生物材料：第六章 组织工程

1、第六章 组织工程7/20/20221第一节 组织工程简介7/20/20222一 组织工程学的诞生 外科学已进入了再生医学的新阶段ResectionRepairRepalacementRegeneration外科学发展的四个“R”阶段 Tissue Engineering7/20/20223 组织工程的定义1987年在美国科学基金生物工程小组提出： 应用生命科学与工程学的原理与方法，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下组织机构与功能关系的基础上，通过特定细胞的体外或体内培养形成具有特定功能的组织或器官替代物，可用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的一门学科。7/20/20

2、224组织工程涉及的领域7/20/202251 种子细胞成体干细胞 发育同源细胞 胚胎干细胞 同种异体干细胞 同源双倍体胚胎干细胞系 组织工程的三大关键因素 异种干细胞系7/20/202262 支架材料种子细胞生存和依附的三维支架需有良好的生物相容性和组织相容性具有生物可降解性、可塑性、孔隙率、机械强度足够的表面积容纳细胞及促进细胞生长7/20/202273 组织构建最大限度模拟出组织器官再生的内环境力学因素在组织器官构建中显示出重要作用强调体内构建的重要性与不可替代性7/20/20228 动物体内已成功构建出组织工程化组织与器官In vitro eng-earFemurArticular c

3、artilageMeniscusTrachea TendonTM jointSkinCornea stromaCornea epitheliumVesselNerve7/20/20229第二节 种子细胞简介7/20/202210 种子细胞的研究内容自体、异体、异种组织细胞的分离培养技术，细胞生物学行为，多种细胞的复合培养技术；细胞因子的有序作用、信息传递及其调控；建立实验标准细胞系，改造种子细胞，延长细胞寿命及生存期；改变细胞表面结构，研究细胞粘附及抗粘附力的技术及其影响机制；降低细胞抗原性及增强宿主免疫耐受的方法。7/20/202211干细胞干细胞(stem cell)是指具有无限或较长期的

4、自我更新能力，并能产生至少一种高度分化子代细胞的细胞。在个体发育的不同阶段以及成体的不同组织中均存在着干细胞，只是随着年龄的增长，干细胞的数量逐渐减少，其分化潜能也逐渐变窄。干细胞可作为细胞治疗与组织器官替代治疗的种子细胞。7/20/2022127/20/202213干细胞的分类 胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC) 成体干细胞(somatic stem cell)。 造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、成骨于细、内胚层干细胞、视网膜干细胞及胰腺干细胞等。7/20/202214胚胎干细胞 胚胎干细胞具有发育全能性，在理论上可以诱导分化为机体中所有种类的

5、细胞；胚胎干细胞在体外可以大量扩增、筛选、冻存和复苏而不会丧失其原有的特性。7/20/202215成体干细胞成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。7/20/202216细胞的三维培养 细胞在体内所处的化学和物理环境非常复杂，完全不同于体外普通的单层细胞培养。细胞的三维培养是指细胞在模拟体内细胞的化学、物理和生物学条件下，在三维基质支架中进行培养。 细胞生长、分化及代谢的离体研究模拟，广泛用于组织工程研究中。7/20/202217细胞的复合培养细胞的复合培养是其种子细胞是多种细胞的

6、复合。 复合培养中基质细胞是不可缺少的，主要是疏松结缔组织细胞，在细胞复合培养中充当“饲养”细胞的作用。基质细胞发生增殖、生长及分泌生长因子，形成类似于在体组织的基质成分。复合培养中基质细胞的三维生长保证了种子细胞的活性增殖。7/20/202218应力对细胞生长及功能的影响生物组织和细胞的生长受多种因素的影响，如营养、生长因子、物理和化学环境以及应力和应变等。如果其他条件相同，则应力生长规律将会显露出来。从根本上说，细胞和组织的生长是一种分子水平下的细胞生物学现象。应力和应变使细胞保持某种特殊的形态，由于细胞生长决定于这种形态以及其他因素，因此它也决定于应力和应变。7/20/202219细胞与

