第09章DNA生物合成

1、第09章DNA生物合成复制(replication) 是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNA本章主要内容： 复制的基本规律 DNA复制的酶学和拓扑学变化 复制的过程 逆转录和其他复制方式 DNA损伤（突变）与修复复制的基本规律Basic Rules of DNA Replication第 一 节复制的方式 半保留复制(semi-conservative replication)双向复制(bidirectional replication)半不连续复制(semi-discontinuous replication) 复制的基本规律 一、半保留复制是D

2、NA复制的基本特征 DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念:AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的

3、复制叉子代DNA子链继承母链遗传信息的几种可能方式: 全保留式 半保留式 混合式 密度梯度实验: 实验结果支持半保留复制的设想。含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液 第一代继续培养于普通培养液 第二代梯度离心结果按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义:遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。 二、DNA复制从起始点向两个方向延伸形成双向复制复制中的放射自显影图像A. 环状双链DNA及复制起始点

4、B. 复制中的两个复制叉C. 复制接近终止点(termination, ter)oriterA B C真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。 53oriorioriori5353oriorioriori535533553复制3三、DNA一股子链复制的方向与解链方向相反导致半不连续复制3535解链方向35335领头链(leading strand)随从链(lagging strand)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(leading strand) 。另一股

5、链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链(lagging strand) 。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。 DNA复制的酶学和拓扑学变化第 二 节The Enzymology and Topology of DNA Replication参与DNA复制的物质:底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP；聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol；模板(template): 解开成单链

6、的DNA母链；引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。一、核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键是复制的基本化学反应(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi聚合反应的特点:DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 3方向进行。二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-pol活性：1. 53 的聚合活性2. 核酸外切酶活性 3 5外切酶活性 5 3外切酶活性 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | |

7、| | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 53 5外切酶活性:5 3外切酶活性:?能切除突变的 DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性: （一）原核生物的DNA聚合酶分为三型DNA-pol DNA-pol DNA-pol 原核生物的DNA聚合酶功能：DNA-pol （109kD）对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。323个氨基酸小片段5 核酸外切酶活性大片段/Klenow 片段 604个氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性N 端C 端木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成DNA，

8、进行分子生物学研究中常用的工具酶。 DNA-pol （120kD）DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。DNA-pol 对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。功能：DNA-pol (250kD)是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有五种DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 真核

9、生物的DNA聚合酶三、核酸外切酶的校读活性和碱基选择功能是复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。 遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：（二）核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)

10、是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。 A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。DNA pol 的校读功能四、复制中的分子解链伴有DNA 分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。 （一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保

11、护单链的完整。拓扑异构酶 理顺DNA链，避免出现超螺旋。引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶。 DNA聚合酶 （原核）复制时延长子链。 RNA酶 水解RNA引物。 DNA聚合酶 填补引物空隙。 DNA连接酶 连接冈崎片段。108局部解链后（二）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链复制过程正超螺旋的形成：解链过程中正超螺旋的形成既能水解 、又能连接磷酸二酯键。 拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶分类：拓扑异构酶作用特点：拓扑异构酶切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶切断DNA分子两股链

12、，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制：拓扑酶的作用方式：解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。拓扑异构酶 理顺DNA链，避免出现超螺旋。引物酶(primase) 复制起始时催化生成RNA引物的酶。 DNA聚合酶 （原核）复制时延长子链。 RNA酶 水解RNA引物。 DNA聚合酶 填补引物空隙。 DNA连接酶 连接冈崎片段。五、DNA连接酶连

13、接DNA双链中的单链缺口连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。 DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：HO5335DNA连接酶ATPADP5353DNA连接酶的作用：DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：提供核糖3-OH提供5-P结果DNA聚合酶引物或延长中的新链游离dNTP去PPi(dNTP)n+1连接酶复制中不连续的两条单链不连续连续链拓扑酶切断、整理后的两链改变拓扑状态DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生

14、成的比较 DNA生物合成过程The Process of DNA Replication第 三 节（一）复制起始：DNA解链形成引发体需要解决两个问题：1. DNA解开成单链，提供模板。2. 形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。一、原核生物的DNA生物合成复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列 反向重复序列53531. DNA解链 Dna A

