脂肪酶产生菌Aspergillus-sp.G55基因工程菌构建及筛选课件

1、脂肪酶产生菌Aspergillus sp.G55基因工程菌构建及筛选2第一部分 引言 脂肪酶又称甘油酯水解酶（lipases，EC 3.1.1.3）是一种生物代谢产物，可以催化脂肪水解为甘油和脂肪酸的酶。主要来源有：动物、植物和微生物来源的脂肪酶，而工业上更多的是通过微生物发酵制备脂肪酶，本项目所涉及菌种为黑曲霉菌种（Aspergillus niger.）Lets Start!图1 脂肪酶结构 (a) M933601；(b) PLRP2脂肪酶定义及来源食品饲料添加洗涤剂制革造纸医药工业绿色保护FDA认定GRAS国标GB/T23535生物修复石油和化工行业洗涤添加酶制剂“芭格美”产品制革脱脂，造

2、纸脱墨干预脂肪代谢深圳市科技计划资助合同 深圳技师学院自2013年11月年承担深圳市科技计划资助项目，项目编号：CXZZ20130425111508558，获得政府无偿资助100万元本项目以产学研合作方式，通过我院与深圳市绿微康生物工程有限公司合作完成本项目为我院深圳技师工作站(绿微康)项目项目研究内容及预期目标摘自深圳市战略新兴产业发展专项资金项目合同书主要研究内容：（1）采用分子生物学方法构建黑曲霉基因工程菌种（2）应用微生物育种技术获得高产、稳定新菌种（3）优化发酵工艺，提高菌种产酶活性（4）运用发酵过程控制技术，完成中试试验（5）新菌种工业化放大及推广应用考核项技术指标（1）模型建立及

3、工业育种建立选育模型建立高通量筛选模型基因工程改造菌种构建新的工程菌株1-3株常规选育得到1-3株优良菌种（2）摇瓶技术指标摇瓶产酶量 18 % （3）发酵罐技术指标发酵罐体积100 L自控罐放罐体积 75 %发酵周期48-52小时发酵批数连续3批发酵罐产酶量20%（比较对照菌）脂肪酶活性 2300 U/ml（4）脂肪酶耐温性能最适温度 50 （5）发表论文和申报专利发表论文3篇 申报专利*1项 （6）人才建设带2名学生 *：深发改 20131450号 附件1 序号39要求申请专利1项7第二部分 研究结果1. 基因工程菌株的构建1.1重组Aspergillus niger T6菌株构建华根霉脂

4、肪酶基因RCL 为模板，构建表达载体；通过根癌农杆菌介导转化黑曲霉菌，得到黑曲霉转化子以华根霉脂肪酶基因RCL 为模板，利用引物Pgpd-F/ Pgpd-R扩增Pgpd；片段经Sal I/Pme I消化克隆至pCHAMBIA2302位点。以质粒pAN7-1为模板，以TtrpC-F/ TtrpC-R为引物扩增；以pMD18-T:RCL为模板，以RCL-F/RCL-R为引物扩增RCL；然后以RCL-F/TtrpC-R为引物，利用重叠延伸PCR，构建出RCL-TtrpC；消化后克隆至pCHAMBIA2302；构建pCHAMBIA2302:Pgpd-RCL-TtrpC质粒黑曲霉受体菌株为CICC 24

5、75，利用冻融法将表达载体转化根癌农杆菌EHA105，介导并转化黑曲霉菌，得到T6菌株酶活性71 U/mL 图1 RCL超表达载体的构建图2 黑曲霉转化子鉴定菌号诱变方法酶活性（ s，n=9） / U/mL变异系数（Cv）/ %比较 / %13-2-41（s）UV1655 113.26.845.413-5-349（s）NTG1624 131.78.113.413-18-46S2137 87.34.0936.114-1-3HeV2024 75.23.7228.914-2-783(s)UV + NTG2119 140.76.6434.914-13-57UV2250 96.84.3043.314-5

6、-11S2387 76.33.2052.0G577S2417 51.02.1153.9G55（s）起始菌株1570 63.44.04-表1 G55菌株诱变选育结果2. 高产脂肪酶菌株筛选研究2.1菌株选育研究以G55为出发菌种进行选育，得到两株高产菌株14-5-11和G577，菌株产酶活性和遗传稳定性都显著提高针对于Aspergillus niger G55菌株，运用微生物诱变筛选的等经过诱变，使菌株发生变异，菌落形态显著变小，发酵液颜色趋向浅黄色3.高产脂肪酶菌株摇瓶发酵工艺研究3.1菌株摇瓶发酵培养基研究主要考察了碳源成分、氮源成分、油脂和无机盐等影响脂肪酶发酵的主要因素，并采用RSM之B

