盐酸小檗碱对体外培养人牙周膜细胞炎性反应影响的初步分析

1、盐酸小檗碱对体外培养人牙周膜细胞炎性反应影响的初步分析刘 鑫1，贾 艳2，张 莉2，董天贞2，邓蔓菁2*（1、重庆市第三人民医院科教处 重庆 400014；2、第三军医大学附属第三医院野战外科研究所口腔科 重庆 400042）【摘要】目的：研究盐酸小檗碱（Ber）作用于体外培养的人牙周膜细胞（PDLCs），在脂多糖（LPS）刺激下，合成和分泌前列腺素E2（PGE2）、白细胞介素-1（IL-1）和白细胞介素-6（IL-6）的变化，初步推断Ber对牙周炎的治疗作用。方法：将体外培养的PDLCs根据加入LPS与否设定为NLPS和LPS两大组，再根据培养液中Ber终浓度0g/mL、5g/mL、10g/

2、mL和20g/mL将其分为NLPS0、NLPS1、NLPS2、NLPS3以及LPS0、LPS1、LPS2和LPS3共八个组，用ELISA法检测上清液中PGE2、IL-1和IL-6的浓度。结果：培养48h后，各组PGE2、IL-6和IL-1有一定的表达量，NLPS各组该三者表达的差异无统计学意义（P0.05）；加入LPS后， LPS0组上清液中PGE2、IL-1和IL-6表达明显升高，与NLPS各组之间差异具有统计学意义（P0.05）；在加入LPS的同时加入Ber后与LPS0组比较PGE2、IL-1和IL-6表达明显下降（P0.05）；PGE2表达，LPS各组差异具有统计学意义（P0.05），其

3、中除LPS3以外，其他LPS组与NLPS各对应组差异具有统计学意义（P0.05）；IL-1表达， LPS0与其他LPS组差异有统计学意义（P0.05），而LPS1、LPS2和LPS3之间差异无统计学意义（P0.05），且该三组与NLPS对应组之间差异无统计学意义（P0.05）；IL-6表达，随着Ber浓度升高，各LPS组表达逐渐降低（P0.05），且与对应NLPS组差异有统计学意义（P0.05）。结论：Ber可以抑制LPS刺激体外培养的PDLCs产生的炎性反应。【关键词】盐酸小檗碱；牙周膜细胞；前列腺素E2；白细胞介素-1；白细胞介素-6Preliminary Analysis on the

4、Inflammatory Response of Cultured Human Periodontal Ligament Cells in Vitro under the Effect of Berberine hydrochlorideLIU Xin1,JIA Yan2,ZHANG Li2,DONG Tianzhen2,DENG Manjing2*(1.Department of Science and Education, the Third Peoples Hospital of Chongqing,Chongqing, 400014;2. Department of Stomatolo

5、gy, Institute of Surgery Research, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042) 基金项目重庆市自然科学基金(2011BA5013)作者简介刘鑫，男，硕士，主治医师，主要从事口腔内科学临床及基础研究。E-mail:ares_通讯作者邓蔓菁，E-mail:Abstract Objective To evaluate the effect of Berberine hydrochloride (Ber) on periodontitis by detecting the

6、changes in concentration of prostaglandin E2 (PGE2）, interleukin-1 (IL-1) and interleukin-6 (IL-6)，which were expressed by human periodontal ligament cells (PDLCs) in vitro after simulated by lipopolysaccharide (LPS). Methods The PDLCs cultured in vitro were Divided into NLPS groups and LPS groups,

7、then each group were further divided into four subgroups (NLPS0, NLPS1, NLPS2 and NLPS3; LPS0, LPS1, LPS2 and LPS3), according to their different concentration (0g/mL, 5g/mL,10g/mL and 20g/mL) of Ber added. And then detected the concentrations of PGE2, IL-1 and IL-6 in the subgroups by ELISA. Result

8、s PGE2, IL-1 and IL-6 were detected in every subgroup after 48h. There was no statistically difference about the expressions of PGE2, IL-1and IL-6 among each NLPS groups（P0.05）. Compared with NLPS groups, the expressions in LPS0 increased（P0.05）. However, after adding Ber, the expressions reduced in

9、 LPS groups（P0.05）. There were statistically differences in expressing PGE2 among each LPS groups（P0.05）. Except LPS3 , no significant differences were recorded among each corresponding LPS and NLPS groups（P0.05）. In expressing IL-1, there were statistically difference between the LPS0 and the other

