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文档简介
1、第十二章 其他分子(fnz)诊断检测技术临床(ln chun)生物化学教研室 付祖姣 博士共八十页目 录第一节 基因变异(biny)检测技术第二节 脉冲电场凝胶电泳第三节 分子影像共八十页第一节 基因变异检测(jin c)技术检测(jin c)已知的基因突变检测未知的基因突变分子诊断检测基因突变的目的:共八十页几种常见的基因(jyn)变异检测方法PCR扩增阻碍突变系统寡核苷酸连接实验温度梯度凝胶电泳和变性(binxng)梯度凝胶电泳变性高效液相色谱法错配接合蛋白质截短测试法共八十页一、PCR扩增阻碍(z i)突变系统(PCR amplification regractory mytation
2、system, PCR-ARMS)以PCR方法为基础,检测已知点突变(tbin)的一种方法。又叫做PCR等位基因特异性扩增法(PCR amplification of specific alleles, PASA)或等位基因特异性PCR (alleles-specific PCR, ASPCR)共八十页(一)基本原理 PCR的引物3末端(m dun)的核苷酸与模板之间存在错配时,PCR扩增效果差,或者不能扩增。模板 3 5引物 5 3 A T G T T A T A C A A CPCR-ARMS共八十页设计2对引物,一对(y du)引物(P1)与正常基因完全匹配,一对(y du)引物(P2)
3、与突变基因完全匹配。用这两对引物分别扩增模板。如果模板基因为正常基因,那么P1扩增可以得到大量产物,而P2无产物。如果模板已经突变,那么P2扩增可以获得大量产物,而P1无产物。PCR-ARMS基本原理PCR-ARMS共八十页5 33 5 ATGGTTCCTG TACCAAGGAC5 33 5 ATGGTACCTGTACCATGGAC突变(tbin)等位基因正常等位基因顺利(shnl)延长不能延长5 3ATCGTT5 3ATCGTT突变基因的引物P2的扩增PCR-ARMS共八十页(二)应用(yngyng)检测单一点突变(tbin)基因分型检测多位点突变PCR-ARMS的应用共八十页1. 检测(j
4、in c)单一点突变设计一对引物,可以扩增突变基因而对正常基因呈扩增阻遏;附加一对引物,可以扩增标志性基因作为阳性对照;PCR扩增完成,进行电泳,即可得知(d zh)点突变是否发生。 M MG NG 异常阳性对照突变基因PCR-ARMS的应用共八十页2. 基因(jyn)分型可用于单个突变的基因分型(鉴别(jinbi)杂合子和纯合子)或多态性分析PCR-ARMS的应用1: 正常基因的引物扩增结果;2:突变基因的引物扩增结果 M Wt1 Wt2 Ht1 Ht2 Hm1 Hm2 野生纯合子杂合子 突变纯合子方法一:正常等位基因野生纯合子点突变突变杂合子稳定遗传突变纯合子共八十页方法(fngf)二:
5、野生纯合子杂合子 突变纯合子 M Wt Ht Hm5335496 bp371 bp野生型基因(jyn)引物突变型基因引物突变点PCR-ARMS的应用共八十页3. 检测(jin c)多位点突变突变(tbin)点1突变点2片段1 片段2PCR-ARMS的应用PCR-ARMS可同时检测多个点突变。共八十页(三)方法学评价(pngji)适用于较少点突变的检测(jin c);具有低-中等批量处理能力;可借助多重PCR检测多个点突变;无需放射性标记;无需昂贵的试剂;无需复杂的检测系统PCR-ARMS优点缺点只能检测已知的基因突变及多态性共八十页二、寡核苷酸连接(linji)实验(oligonucleoti