7、BD方法优化3.2菌株摇瓶发酵培养条件研究主要考察了接种量、摇瓶装量、发酵培养温度和发酵培养时间等，并采用RSM之BBD方法优化采用Design-Expert软件的Box-Behnken Design (BBD) 模型拟合和数据分析，进行3因素3水平共17组的试验设计，通过试验数据拟合响应面模型，通过ANOVA分析得到二次多项式Ycoded = 2071.8 + 97.00A + 114.25B + 76.50C - 103.75AB - 43.25AC + 16.25BC - A2 - 227.03B2 - 76.02C2采用BBD模型，得到4因素3水平共29组的试验设计。试验得到的数据在

8、，对数据进行拟合和分析，通过ANOVA分析得到二次多项式Ycoded=2085.8 + 70.67 A + 33.75 B + 63.92 C + 83.33 D - 43.25 AB + 10.5 AC - 77.25 AD - 54.75BC - 19.75 BD - 54.5 CD - 100.15 A2 - 26.53 B2 - 75.02 C2 - 77.9 D2培养基优化培养条件优化培养基脂肪酶活性（ s） / U/mL123平均值RSM2174 462161 542177 392171 41（+ 16.4%）*基础1863 271835 301896 621865 45表3 验证

9、性试验结果 *：t-test检验差异显著；P 0.01培养条件脂肪酶活性（ s） / U/mL 123平均值RSM2160 28.32116 40.02112 42.82129 39.9（+ 16.7 %）*基础1842 62.01844 24.71788 22.31828 44.8表4 验证性试验结果 *：t-test检验差异显著；P 0.01图3 因素交互作用对于脂肪酶活性的响应面分析图4 因素交互作用对于脂肪酶活性的响应面分析4 . 新菌种500 L发酵罐中试研究4.1发酵罐技术参数本研究在深圳绿微康中试车间（深圳市南山区高新南一道009号中科研发园孵化楼1楼）500 L发酵罐实施公称容

10、积：500 L 筒体直径 筒体高度：600 1650材料：磨光罐体 材质：SUS316L 采用电抛光搅拌：驱动 DC 电机/AC齿轮电机 顶部驱动（机械密封）电机功率：1.5 KW搅拌转速：280 1000 RPM压力控制：自动控制背压控制单元：控制板 15 英寸的彩色LCD控制面板： Bioradar可以实现数据收集和功能再现电源：220V 50/60 Hz 单相数据储存：pH，DO，压力，温度和转速图5 500 L发酵罐冷冻管斜面种子种子瓶500 L发酵罐发酵液30 ，3 d30 ，32 h静置培养220 RPM0.5 %接种量500 RPM30 ，60 h图6 脂肪酶发酵过程示意图4.2

11、菌株发酵中试研究结果采用长周期，大体积待放新工艺，显著提高了发酵指数，降低发酵成本 菌株号N发酵周期/ h发酵液体积/ L酶活性（ s）/U/mL总酶活量/M U发酵指数 */M U/h.m3G577（s）5524302421 61.41154.1844.39G577（s)352433 + 90（待放18 %）2450 57.4 1249.5648.0613-5-213524301794 148.8750.9128.88比较/ %-+ 34.9+ 35.5+ 53.7+ 66.4+ 53.7+ 66.4表5 不同菌株中试对比分析图6 13-5-21菌株发酵代谢曲线图7 G577（s）菌株发酵代

12、谢曲线根据合同技术考核指标3.发酵罐技术指标之中试指标要求，总酶活比对照提高66.4 %，脂肪酶活性为2450 U/mL，发酵指数为48.06 MU/h.m3，完成了该项技术指标并有超额和增项完成指标*：发酵指数 = 酶活性发酵液体积 /（发酵周期发酵罐体积）5 . 新菌种20T发酵罐发酵工艺研究（增项指标）5.1发酵罐技术参数在宁夏乙征生物工程有限公司发酵车间20T发酵罐实施公称容积：20 T 筒体直径 筒体高度：2200 5700材料：磨光罐体 材质：SUS316L 采用电抛光搅拌：驱动 DC 电机/AC齿轮电机 顶部驱动（机械密封）电机功率：30 KW通风：底部气体分布器 环型气体分布器