10、 LPS groups（P0.05）.However, there was no statistically difference among LPS1, LPS2 and LPS3 groups（P0.05）;and no statistically difference were found among these three groups and corresponding NLPS groups,too（P0.05）. The expressions of IL-6 in each LPS groups were reduced along with adding Ber（P0.05）

11、and there were statistically difference among each corresponding LPS and NLPS groups（P0.05）. Conclusions Ber can inhibit the LPS-stimulated imflammatory responses generated by PDLCs in vitro. Key Words Berberine hydrochloride; Periodontal ligament cells; Prostaglandin E2; Interleukin-1; Interleukin-

12、6Supported by “Natural Science Foundation of Chongqing” (2011BA5013). Corresponding author: Deng Manjing, E-mail: 牙周病是由牙周致病菌引起，宿主通过免疫防御系统与牙周致病菌及其产物相互作用而导致的疾病。多种炎性介质和细胞因子参与了牙周病的发生和发展过程，如白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)分泌增多时会产生明显的致炎作用1。人牙周膜细胞(periodontal ligament cells，PDLCs)是牙周

13、组织中合成分泌IL-1和IL-6的重要细胞，在受到细菌刺激时，合成和分泌IL-1与IL-6的能力增强2。前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）是一种极其重要的脂质代谢产物,在受到生理或病理的各种刺激,尤其是有害刺激时被释放,在发热、炎症和血压调节中均发挥着重要作用3。盐酸小檗碱（Berberine hydrochloride,Ber）最初作为清热解毒药和抗菌药应用于临床，能抑制各类急慢性炎症,对心血管系统、血糖、肿瘤及肝脏等多方面具有药理作用，且毒副作用较小3。为探讨该药对于PDLCs的炎性反应是否具有抑制作用，本研究以体外培养的PDLCs和Ber作为研究对象，利用脂多糖（

14、lipopolysaccharide，LPS）刺激PDLCs产生炎性反应，观测PDLCs培养上清液中的炎性因子PGE2、IL-1和IL-6的变化，根据其表达的升高或降低做为炎性反应增强或抑制的指标，以期为Ber做为临床治疗牙周病药物提供实验依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞来源 样本采自12岁18岁青少年因正畸需要而拔除的无龋、无牙周病前磨牙，均征得患者本人及其家长同意并签署知情同意书。牙齿拔出后，立即置于含双抗(青霉素100U/mL，链霉素100g/mL ) 的无菌D-Hanks液中，在洁净工作台内用无血清DMEM冲洗牙根部遍，刮取根中1/3的牙周膜组织。1.1.2 主要试剂

15、Ber 98%（成都思科华生物技术有限公司）；D-Hanks缓冲液（自配，含100U/mL青霉素，100g/mL链霉素）；DMEM 培养基( Gibco )，RPMI -1640培养液、胰蛋白酶（Gibco,USA）；胎牛血清优等品（Fetal bovine serum FBS，美国Gibio 公司）；脂多糖 LPS （Sigma，USA）；特异性人PGE2 ELISA检测试剂盒（UCL,USA）；IL-1双抗夹心ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；IL- 6双抗夹心ELISA试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)；二氧化碳细胞恒温培养箱（Forma Scientic，USA）；CKC-

16、TR-2W型倒置显微镜（Olympus，Japan）；酶联免疫检测仪（Labsystems dragon MK3，Finland）；YJ-875型超净化工作台(苏州净化设备厂)；96孔培养板(北京中杉金桥生物技术有限公司)；波形丝蛋白、角蛋白一抗及即用型SABC试剂盒（博士德公司）。1.2 实验方法1.2.1 PDLCs的体外培养、分离纯化及鉴定采集的牙周膜组织稍加修剪，放入直径3.5 cm培养皿中，加入少量含20胎牛血清的DMEM培养液，让液体缓慢湿润组织块，防止组织块漂动，将盖玻片缓慢覆盖于组织块上，使培养液充盈于盖玻片与组织块之间，添加培养液lmL2 mL后，置培养箱培养。倒置显微镜下观

17、察细胞的游出及生长情况；待细胞长满瓶底面积85时，用2.5gL胰蛋白酶消化传代。取第3代对数生长期PDLCs，用SABC法进行波形丝蛋白、角蛋白免疫组织化学染色，鉴定细胞来源。1.2.2 Ber对LPS刺激PDLCs产生炎症反应的抑制作用的研究将经鉴定的细胞浓度为2105 /mL的PDLCs细胞悬液接种于96孔培养板，每孔体积1.5mL。在37、5%CO2孵箱中孵育48h，弃原培养液，PBS清洗2次后分别加药。以含20%胎牛血清RPMI-1640培养基培养细胞做为对照，定为NLPS组。炎症细胞组培养条件为含20%胎牛血清、含有LPS，定为LPS组。然后，两组又根据培养液中Ber的终浓度再各分四