6、de ligation assay, OLA)利用DNA连接(linji)酶,将2段寡核苷酸探针顺向连接(linji),从而检测靶基因型的一种方法。该方法因为可靠、精确、重现性好,已成为临床遗传病分子诊断的一种基本方法。共八十页(一)基本原理嗜温性或耐热的连接酶具有高特异性和高保真性,它能连接与模板序列完全(wnqun)互补的两段核苷酸片段。OLA的基本原理DNA 连接酶5 3 TACCAAGGA C G AT TCCTGATC ATGGTTCCT G C TAAGGACTAG3 55 3 TACCAAGGA C G AT TCCTGATC ATGGTTCCT A C TAAGGACTAG3
7、5共八十页双等位基因变异(biny)的检测OLA的基本原理探针(tn zhn)1 5 等位基因A 3 TACCAAGGA C G AT TCCTGATC ATGGTTCCT G C TAAGGACTAG3 5 TACCAAGGA G G AT TCCTGATC ATGGTTCCT C C TAAGGACTAG3 5探针2 5 等位基因a 3通用探针共八十页OLA实验(shyn)的操作耐热连接酶,可使变性和连接连续(linx)进行,产物呈线性增长,大大增加了检测的灵敏度;若PCR扩增引物的Tm值大于探针的Tm值,可在同一管内先进行PCR,再进行OLA实验,大大减少了污染,提高检测效率。2. 条件
8、:1. 反应体系:3. 方法的发展:2个探针、DNA连接酶、模板探针与靶序列的杂交区域足够长(20bp)温度:能使探针和靶序列杂交OLA的基本原理共八十页(二)临床(ln chun)应用镰状细胞贫血症的分子诊断、产前检查多种遗传病及常见病的检测(jin c) (P168);局部地区人群的遗传病分子检测PCR-OLA的应用共八十页(三)方法学评价(pngji)能可靠地鉴别基因型及纯、杂合子;不容易(rngy)产生假阴性和假阳性结果;利用耐热连接酶循环进行连接,使信号放大,更增强了该法的灵敏度优点:缺点: 需要多相参与,增加实验的复杂度; 需要PCR扩增与OLA相结合,PCR的非特异性扩增导致了该
9、方法的重现性不够PCR-OLA的方法学评价共八十页三、温度梯度凝胶电泳和变性(binxng)梯度凝胶电泳 利用(lyng)不同的分子在不同浓度的变性剂作用下,失活而改变分子构象,进而进行分离的一种电泳技术。 利用不同的分子在不同的温度下,构象改变的不同而进行分离的一种电泳技术。 温度梯度凝胶电泳 (Temperature gradient gel electrophoresis, TGGE) 变性梯度凝胶电泳 (denaturing-gradient gel electrophoresis, DGGE)46 50 54 58 62共八十页(一)TGGE的基本原理 普通的非变性凝胶电泳不能分离具
10、有相似长度的DNA,所以也不能分离发生了单核苷酸突变的DNA序列。 但是在温度梯度凝胶电泳中,随着(su zhe)温度的逐渐升高,DNA分子会呈阶梯式逐步发生解链。部分解链的双链DNA分子表现出一种复杂的分枝构象,使得其电泳迁移率大大下降。 TGGE共八十页TGGE的基本原理TGGE5 33 5 ATGGTTCCTG TACCAAGGAC3 5 ATGGCTCCTG TACCGAGGAC5 3正常等位基因突变等位基因Tm=54Tm=5846 50 54 58 62 正常基因(jyn)突变基因共八十页(二)突变的检测(jin c)原理正常(zhngchng)等位基因点突变突变杂合子稳定遗传突变纯
11、合子PCR扩增wt/wt wt/wt, mt/mt, wt/mt, mt/wt mt/mtPCR产物基因型TGGE共八十页1 2 3 45 6 1 2 3 4 5 6a 异源b 双链带c 同源(tn yun)d 双链带1,5,6为点突变(tbin)的杂合子;2为突变(tbin)的纯合子;3,4为野生的纯合子.TGGE共八十页(三)变性(binxng)梯度凝胶电泳(DGGE)实验 实验原理与TGGE一致,只不过在DGGE中,变性条件取代(qdi)了TGGE的温度。 在DGGE试验中,有2个变性条件: 热:一般采用60的恒定温度; 变性剂:固定比率的甲酰胺、尿素TGGE/DGGE 如果想要获得很好
