细胞破碎-分离纯化

1、生物分离工程精品课程主讲：曹学君细胞破碎概述第十五章细 胞 破 碎生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性细胞破碎概述概 述细胞破碎概述 一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之外的液相中（称胞外酶），这些产品主要为医药和保健产品，如胰岛素、某些细胞因子和疫苗亚单位成分等。 这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤和离心进行固液分离，然后将获得的澄清滤液

2、再进一步纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。概 述细胞破碎概述但由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续的分离纯化做好准备工作。几种由大肠杆菌表达的胞内重组药物概述药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病人生长激素（HGH）大肠杆菌治疗侏儒病-干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病和卡波济肉瘤细胞破碎概 述细胞破碎概述细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破坏细胞膜和细

3、胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产。概 述细胞破碎概述 微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，细胞膜和它所包围的细胞浆合称原生质体。动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 基于遗传和环境等因素，不同类型生化物质其细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。此外，不同的生化物质其稳定性有较大差

4、别，在破碎过程中应防止变性和被胞内的酶水解，因此，破碎方法的选择和操作条件的优化是十分必要的。真 核 细 胞概述细胞破碎organelle细胞器概述细胞破碎细胞膜的结构概述细胞破碎细胞破碎细胞壁的组成和结构（细菌肽聚糖结构示意图）概述细胞破碎概述 几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖（peptidoglycan）组成，它是难溶性的聚糖链（glycan chain），借助短肽交联而成的网状结构，包围在细胞周围，使细胞具有一定的形状和强度。 短肽一般由四或五个氨基酸组成，如L-丙氨酰-D-谷氨酰-L-赖氨酰-D-丙氨酸。而且短肽中常有D-氨基酸与二氨基庚二酸存在。细胞破碎概述虽然几乎所有的细菌都含有肽

5、聚糖的网状结构，但是革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。革兰氏阴性菌比阳性菌复杂，在电子显微镜超薄切片观察，可见革兰氏阳性菌细胞壁较厚，具有2080nm的肽聚糖层，约占细胞壁成分的4090，此外细胞壁还含有大量磷壁酸(eichoic acid)。而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，仅23nm，占细胞壁成分的10左右，由于肽聚糖之间仅由四肽侧链直接连接，缺乏五肽桥，故层较疏松，而且肽聚糖居于细胞壁最内层，紧贴在细胞膜上，在肽聚糖层外面还有一较厚的外壁层(约810nm)，主要成分为脂蛋白、脂多糖和其它脂类，因此，革兰氏阴性菌细胞壁中脂类含量较高。破碎细菌的主要阻力 细胞破碎概述 破碎细菌的

6、主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。 酵母细胞壁的结构示意图细胞破碎概述破碎酵母细胞壁的阻力 细胞破碎概述 酵母细胞壁的结构示意图如图152所示，细胞壁的最里层是由葡聚糖的细纤维组成，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状，覆盖在细纤维上面的是一层糖蛋白，最外层是甘露聚糖，由1,6一磷酸二酯键共价连接，形成网状结构。在该层的内部，有甘露聚糖-酶的复合物，它可以共价连接到网状结构上，也可以不连接。 与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。红面包霉菌

7、(Neurospora crassa)的细胞壁 结构示意图红面包霉菌细胞壁的结构示意图细胞破碎概述细胞破碎概述主要存在三种聚合物，葡聚糖（主要以-1,3糖苷键连接，某些以-1,6糖苷键连接），几丁质（以微纤维状态存在）以及糖蛋白。最外层(a)是-和-葡聚糖的混合物，第2层(b)是糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来，第3层(c)主要是蛋白质，最内层(d)主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。15.1.2 植物细胞壁的化学组成和结构细胞破碎概述对于已生长结

8、束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。初生壁是细胞生长期形成的。次生壁是细胞停止生长后，在初生壁内部形成的结构。概述细胞破碎植物细胞初生壁的化学组成组分结构和分类纤维素1，4D葡聚糖半纤维素木葡聚糖 甘露聚糖 木聚糖(包括阿拉伯木聚糖和4-0-甲基-葡萄糖醛酸木聚糖）果胶物质半乳糖醛酸聚糖 、 鼠李半乳糖醛酸聚糖 半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖蛋白质结构蛋白 各种酶类 凝集素细胞破碎“经纬”模型细胞破碎概述 目前，较流行的初生细胞壁结构是由Lampert等人提出的“经纬”模型，依据这一模型，纤维素的微纤丝以平行于细胞壁平面的方向一层一层敷着在上面，同一层次上的微纤丝平行排列，而不同层次上则排列方