7、材料的应力场三维培养体内细胞多在特定的生物力学环境下分裂、增殖，发挥生理功能：不仅需要研究材料进行改性处理，有利于细胞在材料三维空间附着及分裂增殖的机制及方法 更要研究在体外提供相适应的应力环境的方法，研究细胞在不同应力场环境下的形态和功能的改变，对细胞在材料上的粘附力及其影响因素的作用机制。7/20/202220异种细胞对于一些不能通过同种异体或自体来源满足的细胞、组织可采用异种细胞、组织。细胞包裹、免疫保护、体外系统和基因改造技术等方法使异种细胞的应用成为可能，一旦成功则只要通过繁殖动物就可满足需要。7/20/202221异种细胞移植存在的问题非自体细胞移植过程中必然发生不同程度的排斥反应

8、，与器官移植不同，它不具有正常器官的解剖结构，一般不需吻合血管。7/20/202222 第三节 支架材料简介7/20/202223一.前言组织工程学的核心技术是组织或器官的工程化，而支架材料不仅是实现工程化必备条件，而且决定着工程化器官移植后的最终效果，是目前限制组织工程临床应用的一个瓶颈。像更换汽车零件一样更换人体坏旧的器官 人体器官银行7/20/202224如何进行组织工程?基本方法 是将体外培养的高浓度组织细胞，扩增后吸附于一种生物相容性良好、并可被人体逐步降解吸收的细胞外基质(ECM)上，使细胞按预制形态的三维支架生长。然后将这种细胞生物材料复合体植入机体病损部位，在生物支架降解吸收过

9、程中，种植的细胞继续增生繁殖，形成了新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官。7/20/2022257/20/202226组织工程支架材料 的基本功能 为体外构建工程组织或器官提供三维的细胞生长支架，使细胞间形成适宜的空间分布和必要的细胞联系提供特殊的生长和分化信号，诱导细胞的定向分化和维持细胞分化。7/20/202227支架材料基本要求材料的生物相容性 材料的力学性能(力学衰减） 生物降解速度与体内吸收速度 三维空间结构的要求及形成 营养物质的提供 价格问题 7/20/202228组织工程支架材料的改性技术与组织器官结构相匹配的三维结构精密加工技术。 组织工程中转基因技术。 组织工程网络

10、构架的生物活性组装与表面修饰。天然材料与合成材料的有机结合（复合、共混、接枝、嵌段等）技术。 7/20/202229二、支架材料改性的几个热点天然材料的改性调节材料的降解速率支架材料的力学衰减规律调节材料的亲疏水性提高其与细胞的亲和力；引入生长因子的缓释系统 7/20/202230B)交联：碳二亚胺作为交联剂的交联。二乙烯基亚砜碱性交联。戊二醛交联环氧基交联（1）天然材料的改性交联剂的毒性无法避免生长因子无法加入A）复合与共混属于常见方法7/20/202231C)化学修饰 多糖类的酯化反应 高分子互穿网络 分子子组装 表面修饰 SEM micrographs of rat peritoneal

11、 cells adhering to HYAFF 7/20/202232（2）调节材料的降解速率A）影响降解速率的主要因素：组成与结构、断裂键的化学环境、侧链基团、表面积、结晶度和亲/疏水性等。B）细胞的反馈信息与材料设计：利用周围组织和植入细胞对材料的酶解过程，以及材料对细胞再生过程中产生的特异酶的敏感性来设计具有生物活性的可降解材料。过氧化氢对壳聚糖降解性能的影响溶菌酶对壳聚糖分子量的影响7/20/202233（3）调节材料的亲疏水性.细胞很难吸附在材料表面材料表面首先吸附蛋白质，然后细胞吸附材料表面蛋白质的优先吸附是细胞吸附的前提条件7/20/202234一般而言，大多数离子性亲水表面由

12、于粘附蛋白的优先吸附而支持细胞的生长，而非离子亲水表面很少吸附蛋白。因此，可以利用材料表面的不同亲水微区域的分布控制蛋白质的粘附，进而控制细胞的粘附和生长。与细胞表面受体真正起反应的是细胞外基质上320个氨基酸的多肽链。7/20/202235（4）提高与细胞的亲和力生物学因素：细胞代谢状态、细胞膜的荷电性质、细胞膜分子的运动方向、细胞膜的柔韧性等。材料因素：表面的亲疏水性、表面自由能、材料表面的荷电特性、材料的化学性质以及材料的形态结构等。7/20/202236提高细胞亲和力的几种方法提高材料的亲水性：将含OH、COOH、NH2 、多糖、多肽等亲水性基团引入。增加材料表面正电荷密度，如壳聚糖引