18、组，分别为LPS0和NLPS0(空白对照组，DMEM培养液中只含20胎牛血清，无Ber)，LPSl和NLPSl组(DMEM培养液中含5g/mL Ber) ，LPS2和NLPS2组(DMEM培养液中含10g/mL Ber) 及LPS3和NLPS3组(DMEM培养液中含20g/mL盐酸小檗碱) 。每个浓度设4个复孔，每孔体积100l。置于37、5%CO2孵箱中孵育48h后，倒置显微镜下观察细胞形态。吸取上清液于EP管中，2000r/min 离心5 min，用ELISA法检测上清液中PGE2、IL-1和IL-6的浓度。1.2.3 统计学处理:用SPSS 13.0软件包进行统计分析. 实验数据以s表示

19、，多组均数的比较采用单因素方差分析，两两之间比较用LSD-t检验，检验水准=0.05。2 结果2.1 体外培养的第三代PDLCs体外培养第三代PDLCs，其细胞形态多为长梭形或星形，胞浆突24个，胞浆丰满；细胞核为1个，呈椭圆或圆形，细胞密度较低时细胞交织成网状, 密度较高时细胞排列成“束状”或“旋涡状”（图2）。图1 体外培养的第三代PDLCs（倒置相差显微镜 400）2.2 PDLCs的鉴定经SABC法染色鉴定培养细胞表现为波形丝蛋白染色阳性（图2），细胞胞质棕黄色着色；角蛋白染色阴性，胞质不着色，说明细胞来源于中胚层，为结缔组织源性细胞。（图3）图2 PDLCs波形丝蛋白染色阳性（SAB

20、C 400）图3 PDLCs角蛋白染色阴性（SABC 400）2.3 Ber对LPS刺激PDLCs炎性反应的抑制作用结果各组PDLCs分泌表达PGE2、IL-1和IL-6比较见表2。本研究中，PDLCs在含20%胎牛血清的培养基中，培养48h后，上清液中PGE2、IL-1和IL-6有一定的表达量，但NLPS各组PGE2、IL-1和IL-6表达的差异无统计学意义（P0.05）。加入LPS 48h后， LPS0组上清液中PGE2、IL-1和IL-6表达明显升高，与NLPS各组之间差异具有统计学意义（P0.05）。在加入LPS的同时加入Ber培养48h后与LPS0组比较PGE2、IL-1和IL-6表

21、达明显下降，差异具有统计学意义（P0.05）；PGE2表达，LPS各组差异具有统计学意义（P0.05），其中除LPS3以外，其他LPS组与NLPS各对应组差异具有统计学意义（P0.05）；IL-1表达， LPS0与其他LPS组差异有统计学意义（P0.05），而LPS1、LPS2和LPS3之间差异无统计学意义（P0.05），且该三组与NLPS对应组之间差异无统计学意义（P0.05）。IL-6表达，随着Ber浓度升高，各LPS组表达逐渐降低（P0.05），且与对应NLPS组差异有统计学意义（P0.05）。表1 各组PDLCs分泌表达PGE2、IL-1和IL-6比较表组别PGE2（g/L）IL-1（

22、g/L）IL-6（ng/L）NLPSNLPS08.781.985.391.04216.272.03NLPS18.612.115.411.43215.072.31NLPS28.801.835.471.31218.301.15NLPS38.692.055.401.12215.533.98LPSLPS022.501.24 a7.740.27 a857.4353.88 aLPS118.281.44 a,b5.790.33696.3732.46 a,bLPS212.141.35a,b5.740.50508.42 29.74 a,bLPS38.791.165.670.81361.5247.22 a,b注：

23、a：与NLPS0组比较，P0.05；b：与对应NLPS组比较，P0.053 讨论3.1 实验设计分析本实验将牙周膜组织进行培养，采用混合酶消化和差速贴壁的方法分离纯化PDLCs，通过形态观察以及波丝蛋白染色观察，证实得到的细胞形态及功能正常。余占海4等选择Ber的浓度为5g/mL、10g/mL、20g/mL、30g/mL、40g/mL分别作用于PDLCs，结果表明：在48h时5g/mL30g/mL浓度组对细胞有促进其增殖作用；72h时，10g/mL20g/mL浓度组均能明显增强人牙周膜细胞增殖能力。因此，本实验选择5g/mL、10g/mL、20g/mL浓度作用于LPS处理后的细胞。LPS作为一