9、向不同，互成一定角度，形成独立的网络，构成了细胞壁的“经”，模型中的“纬”是结构蛋白（富含羟脯氨酸的蛋白），它由细胞质分泌，垂直于细胞壁平面排列，并由异二酪氨酸交联成结构蛋白网，径向的微纤丝网和纬向的结构蛋白网之间又相互交联，构成更复杂的网络系统。半纤维素和果胶等胶体则填充在网络之中，从而使整个细胞壁既具有刚性又具有弹性。细胞破碎概述初生细胞的经纬模型次生细胞壁细胞破碎概述 某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4m以上)，常有三层组成。在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素（酚类组分

10、的聚合物）的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。15.2 细胞破碎技术 细胞破碎细胞破碎技术目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。机械法细胞破碎细胞破碎技术机械破碎法又可分为高压匀浆破碎法（homogenization）高速搅拌珠研磨破碎法（fine grinding）超声波破碎法（ultrasonication）非机械法破碎方法细胞破碎细胞破碎技术渗透压冲击破碎法（osmotic shock）冻融破碎法（freezing and thawing）酶溶破碎法（enzyme lysis）

11、化学破碎法（chemical treatment）去垢剂破碎法（detergents）高压匀浆器（High pressure homogenizer）细胞破碎技术细胞破碎操作原理细胞破碎细胞破碎技术 Manton Gaulin高压匀浆器是常用的设备，它由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。图15-5为高压匀浆器的排出阀结构简图，细胞浆液通过止逆阀进入泵体内，在高压下迫使其在排出阀的小孔中高速冲出，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击，使细胞受到高的液相剪切力而破碎。

12、在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节温度，使出口温度调节在20左右。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。细胞破碎技术细胞破碎高压匀浆法适用的范围细胞破碎细胞破碎技术高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎。料液细胞浓度可达到20%左右。团状和系状菌易造成高压匀浆器的堵塞，不宜使用高压匀浆法。高压匀浆法使用时注意事项细胞破碎细胞破碎技术高压匀浆器的操作温度上升约/10MPa为了保护目标产物的生物活性，需要对料液作冷却处理。多组破碎操作中需要在级间设置

13、冷却装置可有效防止温度上升，保护产物活性。高压匀浆器的种类细胞破碎细胞破碎技术高压匀浆器的种类较多 WAB公司的AVP Gaulin 31MR型最大操作压力为24MPa最大处理量为为100dm3/hBran and luebbe 公司SHL40型最大操作压力为20-63MPa最大处理量为为2.6-34 m3/h细胞破碎分率关系式细胞破碎细胞破碎技术破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率符合如下公式： ln1/(1-R)=KNP (15-1) 式中 R 破碎率，为N次循环后，蛋白质的释放量Rn与最大释放量Rm之比； K 与温度有关的速度常数； N 悬浮液通过匀浆器的次数； P 操作压力，MP

14、a； 与微生物种类有关的常数。影响破碎的主要因素细胞破碎细胞破碎技术压力温度通过均浆器阀的次数高压匀浆器破碎细胞细胞破碎细胞破碎技术 升高压力有利于破碎，它表明可以减少细胞的循环次数，在不明显增加通过量的情况下，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小，从而给随后细胞碎片的分离工作带来好处。Brokman等人已研究了能适应于高压操作的匀浆阀，试验表明在约175 MPa的压力下，破碎率可达100，但是也有试验表明当压力超过一定的值后，破碎率增长得很慢，在工业生产中，通常采用的压力为5570Mpa。高压匀浆器破碎细胞细胞破碎细胞破碎技术 升高压力有利于破碎，它表明可以

