第八讲 酶工程在医药工业中的应用

1、主要(zhyo)讲授内容一、固定化酶(细胞)的制备二、固定化酶(细胞)的性质和指标(zhbio)三、固定化酶和固定化细胞的反应器四、酶工程在医药工业中的应用共五十页酶促反应的专一性强，反应条件温和。酶工程的优点是工艺简单、效率高、生产成本低、环境污染小，而且产品收率(shu l)、纯度高，还可制造出化学法无法生产的产品。以下重点介绍固定化酶技术在制药工业中生产抗生素、核苷酸和氨基酸的应用。共五十页1. 固定化细胞(xbo)法生产6-氨基青霉烷酸 2. 固定化酶法生产5-复合单核苷酸 3. 固定化酶法生产L-氨基酸共五十页1. 固定化细胞(xbo)法生产6-氨基青霉烷酸青霉素G (或V)经青霉素

2、酰化酶作用，水解除去侧链后的产物(chnw)称为6-氨基青霉烷酸(6-APA)，也称无侧链青霉素。共五十页6-APA是生产半合成(hchng)青霉素的最基本原料，到目前为止，以6-APA为原料已合成近3万种衍生物，并已筛选出数十种耐酸、耐酶、低毒及具有广谱抗菌作用的半合成青霉素。 共五十页1技术(jsh)路线固定化细胞法生产6-氨基(nj)青霉烷酸的技术路线 共五十页2工艺(gngy)过程(1) 大肠杆菌培养(piyng) (2) Ecoli 固定化 (3) 固定化Ecoli反应堆制备 (4) 转化反应 (5) 6-APA的提取 共五十页青霉素酰化酶转化(zhunhu)流程图1. 酶反应器；2

3、pH凋节罐；3热水(r shu)罐；4碱液罐；5. 热水循环泵；6裂解液循环泵； 7流量计；8. 自动pH计；9自动记录温度计；10酶反应器温度计共五十页大肠杆菌(d chn n jn)培养 斜面培养基：普通肉汁琼脂培养基；发酵培养基：蛋白(dnbi)胨2，NaCl 0.5，苯乙酸0.2，自来水配制。用2mol/L NaOH 溶液调pH 7.0，在55.16 kPa压力下灭菌30 min后备用。 共五十页将斜面接种后培养1830 h的EColi D816 (产青霉素酰化酶)，用15 mL无菌水制成菌细胞悬液；取1 mL悬浮液接种至装有30mL发酵培养基的三角烧瓶（250 mL）中，在摇床上28

4、，170 r/min振荡培养15 h，如此(rc)依次扩大培养，直至1 0002 000 L。共五十页规模通气搅拌培养。培养结束后用高速管式离心机离心收集(shuj)菌体，备用。共五十页Ecoli 固定化 取E. coli 湿菌体100 kg，置于40反应罐中，在搅拌下加入50 L 10明胶溶液，搅拌均匀后加入25戊二醛5L，再转移至搪瓷盘中，使之成为35cm厚的液层，室温放置2 h，再转移至4冷库(lngk)过夜；共五十页待形成固体凝胶块后，通过粉碎和过筛，使其成为直径为2 mm左右的颗粒状固定化Ecoli细胞(xbo)，用蒸馏水及pH7.5、0.3 mol/L磷酸缓冲液先后充分洗涤，抽干，

5、备用。共五十页固定化EColi 反应堆制备(zhbi) 生物反应堆：将酶或细胞(xbo)进行固定化处理，再将固定化酶或细胞(xbo)装填于适当反应器中制成的填充式反应器。共五十页将上述充分洗涤后的固定化EColi 细胞(产青霉素酰化酶)装填于带保温(bown)夹套的填充床式反应器中，即成为固定化Ecoli 反应堆（反应器规格为70 cm160 cm）。共五十页转化(zhunhu)反应 取20 kg青霉素G(或V)钾盐，加入到1 000 L配料(pi lio)罐中，用0.03 mol/L、pH7.5的磷酸缓冲液溶解并使青霉素钾盐浓度为3，用2mol/ L NaOH溶液调pH至7.57.8； 共五

6、十页然后，将反应器及pH调节罐中反应液温度升到40，维持反应体系的pH在7.57.8范围内，以70 L/min流速使青霉素钾盐溶液通过固定化 EColi 反应堆进行循环转化(zhunhu)，直至转化(zhunhu)液pH不变为止。循环时间一般为34 h。反应结束后，放出转化液。共五十页6-APA的提取(tq) 上述转化液经过滤澄清后，滤液用薄膜浓缩器减压(jin y)浓缩至100L左右；冷却至室温后，于250 L搅拌罐中加50 L 醋酸丁酯充分搅拌提取1015 min（萃取）； 共五十页取下层水相，加1 g/mL活性炭于70搅拌脱色30 min，滤除活性炭；滤液用6 mol/L盐酸调pH至4.