13、入材料。在材料中引入细胞特异性的识别的配基，如纤粘连蛋白，层粘连蛋白等引入材料。在材料表面共价连接细胞特异性识别的小分子短肽等。7/20/202237引入生长因子的缓释系统生长因子(GF)的引入是组织工程必不可少的条件，但GF在生理环境下很容易失活，难以直接与材料复合，尤其是合成材料。目前有效的方法之一是将GF与合适的缓释载体结合，在位点控制释放保持其长期活性，防止GF被蛋白酶分解，但是生长因子的固定是否影响活性。7/20/2022387/20/202239 研究表明：当细胞远离血管约200微米以上时，组织的新陈代谢就变得不活跃甚至坏死，主要原因是营养物质和代谢废物的散布受到限制，因此工程化组

14、织的血管化和神经化的问题一直是组织工程研究中的一个重要内容。工程化组织血管化最主要的方法是在材料中复合生长因子(如血管内皮生长因子或神经生长因子)诱导周围血管和神经长入。 7/20/202240三、支架材料三维结构的构建 （一）支架材料的三要素基质外观结构(cmmm尺寸)，决定了工程化组织的形状和大小；基质孔径大小(m 尺寸)，调节细胞的长入和生长；基质的表面化学性质(nm尺寸)：控制着细胞的粘附和诱导细胞的基因表达。 7/20/202241 纤维粘连技术（无规粘合、有序编制） 溶液浇铸-粒子沥滤法 冷冻干燥法 热致相分离 气体发泡法 熔融成型法 烧结微球法 快速成型技术（固体自由模型） 乳液

15、（W/O)冷冻干燥法 溶液冷冻干燥法 水凝胶冷冻干燥法 三维刻蚀技术 熔融堆积成型（二）支架材料的制备方法7/20/202242 Currently Applied Scaffolds Fabrication TechnologiesFabrication technologyMaterial properties for processingAchievable pore size in mPorosityFiber bondingfibers20-10095Solvent casting-particle leachingsoluble30-30090Freeze dryingsolubl

16、e20097Thermally induced phase separationsoluble20097Melt moldingthermoplastic50-50080Supercritical-fluid technologyamorphous10010-30Supercritical-fluid technology/particle leachingamorphousmicropores 50 macropores 400973-D printingsoluble45-150150807/20/202243 不同构建技术优缺点不同构建技术优点缺点纤维粘连技术多孔支架的表面积大、孔与孔之

17、间相互连通性好孔隙率和孔尺寸不易控制,亦不易独立调节。需使用有机溶剂溶液浇铸-粒子沥滤法简单适用性广,孔隙率和孔尺寸易独立调节需使用毒性较大的有机溶剂相分离/冷冻干燥法该技术避免了高温、比表面积大孔尺寸偏小气体发泡法避免使用有机溶剂孔的连通性不好烧结微球法孔连通性好、孔尺寸易调控、力学强度大孔尺寸偏小、孔隙率低快速成型技术（固体自由模型） 三维刻蚀技术 熔融堆积成型成型时间短、利于大规模生产、可制备具有个体特征的多孔支架孔隙率偏低7/20/202244 快速成型技术（固体自由模型）图1 三维刻蚀系统原理图图2 熔融堆积成型原理图图3 采用快速成型技术构建的多孔支架模型图4 采用快速成型技术构建

18、的胶原多孔支架的断面扫描电镜照片（25）7/20/202245超临界CO2法制备多孔支架材料粉末状生物降解材料置于超临界反应装置反应釜中在CO2超临界状态（31.1C，7.8MPa）以上材料溶胀释放CO2后形成多孔材料7/20/202246可以利用的修饰分子很多，如小分子细胞识别多肽序列，糖链团簇、糖酯质等。关键技术是如何将这些基团固定到材料表面，达到生物仿生化的目的。四、材料表面仿生化修饰代谢型组织工程中常将产生细胞因子和激素的细胞以水凝胶固定化，此水凝胶膜起免疫隔离作用，它仅允许细胞的营养物，代谢物及所产生的细胞因子和激素通透，而截留抗体、补体和免疫细胞而起免疫隔离作用。 7/20/202