12、的实验结果,还有耐于利用相关软件优化实验条件:电泳时间、凝胶的浓度、变性的梯度等。共八十页(四)临床(ln chun)应用广泛应用于疾病基因的突变检测(jin c),尤其是一个等位基因发生突变就会引起的疾病检测(jin c);筛选人类基因的多态性;人类基因的突变检测,如P53、FBN1等基因;线粒体DNA中的基因突变及多态性检测;粪便及肠内微生物多态性的鉴定;病毒基因组的突变鉴定及不同病毒株之间的基因组差异鉴定。TGGE/DGGE共八十页(五)方法学评价(pngji)高分辨率,能100%检出对单个碱基突变(tbin)的基因;结合GC夹、补骨脂素夹或双边夹,可提高其灵敏度,获得更高的检出率。TG
13、GE/DGGE优点缺点合成带GC夹的引物需要特定的仪器,成本较高。共八十页色谱法也叫层析法,它是一种高效能的物理分离技术,其原理是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行(jnxng)分离的。将它用于分析化学并配合适当的检测手段,就成为色谱分析法。高效液相色谱:以液体为流动性,高速、高效率地分离混合物的一种色谱技术。变性高效液相色谱:改进传统高效液相色谱的分离系统,并运用变温分析方式,高效分离各种生物大分子(包括DNA)的一种方法。四、变性(binxng)高效液相色谱法(denaturing high performance liquid chromatograp
14、hy, DHPLC)DHPLC共八十页排阻色谱(s p) 亲和色谱(s p)共八十页(一)DHPLC的基本原理DHPLC的分离(fnl)系统DHPLC分离DNA的原理DHPLC检测突变的原理DHPLC共八十页1. DHPLC的分离(fnl)系统DHPLC1. 色谱柱的填料(tinlio) 特性:电中性,疏水性固定相: C18基 质: 聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)2. 离子对试剂:三乙基铵醋酸盐(TEAA) 特性:带正电荷,疏水性3. 流动相:乙腈 特性:通过改变浓度,将DNA分子按结合程度的不同,逐步洗脱下来。共八十页PO3-TEAAC182. DHPLC分离(fnl)DNA的原理DH
15、PLC共八十页DHPLC3. DHPLC检测突变(tbin)的原理变性后,缓慢(hunmn)退火分离手段:非变性分离部分变性分离完全变性分离共八十页(二)临床(ln chun)应用乳腺癌相关基因BRCA1、BRCA2及ATM等疾病相关基因的分子(fnz)检测;短的串联重复序列的基因分型;肿瘤样本中杂合性缺失的检测;Y染色体和常染色体DNA序列的筛查酵母、拟南芥、果蝇及小鼠的基因组作图及基因克隆。DHPLC共八十页(三)方法学评价(pngji)优点(yudin):具有更高的准确性和敏感度。DHPLC检测特性SSCPTGGE/DGGEDHPLCDNA测序检出范围0.5%的变异20%的变异检出率50
16、%-95%40%-100%100%80%工作度需要特殊的GC夹辅助,增加了工作量快速,2-3 min费时费力共八十页错配接合(jih)蛋白质截短测试法(PTT): 又称为体外蛋白质合成检测(jin c)技术(IVPS),只检测(jin c)与疾病相关的突变,即检测(jin c)使蛋白不能全长翻译的突变。五、错配接合蛋白质截短测试法(protein truncation test, PTT)共八十页(一)PTT的原理(yunl)PTT检测基因(jyn)缺失、异常的复制或剪接检测翻译终止突变共八十页(二)临床(ln chun)应用最早被用于杜氏肌营养不良的检测;家族(jiz)性腺瘤样息肉病;遗传性
