斑点印迹杂交2. Southern杂交检测DNASouthern杂交检测DNA（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片Southern 印迹杂交技术应用实践1、对未知突变的基因进行检测的方法限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)根据以上杂交结果，可以得知个体1的基因型为AA，个体2的基因型为Aa，个体3为aa，个体1和2的表现型正常，但2为携带者，个体

12、3的表现型为地中海贫血患者。 14kb10kb个体1个体2个体3Southern印迹杂交方法应用地中海贫血患者是由于基因缺失所致，如果用基因为探针，在正常个体的可以检测到14kb的BamHI片段，如果缺失一个基因，则检测到10kb的BamHI片段。如下图：DNA分析Huntington舞蹈病症状前诊断指在遗传病的临床症状出现前所作的诊断。有些常染色体显性遗传病的杂合子个体发病时往往已经生儿育女，如能在可疑杂合子个体生育之前就作出诊断，就能避免影响子代。1、家系调查和系谱分析2、DNA分析2、对已知突变的基因进行检测的方法等位基因特异的寡核苷酸探针（allele specific oligonu

13、cleotides， ASO ）该方法是根据正常序列和突变序列各设计一个骑跨突变位点的寡核苷酸探针，一般为15-30个碱基，两探针的区别仅在于突变碱基的不同，用以检测正常等位基因的探针称为正常等位基因特异探针，用以检测突变等位基因的探针称为突变等位基因特异探针。只能用来检测已知突变。 根据以上杂交结果，可以判断出各个体的基因型：个体1和2的基因型为Aa，表现型为患者；个体3和6的基因型aa，表现型为正常；个体4和5的基因型为AA，表现型为患者。 个体1个体2个体3个体4个体5个体6正常等位基因探针突变等位基因探针一对夫妻已生育一个苯丙酮尿症患儿及一个正常孩子，现又已怀孕，要求作产前诊断，家系成

14、员及胎儿羊水细胞DNA用内切酶EcoR I和BamH I消化，结果如下： （二）PCR技术PCR原理1）对靶DNA序列进行选择性扩增，需要合成两个寡核苷酸引物（primer）。引物可特异地在靶DNA两侧区互补结合，决定PCR扩增的特异性，即扩增片段的长度；2）必需具有DNA前身物，即4种三磷酸脱氧核苷：dATP，dCTP，dGTP 和dTTP，以按53方向合成新DNA链；3）PCR是链式反应，以新链为模板，在含有一定离子（如Mg2+）浓度的反应缓冲液体系中，在有耐热的DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）的作用下进行反复周期地DNA扩增；4）每一周期经过变性（人基因组DNA大约93-95），复

15、性（大约50-70）和延伸（大约70-75）三个阶段产生倍增DNA。反复n个周期，理论上可扩增2n倍，一般大约在30-40周期的扩增后，可获百万倍以上的靶DNA。 DNA扩增PCR反应温度（）时间（min）94726094变性（1min）60 退火（1min）72 延伸（1.5min）循环1 循环2 循环3PCR反应的温度循环周期PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94变性1min， 60 退火1min， 72 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。Reaction Condition

16、for a Typical PCR AssayPCR反应系统的组成1、PCR缓冲液（PCR Buffer）Mg2+浓度：Mg2+的最佳浓度为1.5mmol/L(当各种dNTP浓度为200mmol/L时)，Mg2+过量易生成非特异性扩增产物，Mg2+不足易使产量降低。（样品中存在的较高浓度的螯合剂如EDTA或高浓度带负电荷的离子基团如磷酸根，会与Mg2+结合而降低Mg2+有效浓度。因此，用作模板的DNA应溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中）。二甲基亚砜（DMSO）PCR时加入10%DMSO有利于减少DNA的二级结构，使（G+C）%含量高的模板易于完

17、全变性，在反应体系中加入DMSO使PCR产物直接测序更易进行，但超过10%时会抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多数并不使用DMSO。2、四种脱氧三磷酸核苷酸（4dNTPs）： 50200mol/L，四种 dNTP的浓度应相同3、引物的量： 0.11mol/L4、Taq DNA聚合酶的量： 14U/100l5、模板影响PCR的几个因素1、温度循环参数 a模板变性温度 b. 引物退火温度:Ta = Tm - 5= 4(G+C)+ 2(A+T) -5 c. 引物延伸温度:取决于Taq DNA聚合酶的最适温度 d. 循环次数2、引物设计 a. 最佳长度为2024个核苷酸 b. 引物的（G+C）

18、%含量组成应均匀 c. 引物内部应避免内部形成明显的次级结构 d. 两个引物之间不应发生互补3、DNA聚合酶4、影响PCR特异性的因素5、扩增S型曲线平台期PCR技术的种类1、强化PCR2、膜结合PCR3、锚定PCR4、错配PCR5、原位PCR6、标记PCR和彩色PCR7、反向PCR8、不对称PCR9、增效PCR10、定量PCR11、重组PCR（三）PCR-SSCP技术单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，当有一个碱基发生改变时，其构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移速度不同。SSCP可与PCR结合，用来检测未知突变，尤其是一个或几个碱基的突变或缺失。 2.