15、减少细胞的循环次数，在不明显增加通过量的情况下，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小，从而给随后细胞碎片的分离工作带来好处。Brokman等人已研究了能适应于高压操作的匀浆阀，试验表明在约175 MPa的压力下，破碎率可达100，但是也有试验表明当压力超过一定的值后，破碎率增长得很慢，在工业生产中，通常采用的压力为5570Mpa。yno珠磨机细胞破碎技术细胞破碎yno珠磨机细胞破碎细胞破碎技术高速珠磨机（High speed bead mill）研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。在工业规模的破碎

16、中，常采用高速珠磨机 。高速珠磨机工作原理细胞破碎细胞破碎技术水平位置的磨室内放置玻离小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。在料液出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。由于操作过程中会产生热量，易造成某些生化物质破坏，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。Netzsch LM-20型珠磨机细胞破碎技术细胞破碎德国Netzsch公司生产的LM-20型珠磨机 细胞破碎细胞破碎技术园盘以两种位置交错地安装在轴上，一种处于径向，一种和轴倾斜，径向园盘使磨料沿径向运动，倾

17、斜园盘则产生轴向运动。由于交错的运动，提高了破碎效率。除磨室有冷却夹套外，搅拌轴和园盘也可以冷却。破碎作用方程细胞破碎细胞破碎技术破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式： ln1/(1-R)=Kt 15-2 其中 R 破碎率； K一 一级反应速度常数； t一 时间。一级反应速度常数K与许多操作参数有关，如如搅拌转速、细胞悬浮液的浓度和循环速度、玻璃小珠的装量和珠体的直径，以及温度等。超声波破碎细胞破碎细胞破碎技术超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。超声波振荡器有不同的类型，常用的为电声型，它是由发生器和换

18、能器组成，发生器能产生高频电流，换能器的作用是把电磁振荡转换成机械振动。超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。超声波破碎的机理细胞破碎细胞破碎技术一般认为在超声波作用下液体发生空化作用（ cavitation),空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。超声波破碎的适用范围细胞破碎细胞破碎技术超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数微生物的破碎。超声波破碎的有效能量利用率极低，操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或外部冷却的容器中进行。由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大

19、，主要用于实验室规模的细胞破碎。15.2.2 非机械法细胞破碎细胞破碎技术非机械方法很多酶解渗透压冲击冻结和融化干燥法化学法溶胞其中酶法和化学法溶胞应用最广。 酶解（酶溶法 Enymatic lysis)细胞破碎细胞破碎技术酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。溶菌酶（lysozyme)适用于革兰氏阴性菌细胞的分解，应用于革兰氏阴性菌时，需辅以EDTA使之更有效地作用于细胞壁。真核细胞的细胞壁不同于原核细胞，需采用不同的酶。酶解法的优点 细胞破碎细胞破碎技术发生酶解的条件温和能选择性地释放产物胞内核酸等

20、泄出量少，细胞外形较完整，便于后步分离等但酶水解价格高，故小规模应用较广 自溶作用 细胞破碎细胞破碎技术 自溶作用是酶解的另一种方法，利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。可是，改变其生长环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。 渗透压冲击法 细胞破碎细胞破碎技术渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的溶液中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），由于渗透压的作用，细胞内水分便向外渗出，细胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗

21、透压的突然变化，胞外的水迅速渗入胞内，引起细胞快速膨胀而破裂。 冻结-融化法细胞破碎细胞破碎技术 将细胞放在低温下冷冻（约-15），然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。 干燥法细胞破碎细胞破碎技术经干燥后的细胞，其细胞膜的渗透性发生变化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就会被抽提出来。 化学法 细胞破碎细胞破碎技术采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂

22、 细胞破碎细胞破碎技术酸处理可以使蛋白质水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。碱和表面活性剂能溶解细胞壁上脂类物质或使某些组分从细胞内渗漏出来。天然的表面活性剂有胆酸盐和磷脂等 合成的表面活性剂可分离子型和非离子型，离子型如十二烷基硫酸钠（SDS，阴离子型）；十六烷基三甲基溴化铵（阳离子型）。非离子型如Triton X-100和吐温（Tween）等 有机溶剂可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 细胞破碎细胞破碎技术化学法和酶法一样也存在对产物的释出选择性好，细胞外形较完整，碎片少，核酸等胞内杂质释放少，便于后步分离等优点，故使用较多。但该法容易引起活性物质失活破坏，因此，根据生化物质的稳