17、硬纤维瘤病;共济失调毛细血管扩张症;遗传性乳腺癌;卵巢癌等。PTT共八十页(三)方法学评价(pngji)优点(yudin):PTT不仅可检测出只与疾病相关的蛋白截短突变,还能检测出在RNA形成过程中发生的突变。可以直接采用mRNA进行检测,减少了操作步骤,加快了分析进程;只鉴定引起疾病的截短突变,不会受到基因沉默的影响;截短蛋白质分子的长度指明了突变的位置,可以更方便地进行DNA测序分析以确定突变。共八十页DHPLC缺点(qudin):最佳检测范围(fnwi)为2kb的基因组或1.3-1.6kb的cDNA,因此对于序列较长、包含多个外显子的疾病基因,需要分几次进行检测;PTT因为凝胶的分辨率,
18、而检测不出编码序列中小的插入或错义突变;引起RNA产量改变或使mRNA不稳定的突变可能被漏检。共八十页谢 谢!共八十页第二节 脉冲(michng)电场凝胶电泳 交替采用两个方向的不均匀(jnyn)电场,使DNA分子在连续间隔交替的电场中,不断改变方向运动,从而将DNA按分子大小分开的电泳技术。脉冲电场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)特点:能分离50 kb-10 Mb的DNA片段。共八十页 在PFGE中,电场的方向、脉冲时间和电压大小可交替改变(gibin)。 在每次电场方向改变时,DNA分子都需要时间来改变其分子构型和迁移方向。 DNA分
19、子越大,分子构型转换所需的时间越长,转变迁移方向的时间也越长。 不同大小的DNA分子,因为其改变泳动方向的时间不同,迁移速度也就不同,从而可以在脉冲电场中很好地分开。一、PFGE的原理(yunl)共八十页二、PFGE的一般(ybn)步骤真核或原核细胞包埋原位裂解限制性酶切脉冲(michng)电泳结果分析原位裂解获得完整的染色体DNA与琼脂糖混合制备包埋块(含有染色体)限制性酶切后电泳共八十页三、PFGE的种类(zhngli)倒转电场(din chng)凝胶电泳(field-inversion gel electrophoresis, FIGE)交流电场凝胶电泳(transverse-alter
20、nating field gel electrophoresis, TAFE)钳位均匀电场凝胶电泳(contour-clamped homogeneous electric fields, CHEF)旋转凝胶电泳(rotating gel electrophoresis, RGE)共八十页两个(lin )电场方向为180脉冲间隔时间为: 向前向后=31装置简单:电泳槽和脉冲电极控制器分离片段范围:10 kb-800 kb特点(tdin):1. 倒转电场凝胶电泳(FIGE)共八十页两个电场方向为115 165 样品(yngpn)在凝胶中呈“之”字形泳动分离片段可大至 1 600 kb在病原生物的
21、基因分析中有特殊的用途特点(tdin):2. 交流电场凝胶电泳(TAFE)共八十页目前应用最广泛的一类脉冲电泳没有所谓的“负极(fj)”,两个主要的电场方向呈120DNA分子在凝胶中能很好地聚焦 分离片段可大至7 000 kb特点(tdin):3.钳位均匀电场凝胶电泳(CHEF)共八十页只有一个均一的电场凝胶可以周期性旋转用于不同电场角度时,脉冲时间、电压等参数对DNA分离效果的影响分离片段(pin dun)范围:50 kb-6 000 kb特点(tdin):4. 旋转凝胶电泳(RGE)共八十页(二)PFGE的应用(yngyng)菌株的基因分型;制备某个(mu )菌株的染色体图谱;大质粒的分离
22、和大小测定。PFGE共八十页 菌株的基因(jyn)分型;传统(chuntng)的细菌分型方法:生物学分型;血清学分型;噬菌体分型;细菌素分型;优点:分辨率高;准确度高;对流行病学的研究贡献大PFGE共八十页2. 制备某个(mu )菌株的染色体图谱作用(zuyng):鉴定基因大小;构建菌株的基因组物理图谱 A BPFGE共八十页3. 大质粒的分离和大小(dxio)测定操作方法:将细菌(xjn)包埋在琼脂糖块中;裂解细胞壁;S1核酸酶酶切;PFGE电泳PFGE共八十页第三节 分子(fnz)影像 1999年由Weissleder等人提出,也被称为分子成像或分子显像,它是指在活体状态下从细胞、基因和分