13、压力控制：自动控制背压电源：220V 50/60 Hz 单相数据储存：pH，DO，压力，温度和转速图8 20T发酵罐系列155.2菌株发酵工业放大研究结果罐批数发酵周期/ h发酵液体积 / m3酶活性/ U/mL待放体积/ m3待放酶活/ U/mL总酶活量/M U发酵指数/M U/h.m33654.616.12244 163.0-4415339.956 *56.016.32318 59.44.821004790342.77352.616.62353 66.3003907037.09比较/%+ 6.8（3.4 h）- 1.8- 1.4-+ 22.6+ 15.3表6 G201s菌株20 T发酵罐上

14、罐结果分析结果表明：根据合同技术考核指标7.工业放大指标，脂肪酶活性2318 U/mL，发酵指数42.77 MU/h.m3，为项目新增指标，完成了该项技术指标G201s菌株在20吨发酵罐试验41批次，扣除染菌罐和异常罐批5批，有效罐批36批*：新菌种 + 待放16第三部分 项目评价考核项技术指标对标结果（7）工业放大指标（增项）不要求发酵罐体积20 T自控罐 放罐体积81.5 % + 待放体积24 %发酵周期56小时发酵批数连续6批脂肪酶活性2318 U/mL 发酵指数 42.77 MU/h.m3（8）经济效益（增项）不要求 工业产值397.19万元 净利润114.51万元 利税额203.09

15、万元 表7 项目技术指标与实际完成情况对标 摘自项目验收报告考核项技术指标对标结果（1）模型建立及工业育种建立选育模型建立高通量筛选模型完成基因工程改造菌种构建新的工程菌株1-3株得到1株常规选育得到1-3株优良菌种得到2株（2）摇瓶技术指标摇瓶产酶量 18 % 50 %（3）发酵罐技术指标发酵罐体积100L自控罐500 L自控罐放罐体积75%86.0 % + 待放体积18 %发酵周期48-52小时52小时发酵批数连续3批连续3批发酵罐产酶量20%（比较对照菌）+ 66.4 %脂肪酶活性2300U/ml2450 U/mL发酵指数（增项）不要求48.06 M U/h.m3（+66.4 %）（4）

16、脂肪酶耐温性能最适温度 50 50 （5）发表论文和申报专利发表论文3篇 发表论文4篇 申报专利1项 申请发明专利1项 获得实用新型专利1项 （6）人才建设带2名学生 完成表8 项目技术指标新增项对标 1. 项目技术指标对标.发表研究论文5篇，中文核心期刊4篇，SCI论文1篇。申请发明专利1项，获得实用新型专利1项张谦, 王剑英, 林智, 等.生物技术通报, 2015, 31(3):165-170 (核心期刊)张谦, 贾佳, 林智, 等. 中国饲料, 2014, 16:28-32(核心期刊)张谦, 贾佳, 林智, 等. 生物技术通报, 2015, 31(12): 227-233(核心期刊)贾佳

17、,林智,曾慧,等. 中国饲料, 2016 8:9-12,5(核心期刊)Jia Jia, Xiaofeng Yang,et al. BioMed Research International, Volume 2015, 1-8（SCI：1.579）发明专利 20140276599.1（实质审查中）实用新型专利 ZL 201520339973.8（已经授权） 2.发表论文、专利 3. 脂肪酶新菌种产业化效益分析新菌种在自2014年9月在宁夏乙征公司的20吨发酵罐实施工业放大。有效罐批36批，生产脂肪酶8.97吨（折纯酶），实现产值397.19万元，净利润114.51万元，利税203.09万元三、合

18、同中各项财务经济指标的执行情况 项目于2013年11月在深圳技师学院单位实施。该项目研发成果主要用于深圳市绿微康生物工程有限公司的脂肪酶工业化菌株改造，目标产品为工业用脂肪酶生产，产品于2014年9月新菌种进行推广应用并形成销售 摘自审计报告 深中瑞华正专审字2016第048号表9 脂肪酶新种工业放大效益分析 4. 深圳技师工作站深圳技师工作站（绿微康站）课题：（1）产脂肪酶发酵液成分分析及酶活性检测（2）复合酶中脂肪酶定量分析（3）产脂肪酶黑曲霉高产菌种特性研究（4）产脂肪酶黑曲霉原生质体制备研究（5）产脂肪酶黑曲霉500L罐发酵工艺研究 经过与深圳市科技计划资助项目中所列的技术指标项进行认真的、全面的对标，所列6项指标全部完成，部