23、定性来选择合适的化学试剂和操作条件是非常重要的。另外，化学试剂的加入，常会给随后产物的纯化带来困难，并影响最终产物纯度。如表面活性剂存在常会影响盐析中蛋白质的沉淀和疏水层析，因此必须注意除去。目标产物的选择性释放细胞破碎细胞破碎技术破碎的目的是要得到一种或几种目标产物，因此，在细胞内存在的许多种物质中，选择性释放目标产物、而使其它物质尽量少地释放出来，并且尽量降低细胞的破碎程度，对下游的分离纯化操作的顺利实施是非常重要的。 选择性释放目标产物细胞破碎细胞破碎技术利用珠磨法破碎酵母细胞时，酵母内各种酶的释放速率常数不同。一般靠近细胞壁和细胞膜的酶释放速度快，而细胞内部或细胞器内的酶随破碎的进行缓

24、慢释放出来。因此，选择发现地释放目标产物是可能的，关键是要知道目标产物的性质和在细胞同存在的位置，选择适当的破碎方法和操作条件。选择性释放目标产物的一般原则细胞破碎细胞破碎技术仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围当目标产物存在于细胞膜附近时，可采用较混和的方法，如酶溶法（包括自溶法）、渗透压冲击法和冻结融化法等。当目标产物存在于细胞质内时，则需采用强烈的机械破碎法选择性溶解目标产物当目标产物处于与细胞膜或细胞壁结合的状态时，调节溶液PH值，离子强度或添加与目标产物具有亲和性的试剂如：螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易溶解释放。同时，溶液性质应使其他杂质不易溶出。另外机械破碎法和化学法并用可使操

25、作条件更加温和，在相同的目标产物释放率条件下，降低细胞的破碎程度。包含体的分离和蛋白质复性细胞破碎细胞破碎技术重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素、人干扰素等）不仅不能分泌到细胞外、而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒包含体（ inclusion bodies IBs)细胞破碎细胞破碎技术包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。这些 基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所

26、以没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。所以，包含体的出现不仅增加了生化工程师生物分离设计的难度，也为生物化学家的蛋白质折叠（protein folding）机理研究提出了新的课题。15.4.2 目标蛋白的复性细胞破碎目标蛋白的复性包含体（inclusion bodies）是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。包含体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构

27、和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。几种常见的工艺路线（一）目标蛋白的复性细胞破碎细胞破碎目标蛋白的复性特点是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。这样首先就摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。缺点是要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。几种常见的工艺路线（二）目标蛋白的复性细胞破碎细胞破碎目标蛋白的复性 路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜

28、除去可溶性蛋白质，但细胞碎片却和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留，因此这条路线的问题比较多。膜分离的优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。几种常见的工艺路线（三）目标蛋白的复性细胞破碎细胞破碎目标蛋白的复性 路线三：是用化学法破菌，所采用的试剂既可以破菌又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后分离带来困难。包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）目标蛋白的复性细胞破碎包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）细胞破碎目标蛋白的

29、复性 来自发酵罐的菌体经过离心除去培养液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、EDTA和促进剂以除去脂蛋白和未破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进行变性溶解，溶解剂为6mol/L盐酸胍。溶解的同时通入空气氧化以打断错误连接的双硫键。离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲液进行透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀用离心除去。思考题细胞破碎目标蛋白的复性在选择细胞破碎方法时要需要考虑哪些因素？基因工程包含体的纯化方法。细胞破碎第二讲目标蛋白的复性第十五章细 胞 破 碎细胞破碎方法分类目标蛋白的复性细胞破

30、碎包含体的分离和蛋白质复性细胞破碎目标蛋白的复性 重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了崭新的途径，开辟了现代生物技术发展的新纪元。但是，人们在分离纯化基因工程表达产物时遇到了意想不到的困难，很多利用大肠杆菌为宿主细胞的外源基因表达产物（如尿激酶、人胰岛素、人生长激素、白细胞介素、人干扰素等）不仅不能分泌到细胞外、而且在细胞内凝聚成没有生物活性的固体颗粒包含体（ inclusion bodies IBs)。基因工程包涵体的纯化方法目标蛋白的复性收集菌体细胞细胞破碎包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性细胞破碎外源蛋白在大肠杆菌中的积累目标蛋白的复性蛋白0产物占菌体总蛋白/%外源蛋白的