19、247主要的修饰方法表面拓扑结构的修饰表面接枝技术等离子体表面修饰自组装单分子层修饰7/20/202248光蚀刻在支架材料表面拓扑结构修饰中的应用。准分子激光在材料表面得到微米和亚微米水平的拓扑学结构比光蚀刻有很多优点：1、表面拓扑结构的修饰不加入光蚀刻剂， 能量大，材料表面修饰过程中不产生热量7/20/2022492、表面接枝技术物理法 利用材料表面与小分子之间的电荷作用将小分子引入材料表面。化学法 利用材料表面的活性基团与小分子反应，将小分子共价到材料表面。辐射接枝法 利用高能辐射使材料表面产生活性点，引发单体的接枝聚合。7/20/202250将有生理功能的蛋白质、多肽、酶和细胞生长因子等

20、固定在材料表面，在表面形成一个介导细胞粘附，促进细胞分化，诱导组织再生的过渡层。表面接枝技术研究的热点7/20/2022513、等离子体技术表面改性低温等离子体技术只作用于几百埃以内的表面，对材料本体性质几乎无影响，而且能够处理各种复杂的形状表面。低温等离子体技术有等离子体聚合和等离子体表面处理两种。离子注入改性是将所需的元素或盐在离子气化室中进行气化，通过高频放电使其离子化，以外加电场导出、聚束和加速，使形成高能细小的离子束而打入作为靶的固体材料表层，从而改变表层物理和化学性质的方法。7/20/2022524、自组装单分子层修饰自组装单分子层是分子借助一定的相互作用力，自发吸附在固/液或气/

21、固界面，形成热力学稳定和能量最低的有序膜。自组装形成的有序分子结构对于生物识别和生物反应有以下几个优点：避免引发非特异性反应精确设计表面（原子水平）材料的表面处于稳定的平衡状态制备的方法比较简单由分子自动组装成一定的形状或结构的材料7/20/2022535、纳米材料的应用纳米技术就是研究尺寸在0.1nm100nm之间的物质组成体系的运动规律和相互作用。纳米材料可理解为在三维空间中至少有一维是在0.1nm100nm之间的粒子或由这些粒子作为基本单元而构成的材料。 7/20/202254五. 组织工程支架材料今后主要研究内容天然材料：机械强度的提高、加工性能的改善、潜在的病毒隐患消除。合成材料：增

22、进细胞的识别功能、降低降解产物的毒副作用。调解材料的降解速率、降解速率与支架材料的力学衰减之间的关系。研制可以释放某种化学物质或生长因子到周围组织，进而激活相关的细胞（最终的组织细胞或可以重新分泌生长因子激活组织细胞），能诱导组织再生的新型材料。支架材料的精密加工技术。7/20/202255六、新技术的采用从仿生学的角度制备具有生物活性的支架材料；从分子生物学、细胞学和组织学的角度提出新的合成设计思想和寻找新的合成方法；从组织或个体的特异性角度加强对不同细胞或组织所需材料的筛选工作，找出最优的支架材料和最适的制备方法；加强支架材料制备的规范化、标准化而不因设计者的个人经验不同而产生差异，提高制

23、备过程中机械和电脑控制的程度。 7/20/202256 第四节 支架材料存在的问题7/20/202257组织工程存在的问题1、组织工程刚刚起步，缺乏理论基础。2、种子细胞的研究距组织工程的要求相差甚远。3、组织构建目前临床技术也无法达到人体组织自身的要求。4、支架材料的问题同样很多。7/20/202258支架材料的关键问题之一材料与细胞或组织之间的相互作用机理有待进一步解决7/20/202259支架材料的关键问题之二支架材料的立体结构与天然组织结构相近或相似支架材料天然组织7/20/202260支架材料的关键问题之三材料的降解速率调节和降解产物的毒性问题7/20/202261支架材料的关键问题

24、之四材料的性能无法与生物体内的细胞间质相比 合成材料强度好易加工生物相容性差降解产物有毒难以与生长因子复合生物相容性好降解产物无毒 易于与生长因子复合强度差加工难天然材料 复合杂化材料 取长补短7/20/202262 第五节 常用的几种支架材料7/20/202263天然材料合成材料杂化材料复合材料生物降材料（生物可吸收材料）降解速率可调 降解产物无毒一 支架材料的类型7/20/202264（1）天然材料 甲壳素及其衍生物、胶原、透明质酸、珊瑚等 （2）合成高分子 聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乙丙酯（PCL）、聚酯尿烷、聚醇酸亚胺共聚物聚羟丁酯（PHB）及其共聚物。 （3）天然材料与