23、子水平,通过无创伤的影像技术,对其生物学行为进行(jnxng)定性和定量研究。分子影像 (molecular imaging)共八十页 分子探针(tn zhn)是分子影像中的关键组成部分,高特异性的分子探针是进行分子影像学研究的先决条件。一、分子(fnz)影像探针分子探针示踪剂: 放射性核素、顺磁性物质或荧光素等能参与体内自然的生理生化活动的特殊分子: 受体、生物酶及单克隆抗体 分子影像探针:一类带有示踪剂,能参与体内自然的生理生化活动的特殊分子。共八十页 分子探针(tn zhn)需要具备的特点:相对分子质量小、纯度高、安全,不影响所研究的疾病过程;具有良好的生物学功能,能参与人体正常的生理生
24、化活动;能够克服人体内部的“生理屏障”(如脑屏障、血管壁、细胞膜等),顺利到达靶分子所在的器官,同时不会积聚(jj)于其他组织;示踪剂、分子探针和靶分子应该紧密结合,不能脱落,且有足够长的半衰期以便于检测。共八十页 根据(gnj)分子探针的不同,分子影像有2种基本的检测策略:1. 直接(zhji)成像2. 间接成像: 采用一个特异性探针(细胞表面报告分子、细胞内分子或基因表达产物),它与靶分子作用可直接提供一个与靶分子浓度相关的信号而成像。 一般需要一个报告基因和一个报告探针,它们在特定的靶细胞中相互作用产生一个代谢物截留于细胞中发出信号,通过成像设备探测到而成像。 共八十页二、分子(fnz)
25、影像学技术(一) 放射性核素成像(radionuclide imaging)(二) 磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)(三) 光学(gungxu)成像(optical imaging)共八十页 正电子发射(fsh)计算机断层成像技术(positron emission tomography,PET) 单光子发射计算机断层扫描技术(single photon emission computed tomography, SPECT)2. 常用(chn yn)的放射性核素成像技术:(一) 放射性核素成像1. 概念 将有明确生物学效应的放射性探针导入人体内,使
26、它参与体内的生物学活动,利用相关成像技术进行探测和显像,以反映体内特定的生物学活动过程,从而了解体内的生理、生化状态。共八十页 又被称为生化(shn hu)显像或功能分子显像技术,集中了核物理、放射化学、分子生物学和医学影像新技术的优势,从分子水平上观察细胞代谢的活动,可提供独特的生理性示踪研究和活体生化显像。特点(tdin): 正电子发射计算机断层成像技术(positron emission tomography,PET)共八十页检测(jin c)策略 将人体代谢所需要的物质(如葡萄糖、蛋白质等)标记上短寿命的放射性核素(如14C、13N)制成探针注入人体内。因为病变组织和正常组织的代谢状态
27、不同,它们富集的示踪剂的量不同。示踪剂中的放射性核素的正电子与人体内的一个(y )负电子湮灭能产生两个互呈180发射的光子,而被PET设备捕获。 通过对放射性核素的检测成像,PET可显示出示踪剂的分布情况和聚集的部位、组织或器官以及量的多少,从而对疾病进行定位、定量、定性及定期分析。(1)直接成像:共八十页 常用(chn yn)的报告基因:单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)等(2)间接(jin ji)成像: 原理: 胸苷类似物经放射性核素标记后称为探针,可以通过主动转运自由通过细胞膜。但该物质可被细胞内表达出的HSV-TK酶磷酸化,而不能再自由穿过细胞膜而滞留于细胞内,其放射性的信号指示HS