31、积累人胰岛素50%形成包涵体 -丙酰胺酶20%在细胞间区-人体干扰素25%形成包涵体凝乳酶原形成包涵体牛生长激素30%形成包涵体 -内酰胺酶形成间区包涵体人胰岛素原5%26%形成包涵体细胞破碎包含体的构成细胞破碎目标蛋白的复性 包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。这些 基因表达产物的一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。所以，包含体的出现不仅增加了生化工程师生物分离设计的难度，也为生物化学家的蛋白质折叠（protein folding）机理研究提出了新的课题。目标蛋

32、白的复性细胞破碎目标蛋白的复性 包含体（inclusion bodies）是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。包含体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。几种常见的工艺路线（一）目标蛋白的复性机械破碎(高压匀浆、高速珠磨）离心提取出包含体加变性剂溶解除变性剂复性细胞破碎路线1 的特点细胞破碎目标蛋白的复性 特点:是

33、利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。这样首先就摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。 缺点:是要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。几种常见的工艺路线（二）目标蛋白的复性机械破碎膜分离除可溶性蛋白加变性剂溶解包含体除变性剂复性细胞破碎路线2 的特点细胞破碎目标蛋白的复性 路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质，但细胞碎片却和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留，因

34、此这条路线的问题比较多。膜分离的优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。几种常见的工艺路线（三）目标蛋白的复性化学破碎（加变性剂）离心除细胞碎片）除变性剂复性细胞破碎 路线三：细胞破碎目标蛋白的复性是用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。目标蛋白的复性细胞破碎包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）细胞破碎目标蛋白的复性 来自发酵罐的菌体经过离心除去培养液后加入缓冲液悬浮，通入高

35、压匀浆器反复破碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、EDTA和促进剂以除去脂蛋白和未破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进行变性溶解，溶解剂为6mol/L盐酸胍。溶解的同时通入空气氧化以打断错误连接的双硫键。离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲液进行透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀用离心除去。思考题细胞破碎目标蛋白的复性在选择细胞破碎方法时要需要考虑哪些因素？基因工程包含体的纯化方法。16 沉 淀 法 (precipitation)沉淀法概论生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路

36、线一A路线一B清液胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性沉淀法概论16.1 概述沉淀法概论 沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。采用沉淀的手段，主要是为了通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分；其次，沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。 概述沉淀法概论 生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些

37、条件的因素都会破坏溶液的稳定性。沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分和其它成分分开的技术。沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。 概述沉淀法概论 沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉析物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行： 概述沉淀法概论沉淀法操步骤 ：首先加入沉淀剂，沉淀剂的陈化，促进粒子生长；为离心或过滤，收集沉

38、淀物。加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。沉淀法的分类沉淀法概论根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1）盐析法；（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）高价金属离子沉淀法等。上述各种方法中，除第（3）种有机溶剂沉淀法也能适用于抗生素等小分子外，其他各种方法只适用蛋白质等大分子，故以下的讨论均限于蛋白质。16.2 蛋白质的溶解特性沉淀法蛋白质的溶解特性蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水

39、的。一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。蛋白质的溶解特性沉淀法蛋白质的溶解特性蛋白质是两性高分子电解质（amphoteric polymer），主要由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域蛋白质的溶解特性沉淀法防止蛋白质凝聚沉淀的屏障沉淀法蛋白质

40、的溶解特性蛋白质周围的水化层（hydration shell)可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液。蛋白质分子间静电排斥作用。（存在双电层）因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。16.3 蛋白质胶体溶液的稳定性沉淀法蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质可以看作是一个表面分布有正、负电荷的球体，这种正、负电荷是由氨基和羧基的离子化形成的，换句话说，该球体是带有均衡电荷分布的胶体颗粒。因此，蛋白质的沉淀，实际上与胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似。静电斥力吸引力蛋白质/胶体颗粒的凝聚和絮凝现象相似沉淀法蛋白质胶体溶液的稳定性 蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电