24、种外源性的可以诱导细胞产生炎性反应的成分，可刺激大多数真核细胞发生形态、代谢、基因、蛋白表达等方面的改变，导致细胞内细胞因子发生变化，介导各种炎症相关疾病的发生、发展，其作用机制被认为其与细胞膜上的特异受体CD14及toll样受体4结合后通过多条信号转导通路诱导炎性因子的合成5,6。在牙周炎症发生的过程中，PDLCs由于LPS 的诱导可产生多种细胞因子， 如IL-6、IL-8 、肿瘤坏死因子-( tumor necrosis factor ，TNF ) 和PGE2等介导牙周组织炎症。因此，本实验以体外培养的PDLCs做为研究对象，以LPS做为PDLCs的炎性刺激因素，观察Ber对LPS刺激下P

25、DLCs炎性反应的抑制作用。3.2 实验结果分析。 通过本研究发现，在正常培养的PDLCs细胞上清液中也有PGE2 、IL-1和IL-6的表达，在加入LPS刺激之后，其上清液中三者的含量明显增加，说明LPS能够刺激PDLCs细胞产生炎性反应。而同时加入Ber和LPS后培养的细胞，其上清液中PGE2、IL-1和IL-6的分泌表达较LPS组明显降低，说明Ber抑制了炎性细胞因子的表达。终浓度为5g/mL和 20g/mL Ber就分别将IL-1和PGE2的表达抑制在正常水平，而20g/mL Ber仍未将IL-6抑制到正常水平。PGE2是一种众所熟知的炎性因子，通过4种功能相互拮抗的的受体（E-pro

26、stanoid receptors,EP1、EP2、EP3和EP4）而广泛参与机体及细胞代谢过程，而近来的研究表明，PGE2很可能在免疫细胞的发育分化及免疫应答过程中也起重要作用7。本研究中，受LPS刺激后，PGE2明显增加，加入Ber后其表达受到抑制，而Ber终浓度为20g/mL即达到正常水平。有研究表明8，IL-1能诱导机体产生PGE2、IL-2等炎性介质，诱导破骨细胞进行骨吸收。本研究中，受LPS刺激后，IL-1表达明显增加，但仅需终浓度为5g/mL Ber即将其表达抑制在正常水平。IL-6 是一种多功能细胞因子，在体内具有广泛的生物学效应，是构成机体细胞因子网络的重要成员，主要由单核巨

27、噬细胞、 Th2细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞产生，参与局部炎性反应9。本研究中，受LPS刺激后，IL-6表达明显增加， 5g/mL、10g/mL和20g/mL Ber即将其表达抑制，且随着浓度的增高，抑制作用越明显，但均未将其抑制到正常水平。至于需要到达何种浓度才可以同时将三者同时抑制在正常水平，这在今后的研究中可以通过设置更多浓度组予以研究证明。上述细胞因子在牙周组织的局部炎症破坏中均具有重要的作用，因此在一定程度上，PGE2、IL-1和IL-6表达的增加或降低预示着炎性反应的扩大或抑制。通过本研究，我们可以初步认为，Ber可以抑制LPS刺激PDLCs产生的炎性反应，进而推论Ber在对抗牙

28、周炎症反应中可能具有重要的作用，但其具体机制有待进一步研究，而其理想药物浓度也可通过进一步结合动物和体内实验进行研究确定。参 考 文 献1 HYPERLINK /pubmed?term=%22Lin%20SJ%22%5BAuthor%5D Lin SJ, HYPERLINK /pubmed?term=%22Chen%20YL%22%5BAuthor%5D Chen YL, HYPERLINK /pubmed?term=%22Kuo%20MY%22%5BAuthor%5D Kuo MY,et al. Measurement of gp130 cytokines oncostatin M and

29、IL-6 in gingival crevicular fluid of patients with chronic periodontitisJ. Cytokine, 2005, 30(4):160-167.2 Yamamoto T,Kita M,Oseko F,et a1.Cytokine production in human periodontal ligament cells stimulated with Porphyromonas gingivalisJ.J Periodont Res,2006,41(6):554-559.3 薛瑞,苗一非,杨吉春,等. 前列腺素E2对免疫细胞及炎症相关疾病的调控作用J.生理科学进展,2011,42(3):165-168.4 余占海,张国英,张小恒,等. 盐酸小檗碱对体外培养人牙周膜细胞生物活性的影响J. 实用口腔医学杂志,2007,23(5):637-640.5 HYPERLINK /pubmed?term=%22Hormdee%20D%22%5BAuthor%5D Hormdee D, HYPERLINK /pubm