19、 单链构象多态Single strand conformational polymorphism，SSCP（四）DNA测序技术DNA测序测定PCR产物或DNA克隆片段的精确核苷酸序列。常用方法： Sanger双脱氧链终止法Sanger双脱氧链终止法原理加入特殊核苷酸底物双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），与普通dNTP不同，在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基，不能形成磷酸二酯键。例如，存在ddCTP、和四种dNTP（其中一种为-32P标记）的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成以ddC残基为3端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为

20、新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。采用类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3端结尾的三组长短不一的片段。将制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。A G T C A G T C A G T C A G T C A G T C A G T CDNA测序仪的发展平板凝胶电泳 毛细管电泳Simple Gel LoadingLong ReadIR DNA SequencerGene R

21、eadIR DNA Analysis SystemBIOTECHNOLOGY DIVISIONAB 公司DNA分析仪大家族 平板凝胶电泳式：377-36,377-96 毛细管电泳式： 310,3100和 3700，3730XLABI PRISM377 DNA SequencerABI PRISM 377 测序仪ABI PRISM 310 遗传分析仪ABI PRISM 3100 遗传分析仪ABI PRISM 3700 遗传分析仪ABI PRISM 3730 遗传分析仪（五）生物信息学技术（DNA芯片技术）（五）生物信息学技术（DNA芯片技术）应用实践基因测序特定序列的DNA与特定长度寡核苷酸重叠

22、区域来测定精确度达99%应用实践基因表达水平的检测以不同颜色的荧光素标记反转录产物，然后分别与基因芯片杂交应用实践基因诊断血友病珠蛋白生成障碍性贫血异常血红蛋白病苯丙酮尿症肿瘤P53-肿瘤早期诊断BRCA1-乳腺癌应用实践新药筛选能进行大规模的筛选：1、从基因水平解释药物的作用机制2、分析用药前后不同组织器官基因的表达差异3、根据基因的表达情况从众多的药物成分中筛选到起作用的部分物质应用实践临床用药利用基因芯片技术对患者先进行检测，再开处方 - 个体化治疗，对症下药Diagnostic Technique of Polygenic Disorders 多基因遗传病诊断技术多基因病的诊断技术一、

23、多基因遗传病概述二、侯选基因法研究技术三、全基因组扫描技术一、概述：（一）二种性状1、质量性状(qualitative characters)交替性状，特征性状，不连续，有或无例如：单基因遗传病2、数量性状(quantitative characters)连续性状例如：多基因遗传病（二）影响多基因遗传的因素1、遗传因素2、环境因素（三）基因特点1、等显性(co-dominant)2、微效基因(minor gene)3、累加效应(additive effect)4、主基因(major gene) BRCA1 BRCA2（四）涉及的疾病种类1、先天畸形 唇裂、腭裂、无脑儿.2、常见病 高血压、糖尿

24、病、哮喘、 精分症、冠心病、消化性溃疡.3、肿瘤 胃癌、肝癌、乳腺癌.单侧唇裂双侧唇裂、腭裂先天性脊柱裂无脑儿1、患者亲属的发病率同他的亲缘级数成反比。（五）多基因遗传病的遗传特点2、多基因遗传病患者一级亲属复发风险大致是群体发病率的开方。3、一个家庭中患者越多，亲属复发风险也越高。例：唇裂、腭裂父母正常：第一胎发病风险为群体发病（0.17%)第一胎为患儿，第二胎风险为4%第一、第二胎均为患儿，第三胎风险为10% 4、多基因病患者的病情越重，亲属中再发风险率越高。例：先天畸形患儿严重程度 同胞复发风险单侧唇裂，无腭裂 2.46%单侧唇裂 + 腭裂 4.2%双侧唇裂 + 腭裂 5.6%5、多基因

25、病的发病存在两性差异时，发病阈值较高的性别对子代的影响大。例：先天性幽门狭窄 发病率 儿子 女儿男性 0.5% 5.5% 2.4% 女性 0.1% 9.4% 7.3%6.多基因遗传病在随机人群中的发病率通常为0.11%，患者一级亲属发病率为1%10%，后者远低于单基因病的风险。7.近亲婚配比随机婚配时，出生多基因病患儿的风险要高。8. 单卵双生一致率并非100%，二卵双生一致率远低于25%或50%。二、候选基因法（一）基础理论将可能与某个多基因遗传病相关的一组已知基因作为侯选基因，通过家系调查 和连锁分析，找出易感基因。策略：确定待研究的侯选基因 通过连锁分析，确定该侯选基因座位是否与某个多基

26、因遗传病相连锁 比较变异体在疾病人群与正常人群之间的差异，确定相关基因二、侯选基因法（二）技术方法与评价优点：针对性强、方法简单缺点：选择对象时存在盲目性，易遗漏重要的基因；结果不够精细二、侯选基因法（三）应用实践高血压易感基因的研究血管紧张素原(AGT) 肾素 血管紧张素I ACE 血管紧张素II 通过血管紧张素I 、II受体 调节醛固酮的分泌血压升高二、侯选基因法1、血管紧张素原(AGT)基因位点的突变AGT基因位于1q42-43,5个外显子，4个内含子，有15 种多态性。我国学者报道，原发性高血压组中，血管紧张素原T235等位基因频率明显高于对照组二、侯选基因法2、血管紧张素转化酶(ACE)基因多态性位于17q23，26个外显子，全长21kbD等位基因使血管的ACE水平增加在高血压患者中，ACE-D等位基因频率明显高于对照组。二、侯选基因法3、血管紧张素II(AngII)受体多态性血管紧张素II受体基因AT1R位于3q21-25高血压患者中AT1R基因C1166等位基因的频率明显高于正常者。三、全基因组扫描（一）基础理论人类基因组中存在大量可变数量的高度串联重复序