25、合成材料的杂化 脱水胶原-聚乳酸杂化、蛋白质合成材料杂化等。（4）有机同无机材料的复合 如羟基磷灰石-甲壳素、羟基磷灰石-聚乳酸的复合等。二、生物可降解材料7/20/2022651聚乳酸（PLA）及其共聚物 早在三十年代曾对PLA做过报道，由于当时所得聚合物分子量较低、机械性能差，几乎没有什么应用价值。其后，R.KKulkarni等人经研究发现，PLA与人体组织有良好的生物相容性、无排异效应等机体反应，其降解产物乳酸可以参与人体内糖类代谢循环，无残留。聚乳酸和聚乙醇酸均已被FDA批准为可用于人体的可降解聚合物材料。 7/20/202266聚乳酸的合成方法Microwave sasasasasa

26、sas 聚乳酸的合成The synthesis of poly(lactide) 热聚合酶聚合金属催化聚合7/20/2022672. 聚乙醇酸（PGA）及其共聚物 PGA也是目前常用的生物材料之一，与PLA同属-聚酯类，合成方法与性能相似。PGA及其共聚物在骨组织工程中应用的主要形式有纤维支架、多孔泡沫以及管状结构等。7/20/2022683聚丁酸（PHB） PHB最早是从细菌中分离出来，随后在诸多细菌，如巨杆菌属、红螺菌属等的胞浆颗粒中均发现行这种聚合物。在人体血液中也少量存在。PHB是由3-羟基丁酸通过酯键链接而成。PHB最早被农业食品组织用作动物饲料，后来人们发现PHB具有压电效应，十分

27、适合作为骨折固定材料，但由于单纯PHB易碎、热不稳定、降解时间长、可塑性和机械差等缺点限制了它的广泛应用。7/20/2022694聚原酸酯（POE） 聚原酸酯为流水性聚合物，在一定条件下其表面与水分子相互作用发生“融饰”过程，使之降解，降解产物无毒、无副作用。Taglorms对4种聚合物纯降解产物引起的细胞毒性进行定量检测，从大到小依次为PLA、PCL、PGA、POE。 POE生物相容性好，通过表面融饰发生降解，不产生碎片，降解早期不产生酸性代谢产物，以后缓慢释放，阳解产物细胞毒性弱。降解时间通过酸性赋形剂来调节。存在亲水性差、降解缓慢等缺点。7/20/2022705聚酸酐（polyanlyd

28、rides） 聚酸酐是由羟酸聚合而成。性质活泼，遇水极不稳定。脂肪族聚酸酐在几天内完全降解，而芳香族聚酸酐则需几年时间才能降解完全。综合两者的特点，通过调整主链中两种单体的组成比例来调控材料的性能和降解速度。毒理学评价表明，聚酸酐的体内生物相容性非常理想，被广泛应用于药物控制体系。7/20/2022717. 天然材料甲壳素及其衍生物胶原透明质酸硫酸软骨素珊瑚异种材料7/20/2022728.无机非金属材料碳酸钙磷酸钙纳米羟基磷灰石脱有机质动物骨7/20/202273三、支架材料的评价1. 安全性评价 对于材料的安全性评价，根据材料的应用范围而有不同的质量标准要求，因而有不同安全性评价程度。 化学性能：pH、重金属、浸出液分析（如残渣、红外、紫外-吸收图谱等）、单体残留量、分子量与分子量分布等。 物理性能：外观、透明度、硬度、强度、伸长率、永久变形等。 生物学测定：浸出液急性安全实验、皮内和眼结膜刺激试验、溶血试验、细胞培养试验、发热性试验、Ames试验等。另做材料或制品短期植入性试验。动物试验，致突变试验，生物老化试验，体内外血液相容性试验。体内降解动力学试验7/20/2022742. 性能要求（1）良好的生物相容（2）良好的生物降解性和生物可吸收性（3）具有三维立体多孔结构（4）可塑性和一定的机械强度（5）良好的材料细胞界面7/20/2022753 .细胞相容性检测细胞