41、的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。因溶液是电中性的，水中应有等当量的反离子存在。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。沉淀法蛋白质胶体溶液的稳定性蛋白质胶体溶液的稳定性沉淀法吸引力沉淀法蛋白质胶体溶液的稳定性颗粒间的相互作用颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。 Van der Waals 力Keeson 引力（偶极力）Debye 引力 （诱导力）London 引力 （色散力）是最重要的一种引力，因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存在的。沉淀法蛋白质胶体溶液的稳定性DLVO理论沉淀法蛋白质胶体溶液的稳定性 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗粒

42、距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现为吸引位能。 虽然这个理论所假定的条件并不完全适合于蛋白质分子，但该理论对于理解破坏蛋白质溶液的稳定性仍有很大帮助，同时还有助于针对具体蛋白质选择最合适的沉淀剂及技术。16.4 蛋白质盐析沉淀法蛋白质盐析机理：（1）破坏水化膜（2）中和电荷盐析经验式盐溶 盐析饱和度 中性盐的盐析效果中性盐盐析法沉淀法蛋白质盐析早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。在蛋白质溶液中加入中性盐后会压缩扩散双电层、降低电位，

43、即中性盐既会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。沉淀法蛋白质盐析 Cohn方程式沉淀法蛋白质盐析现在常用 Cohn经验式来表示蛋白质的溶解度与盐的浓度之间的关系： S= s （16）式中 S蛋白质的溶解度，g/L; I一离子强度等于 I=1/2mizi2 ; mi离子 i的摩尔浓度； Zi所带电荷； 常数，与盐的种类无关，但与温度、pH和蛋白质种类有关; Ks盐析常数，与温度和PH无关，但与蛋白质和盐的种类有关。有时为简单计，也可以用浓度代替离子强度，则上式成为Cohnx 经验式（用浓度代替离子强度）蛋白质盐

44、析 式中m 为盐的摩尔浓度.沉淀法蛋白质盐析沉淀法沉淀法蛋白质盐析 常数Ks代表图中直线的斜率；代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。从一些实验结果表明，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过1倍。组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。 用盐析法分离蛋白质的二种方法沉淀法蛋白质盐析在一定的 pH值及温度条件下，改变盐的浓度（即离子强度）达到沉淀的目的，称为“s”分级盐析法。（Ks盐析：固定pH, 温度，改变盐浓度）在一定的离子强度

45、下，改变溶液的pH值及温度，达到沉淀的目的，称为“”分级盐析法。（盐析：固定离子强度，改变pH及温度。）沉淀法蛋白质盐析虽然Cohn公式能够描述盐析状态下蛋白质的溶解度，但它不能体现低盐浓度（盐溶状态）下蛋白质的溶解度。Melander和Horvath根据 Sinanoglu有关蛋白质盐析时溶剂和溶质相互作用理论（空腔理论），Kirkwood的静电作用模式。 提出了不同盐浓度下的蛋白质溶解度的计算方程式：蛋白质盐析沉淀法盐析操作沉淀法蛋白质盐析硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂硫酸铵的溶解度在030范围内变化很小20时的饱和浓度约为4.05mol/dm3（543g/dm3 ），饱和溶液密度为(1

46、.235kg/dm3 ） 。用1.0dm3水制备硫酸铵的饱和溶液，需加入761g硫酸铵，饱和溶液体积为1.425dm3 。盐析操作(加盐方式）沉淀法蛋白质盐析采用硫酸铵进行盐析时可按二种方式加入：直接加入固体(NH4)2SO4 粉末，工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；是加入硫酸铵饱和溶液，在实验室和小规模生产中，或(NH4)2SO4 浓度不需太高时，可采用这种方式，它可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。沉淀法蛋白质盐析现考虑向1dm3蛋白质溶液中加入硫酸铵至某一浓度使蛋白质发生盐析操作。由于加入硫酸铵后溶液的体积增大，在