7、0左右(zuyu)，5放置结晶过夜；次日滤取结晶，用少量冷水洗涤，抽干，115烘23h，得成品6-APA。按青霉素G计，收率一般为7080。 共五十页2. 固定化酶法生产(shngchn)5-复合单核苷酸4种5-复合单核苷酸注射液可用于治疗白血球下降、血小板减少及肝功能失调等疾病(jbng)。核糖核酸(RNA)经5-磷酸二酯酶作用可分解为腺苷、胞苷、尿苷及鸟苷的一磷酸化合物，即AMP、CMP、UMP，及GMP。 共五十页5-磷酸二酯酶存在于桔青霉细胞、谷氨酸发酵菌细胞及麦芽根等生物(shngw)材料中。实验以麦芽根为材料制取5-磷酸二酯酶，并使其固定化后用于水解酵母RNA，以生产5-复合单核苷

8、酸注射液。共五十页RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子核苷酸之间的连结(lin ji)方式：3,5-磷酸二酯键生产(shngchn)5-复合单核苷酸共五十页1技术(jsh)路线固定化酶法生产(shngchn)5-复合单核苷酸的技术路线 共五十页2工艺(gngy)过程(1) 5-磷酸二酯酶的制备 (2) 固定化5-磷酸二酯酶的制备 (3) 转化反应 (4) 5-复合单核苷酸的分离纯化(chn hu) (5) 精制及灌封 共五十页5-磷酸二酯酶的制备(zhbi) 取干麦芽根，加910倍体积(W/V)的水，用2 mol/L HCl调pH至5.2，于30条件(tiojin)下浸泡1520h，然

9、后加压去渣，浸出液过滤，滤液冷却至5，加入2.5倍体积(V/V)的95冷工业乙醇(5)，于5静置23h后，吸去上层清液，回收乙醇，下层离心收集沉淀，用少量丙酮及乙醚先后洗涤23次，真空干燥，粉碎得5-磷酸二酯酶。共五十页固定化5-磷酸二酯酶的制备(zhbi) 取上述磷酸二酯酶0.2 kg(控制(kngzh)固定化后的固定化酶比活力在100 U/g以上为宜)，用1.5的(NH4)2SO4溶液溶解，过滤得酶液。另取湿ABXE纤维素树脂40 kg，加入05的蒸馏水至80 L，搅拌下先后加入1mol/L HCl和5NaNO2溶液各10 L，搅拌均匀，于05下反应150 min后，抽滤；共五十页滤饼迅速

10、用预冷的0.05mol/L HCl和蒸馏水各洗3次，抽干后将滤饼投入上述5-磷酸二酯酶溶液中，搅拌(jiobn)均匀后用1mol/L Na2CO3溶液调pH8.0，搅拌反应30min，用冷水洗34次，抽干，得固定化5-磷酸二酯酶。共五十页转化(zhunhu)反应 取2kg RNA，缓慢加入预热至6070的360 L pH5.0的10-3mol/L ZnCl2溶液中，用1mol/L NaOH溶液调至pH5.05.5，滤除沉淀，将清液升温至70，加入上述湿的固定化5-磷酸二酯酶40 kg(要求酶的比活在100U/g以上)，于67维持(wich)pH5.05.5，搅拌反应12 h。共五十页根据增色效

11、应，用紫外吸收法判断转化平衡点。转化完成(wn chng)后，滤出转化液，用于分离5-单核苷酸。固定化酶再继续用于下一批转化反应。共五十页5-复合单核苷酸的分离(fnl)纯化 将上述转化液用6mol/LHCl溶液(rngy)调pH至3.0，滤除沉淀，滤液用6mol/LNaOH溶液调pH至7.0，进入已处理好的Cl-型阴离子交换树脂柱(30cm100cm)，流速为22.5 L/min，吸附后，用250300L去离子水洗涤柱床; 共五十页然后用3 NaCl溶液以l1.2L/min流速洗脱，当流出液pH达到7.0时开始分部(fn b)收集，直至洗脱液中不含核苷酸为止，合并含核苷酸钠的洗脱液进行精制。