28、V-TK的存在,证明外源基因的转染和表达。共八十页某个(mu )特定的器官或组织细胞表达(biod)HSV-TKHSV-TK与胸苷类似物特异性结合,并发生磷酸化成像发出信号HSV-TK基因携带报告基因的细胞带标记的探针检测信号 间接成像示意图共八十页2. SPECT技术(jsh)原理(yunl): 通过探测和处理体内的放射性核素自行发射的单个的光子构成断层图像,它可以反映器官结构及功能状态,现已用于临床检测。与PET技术的方法学比较:PET技术: 一次检查,全身显像; 但设备昂贵,且核素半衰期短, 不能同时检测多个探针SPECT技术:价格便宜,可同时进行多探针成像; 但只能进行半定量分析。共八
29、十页(二) 磁共振成像 基本原理 在外加磁场的作用下,氢原子核(H)即质子以一种特定方式绕磁场方向旋转。用一个适当频率的射频脉冲从与主磁场相垂直的方向上对质子进行激发后,会引起质子共振,成为激发态,即所谓磁共振。在射频脉冲停止后,质子在由激发态转变为原始态时,会发射出与激发脉冲频率相同的信号。通过身体附近(fjn)的接受器接收,并经计算机处理,就可获得MRI图像。 人体2/3的重量为水分,如此高的比例正是磁共振成像技术能被广泛应用于医学诊断的基础(jch)。人体内器官和组织中的水分并不相同,很多疾病的病理过程会导致水分形态的变化,即可由磁共振图像反应出来。 共八十页MRI显示(xinsh)左肾
30、囊肿共八十页 磁共振成像的策略(cl)间接成像 为了增强磁共振在病变组织的信号(xnho),通常采用标记报告基因,并将其转染靶细胞并在靶细胞内大量扩增来放大MR信号(xnho)成像。常用的报告基因:酪氨酸激酶-半乳糖苷酶转铁蛋白受体共八十页 酪氨酸激酶(jmi) 胞内受体; 它是黑色素合成的限速酶,而黑色素有高度(god)结合铁的能力; 酪氨酸激酶的过量表达会导致黑色素合成增加,从而使其结合铁的量也相应增加,而增强MR信号。共八十页2. -半乳糖苷酶 胞内受体; 该系统采用的分子探针:由钆(ga)的不配对电子组成,探针周围(zhuwi)由一个化学箍环封闭,不能与水分子反应,箍环上有一个糖分子作
31、“门”。 当-半乳糖苷酶存在时,糖分子被降解,“门”开放,钆就暴露在水分子中,其不配对电子与氢质子作用,增强了MR信号。共八十页3. 转铁蛋白受体 细胞表面蛋白受体; 分子(fnz)探针:超顺磁性的单晶氧化铁微粒和转铁蛋白的复合物; 转铁蛋白受体通过与转铁蛋白-铁结合形成复合体,将铁转运入细胞内,而增强MR信号。共八十页 MRI的方法学评价(pngji)空间分辨率高(达到m);能同时获得生理及解剖信息;在观察基因表达变化(binhu)、肿瘤血管生成及细胞分子水平的功能成像中具有独特的作用。优点:缺点:需要大量的探针;敏感度较低;扫描和后加工时间长;价格昂贵共八十页(三) 光学(gungxu)成
32、像 分类(fn li)荧光成像技术生物发光成像技术共八十页1. 荧光(ynggung)成像技术报告基因:绿色(l s)荧光蛋白(green fluorescence protein, GFP)基因红色荧光蛋白(RFP)基因近红外(NIR)荧光素 通过激发光激发荧光基团到达高能量状态,而后产生发射光。 红光的穿透性在小动物体内比蓝绿光的穿透性要好得多。近红外荧光素的波长为650900 nm,其光子穿透组织能力较可见光强;而且在此波长范围内,血红蛋白、水、脂质对光子的吸收率最低,背景噪音的干扰最小。因此近红外荧光为观测生理指标的最佳选择。成像原理:共八十页2. 生物(shngw)发光成像技术通过分子克隆技术将荧光素酶基因插入靶基因,即可将所需研究(ynji)的基因或细胞标记上荧光素酶。将标记好的细胞注入小鼠体内;观测前通过腹腔或静脉注射导入荧光素酶的底物荧光素,即可在几分钟内产生发光现象。活体观察一般采用Fluc基因,这种酶催化荧光素的氧化发光反应需要ATP和氧气的存在,因此只在活细胞内才产生发光现象,而且光
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