体内分布实验

1、体内分布实验方法取小鼠48只（雌雄各半），随机分为两组，每组24只。给药前禁食12h,自由饮水。用 0.9%氯化钠注射液稀释ITZ市售制剂和ITZ-PM冻干粉至适宜浓度，以尾静脉单剂量给药， 剂量27mg/kg。分别于给药后6、15、30、60、120、240、480、720min取3只小鼠，摘取 眼球采集血样，置2ml肝素化子弹头中，离心（4000rpm、3min）分离血浆。采血后立即断 颈处死，取脑、心、肝、脾、肺、肾组织，以生理盐水冲洗表面后擦干，称重，置10ml采 血管中，于-20C冰箱冷藏备用。血浆处理取血浆150ul，置10ml具塞离心管中，精密加入内标物（10ug/ml）50ul

2、，加1.5mol/l 氢氧化钠溶液50ul，涡旋60s，加叔丁基甲醚2ml，涡旋3min，离心（4000rpm、10min）， 取上层有机层，置2ml离心管，50C真空干燥，精密加入流动相500ul复溶，涡旋60s，离 心（10000rpm、10min），取上清液 200ul 待测。组织处理取各组织，解冻，精密加生理盐水1ml，匀浆，取0.5ml置10ml具塞离心管中，加1.5mol/l 氢氧化钠溶液50ul，涡旋60s，加叔丁基甲醚2ml，涡旋3min，离心（4000rpm、10min）， 取上层有机层，50C真空干燥，精密加入流动相500ul复溶，涡旋60s，离心（10000rpm、 10

3、min），取上清液200ul待测。方法学建立（1）紫外波长的确定：标准储备液100ug/mgITZ流动相溶液，稀释10倍，于200-400nm 波长范围内扫描。（2）色谱条件（参考2010版中国药典）色谱柱：Agela Durashell C18（4.6mmX150mm,5um,100A）；流动相：乙月青-0.02mol/L 四丁基硫酸氢铵溶液（50： 50）；流速：1.0ml/min；检测波长：258nm；柱温：35C；进样 量：20ul。按ITZ峰计理论塔板数不小于3000。（3）专属性试验取空白血浆（至少5只小鼠），按“血浆处理”操作，进样，得空白血浆色谱图；将一 定量标准储备液加入到空

4、白血浆中，同上操作，得对照品色谱图。取空白组织匀浆（至少5只小鼠），按“组织处理”操作，进样，得空白组织色谱图； 将一定量标准储备液加入到空白组织匀浆中，同上操作，得对照品色谱图。要求：ITZ、内标均能与其他杂峰分离良好，内源性物质不干扰ITZ及内标的测定。（4）标曲建立血浆标曲的建立：取离心管分别量取标准储备液（0ul、50ulX 1ug/ml、125ulX 1ug/ml， 250ulX1ug/ml、500ulX1ug/ml 、50ulX50ug/ml、100ulX50ug/ml、500ulX50ug/ml）， 用氮气吹干，加空白血浆150ul，涡旋，配成浓度为0.1、0.25、0.5、1.

5、0、5.0、10.0、50.0ug/ml 的含药血浆样品，按“血浆处理”操作，进样，记录色谱图，以峰面积A对浓度C线性回归 处理。要求：ITZ血浆浓度在0.150.0ug/ml范围内线性关系良好，定量下限为0.1ug/ml。 符合试验要求。组织标曲的建立：取离心管分别量取标准储备液量，用氮气吹干，加组织匀浆0.5ml, 涡旋混匀，配成浓度为0.1、0.5、1.0、10.0、20.0、50.0ug/ml的含药组织样品，按“组 织处理”操作，进样，记录色谱图，以峰面积A对浓度C线性回归处理。要求：ITZ组织浓度在0.150.0ug/ml范围内线性关系良好，定量下限为0.1ug/ml。 符合试验要求

6、。（5）精密度血浆精密度：取“血浆标曲”中低中高三个浓度（0.5、5.0、50.0ug/ml），一天内测定 5次，计算日内精密度；每天测定一次，连续测定5天，计算日间精密度。计算RSD组织精密度：取“组织标曲”中低中高三个浓度（0.5、5.0、50.0ug/ml），一天内测定 5次，计算日内精密度；每天测定一次，连续测定5天，计算日间精密度。计算RSD（6）回收率血浆回收率：取“血浆标曲”中低中高三个浓度（0.5、5.0、50.0ug/ml），进样3次， 代入血浆标曲中计算浓度，求得回收率、RSD。组织回收率：取“组织标曲”中低中高三个浓度（0.5、5.0、50.0ug/ml），进样3次， 代

7、入组织标曲中计算浓度，求得回收率、RSD。数据处理血药浓度，可进行药代动力学程序进行处理，求算药代动力学参数。组织浓度，进行组织分布对比，进行靶向性评价结果与讨论（1）紫外波长的确定：标准储备液100ug/mgITZ流动相溶液，于200-400nm波长范围 内扫描。FIG.1 The UV spectrogram of ITZ 1-209.6nm； 2-223nm.2； 3-258.6nm 选取258nm作为检测波长。色谱条件参考2010版中国药典，具体如下色谱柱：Agela Durashell C18(4.6mmX150mm,5um,100A)；流动相：乙月青-0.02mol/L 四丁基硫酸

8、氢铵溶液(50： 50)；流速：1.0ml/min；检测波长：258nm；柱温：35C；进样 量：20ul。按ITZ峰计理论塔板数不小于3000。专属性试验取空白血浆(至少5只小鼠)，按“血浆处理”操作，进样，得空白血浆色谱图；将一 定量标准储备液加入到空白血浆中，同上操作，得对照品色谱图。取空白组织匀浆(至少5只小鼠)，按“组织处理”操作，进样，得空白组织色谱图； 将一定量标准储备液加入到空白组织匀浆中，同上操作，得对照品色谱图。要求：ITZ、内标均能与其他杂峰分离良好，内源性物质不干扰ITZ及内标的测定。标曲建立血浆标曲的建立：取离心管分别量取标准储备液(0ul、50ulX 1ug/ml、

9、125ulX 1ug/ml， 250ulX1ug/ml、500ulX1ug/ml 、50ulX50ug/ml、100ulX50ug/ml、500ulX50ug/ml)， 用氮气吹干，加空白血浆150ul，涡旋，配成浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0ug/ml 的含药血浆样品，按“血浆处理”操作，进样，记录色谱图，以峰面积A对浓度C线性回归 处理。要求：ITZ血浆浓度在0.150.0ug/ml范围内线性关系良好，定量下限为0.1ug/ml。 符合试验要求。组织标曲的建立：取离心管分别量取标准储备液量，用氮气吹干，加组织匀浆0.5ml, 涡旋混匀，配成浓度为0.1、

10、0.5、1.0、10.0、20.0、50.0ug/ml的含药组织样品，按“组 织处理”操作，进样，记录色谱图，以峰面积A对浓度C线性回归处理。要求：ITZ组织浓度在0.150.0ug/ml范围内线性关系良好，定量下限为0.1ug/ml。 符合试验要求。（5）精密度血浆精密度：取“血浆标曲”中低中高三个浓度（0.5、5.0、50.0ug/ml），一天内测定 5次，计算日内精密度；每天测定一次，连续测定5天，计算日间精密度。计算RSD组织精密度：取“组织标曲”中低中高三个浓度（0.5、5.0、50.0ug/ml），一天内测定 5次，计算日内精密度；每天测定一次，连续测定5天，计算日间精密度。计算RSD（6）回收率血浆回收率：取“血浆标曲”中低中高三个浓度（0.5、5.0、50.