12、共五十页 精制(jngzh)及灌封 上述核苷酸钠溶液用薄膜浓缩器减压(jin y)浓缩后，测定核苷酸含量，再用无热原质水稀释至20 mg/mL，加入0.51.0(g/mL)药用活性炭，煮沸10min脱色和除热原，滤除活性炭，滤液经6号除菌漏斗或0.45 m孔径的微孔滤膜过滤除菌后灌封，即为5-复合单核苷酸注射液。共五十页热原质(yun zh)热原质是在生产过程中由于被污染后由杂菌所产生的一种内毒素。各种杂菌所产生的热原反应(fnyng)有所不同。革兰氏阴性菌产生的热原反应(fnyng)一般比革兰氏阳性菌的为强。 共五十页热原注入体内引起(ynq)恶寒高热，严重的引起(ynq)休克。它是多糖磷类

13、脂质和蛋白质的结合体，为大分子有机物质，能溶于水。在280加热4h它能被破坏90%；共五十页180200加热(ji r)半小时或150加热2h能被彻底破坏。它亦能被强酸、强碱、氧化剂(如高锰酸酸钾)等破坏。它能通过一般滤器，但能被活性炭、石棉滤材等所吸附。共五十页生产中常用活性炭脱色去除(q ch)热原，但须注意脱色时pH，温度、炭用量及脱色时间等因素，还应考虑它对抗生素的吸附问题，否则会影响抗生素的产量；共五十页此外，对某些产品可用超微过滤办法去除热原，还应加强在生产(shngchn)过程中的环境卫生以防止热原。 共五十页3. 固定化酶法生产(shngchn)L-氨基酸目前氨基酸在医药、食品

14、以及工农业生产(shngchn)中的应用越来越广。以适当比例配成的混合液可以直接注射到人体内，用以补充营养。各种必需氨基酸对人体的正常发育有保健作用，有些氨基酸还可以作为药物，治疗某些特殊疾病。共五十页工业上生产L-氨基酸的一种方法(fngf)是化学合成法。但是由化学合成法得到的氨基酸都是无光学活性的D/L-外消旋混合物，所以必须将它进行光学拆分，以获得L-氨基酸。共五十页外消旋氨基酸拆分的方法(fngf)有物理化学法、酶法等，其中以酶法最为有效，能够产生纯度较高的L-氨基酸。 共五十页酶法生产(shngchn)L-氨基酸的反应式 氨基酰化酶拆分D/L-氨基酸外消旋混合物 共五十页N-酰化D/

15、L-氨基酸经过氨基酰化酶的水解得到L-氨基酸和未水解的N-酰化D-氨基酸，这两种产物的溶解度不同，因而很容易分离。未水解的N-酰化-D-氨基酸经过外消旋作用后又成为(chngwi)D/L-型，可再次进行拆分。 共五十页制得的固定化氨基酰化酶活性高，稳定性好，可用于连续拆分酰化-DL-氨基酸。具体制备方法(fngf)如下：共五十页固定化酶的制备(zhbi)将预先用pH 7.0、0.1mol/L磷酸缓冲液处理的DEAE-葡聚糖A-25溶液1 000 L，在35下与11001700 L的天然氨基(nj)酰化酶水溶液(内含33400万单位的酶)一起搅拌10 h，过滤后，得DEAE-葡聚糖-酶复合物，再

16、用水洗涤。所得固定化酶的活性可达16.7万20.0万单位/L，活性得率为5060。 共五十页用此法制得的固定化氨基酰化酶，可以装柱连续拆分D/L型外消旋氨基酸。生产(shngchn)不同的L-氨基酸，加入底物酰化-DL-氨基酸要控制的流速也不同。 共五十页DEAE-葡聚糖-氨基酰化酶酶柱的操作稳定性很好，半衰期可达65天。在长期使用之后，酶柱上的酶可能(knng)有部分脱落，由于酶柱是由离子交换法将酶固定得到，因此再生十分容易，只要加入一定量的游离氨基酰化酶，酶柱便能完全活化。共五十页用固定化酶连续生产L-氨基酸，产物的纯化(chn hu)较简单，收率也比游离酶法要高，因此生产单位量L-氨基酸所需要的底物量较少。固定化氨基酰化酶非常稳定，用于酶的费用大大减少。共五十页固定化氨基酰化酶酶柱的生产工艺还可以自动控制，这样不仅改善了劳动强度，而且大