47、20下，硫酸铵的摩尔浓度从增大到所需加入的硫酸铵量（克）可由下式计算沉淀法蛋白质盐析 考虑到溶解(NH4)2SO4,体积要增大，则于20时，使 L M1摩尔浓度(NH4)2SO4溶液增至M2摩尔浓度，所需加入的(NH4)2SO4克数为G沉淀法蛋白质盐析上式如以饱和度表示，则从S1%增至S2%，需加入克数为（164）式上式还可以列成表，更为方便。 实际所需 (NH4)2SO4的饱和度，需通过试验决定。对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度都小于 0.l mgL，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在40%-60%之间。沉淀法蛋白质盐析实际料液中目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度

48、或饱和浓度可通过实验确定。典型的硫酸铵盐析过程最适饱和度是30%55%蛋白质盐析204060800100总蛋白目标蛋白质上清液浓度沉淀法阴阳离子盐析效果沉淀法蛋白质盐析阴离子盐析效果 ：柠檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-SCN-阳离子盐析效果：NH4+ K+Na+ 高价阳离子硫酸铵：（1） 价廉 ；（2） 溶解度大，稳定蛋白质 ；（3）水解变酸；（4）高pH 释氨，腐蚀；（5）残留产品有影响。pH值和温度的影响沉淀法蛋白质盐析随pH 变化（1）对数关系（2） 等电点附近有极小值随温度变化随温度升高减小，热促失水膜盐析注意事项： (1) 稳定pH 用磷酸缓冲液（2）硫

49、酸铵加入后体积变大（3）选择饱和度（4）分步盐析（5）初始蛋白浓度值随pH值变化 蛋白质盐析PH沉淀法值随pH变化沉淀法蛋白质盐析 上图表示对卵清蛋白（Ovalbumin）和碳氧血红蛋白进行盐析时，随pH的变化。由于代表溶解度的对数，故 变化一个单位，溶解度就变化 10倍。通常在等电点附近有极小值。两种蛋白质的相对溶解度会随pH而变化很大；例如从图 上可见， 当 pH从5变到6时，在一定盐浓度下，两种蛋白质溶解度之比的变化可达几千倍。 蛋白质盐析沉淀法16.5等电点沉淀法沉淀法等电点沉淀法 在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形

50、成沉淀。图16-10表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低离子强度的溶液中，调 pH在等电点并不产生沉淀。等电点沉淀法沉淀法等电点沉淀法在调节等电点时，如果采用盐 酸、氢氧化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使pH缓慢变动，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。等电点沉淀法沉淀法等电点沉淀法沉淀法等电点沉淀法（1）适用于疏水性强的蛋白质（2）中性盐浓度增大时，等电点向偏 酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。 （4）无机酸通常价格便宜，无毒（5）蛋白质对低pH 敏感，易失

51、活16.6 有机溶剂沉淀法沉淀法有机溶剂沉淀法机理；a 介电常数b 溶剂化（蛋白质结合水被取代）c 疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团 结合形成疏水层操作事项：a 温度 b 浓度 c pH d 蛋白浓度 e 蛋白分子量 f 中性盐 有机溶剂沉淀法沉淀法有机溶剂沉淀法 酶、蛋白质、核酸、多糖类生化物质的水溶液中加入乙醇、丙酮等水溶性的有机溶剂，它们的溶解度会显著降低，从溶液中沉淀出来。有机溶剂沉淀的优点是：分辨率比盐析法高，溶剂容易除去并可以回收。缺点是易使酶变性。有机溶剂沉淀法沉淀法有机溶剂沉淀法 有机溶剂沉淀的原理：加入有机溶剂使溶液的介电常数减小，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。有机溶剂的加入也使水的极性减小，使两性电解质在溶液中的溶解度降低。有机溶剂会降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。有机溶剂沉淀法沉淀法有机溶剂沉淀法 使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，以减少蛋白质的变性。所用的有机溶剂须预先冷却到-10-20；有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。中性盐会增加蛋白质在有机溶液中的溶解度，溶液中的中性盐浓度越高，沉淀蛋白质所需要的有机溶剂浓度也越大。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇、丙酮等。有机溶剂沉淀法沉淀法16.7非离子型聚合物沉淀法非离子型聚合物优点：1. 室温 2. 颗粒大，易于收集 3. 提高蛋