15、Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶引物酶SSB35352. 引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物3 HO5引物酶（二）复制的延长过程：领头链连续复制，随从链不连续复制复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。 5 35dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33DNA-pol领头链的合成：领头链的子链沿着53方向可以连续地延长。随从链的合成同一复制叉上领头链和随从链由相同的D

16、NA-pol催化延长 阶段一阶段二阶段三阶段四复制过程简图原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。oriter E.coli8232 ori terSV40500（三）复制的终止过程：切除引物、填补空缺、连接切口555RNA酶OHP5DNA-pol dNTP55PATP ADP+Pi55DNA连接酶 随从链上不连续性片段的连接：哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM二、真核生物的DNA生物合成细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。 真核生物每个染

17、色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 复制的起始需要DNA-pol （引物酶活性）和pol （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 （一）真核生物复制的起始与原核基本相似增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作用。PCNA为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚合酶的亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物模板链；并且PCNA使pol获得持续合成能力。

18、PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白(cyclin)，和催化亚基即细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin dependent kinase，CDK)。 CDK相匹配的周期蛋白作用点CDK2Cyclin D1, D2, D3G1期Cyclin EG1S期Cyclin AS期CDK3和CDK4Cyclin D1, D2, D3G2期CDK1（CDC2）Cyclin A, BG2M期哺乳类动物的周期蛋白和CDK哺乳类动物

19、细胞内还发现天然抑制CDK的蛋白质，例如锚蛋白(ankynin)是CDK4的特异性抑制物，P21蛋白能抑制多种CDK。锚蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使细胞周期开放/关闭，因此被形容为细胞周期的检查点(check point)蛋白。 DNA-pol 和pol 分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol 通过PCNA的协同作用，逐步取代pol ，在RNA引物的3-OH基础上连续合成领头链。随从链引物也由pol 催化合成。然后由PCNA协同，pol 置换pol ，继续合成DNA子链。 （二）真核生物复制的延长发生DNA聚合酶/转换3553领头链3535亲代DNA随从链引物核

20、小体真核生物复制叉的延长： 染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）端粒酶参与解决染色体末端复制问题53355335+5333355切除引物的两种机制线性DNA复制的末端 端粒(telomere) 指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。端粒的功能：维持染色体的稳定性维持DNA复制的完整性端粒的结构特点：由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒酶(telomerase)端粒酶RNA (human telomera

21、se RNA, hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 组成：端粒酶催化作用的爬行模型 逆转录和其他复制方式Reverse Transcription & Other DNA Replication Ways第四节双链DNA是大多数生物的遗传物质。某些病毒的遗传物质是RNA。少数低等生物如M13噬菌体，它的感染型只含单链DNA。原核生物的质粒，真核生物的线粒体DNA，都是染色体外存在的DNA。这些非染色体基因组，采用

22、特殊的方式进行复制。逆转录酶(reverse transcriptase) 逆转录(reverse transcription) 逆转录酶一、逆转录病毒的基因组是RNA，其复制方式是逆转录RNADNA逆转录病毒细胞内的逆转录现象:RNA 模板逆转录酶DNA-RNA杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNARNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组(recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病

23、毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因。 分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。 以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。 试管内合成cDNA:cDNA complementary DNA逆转录酶 A AA A T T T TAAAASI核酸酶 DNA聚合酶碱水解 T T T T二、逆转录的发现发展了中心法则逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。 滚环复制(rolling c

24、ircle replication)三、噬菌体DNA按滚环方式复制和线粒体DNA按D环方式复制是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。3-OH5-P55533335滚环复制55335dNTPDNA-pol D环复制(D-loop replication) 是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。 D-环复制时需合成引物。mtDNA为双链，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状DNA的复制。复制中呈字母D形状而得名。D环复制的特点是复制起始点不在双链DNA同一位点

25、，内、外环复制有时序差别。DNA损伤（突变）与修复DNA Damage (Mutation) & Repair第五节DNA突变具体指个别dNMP残基以至片段DNA在构成、复制或表型功能的异常变化，也称为DNA损伤(DNA damage)。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。 一、突变在生物界普遍存在（一）突变是进化、分化的分子基础从长远的生物史看，进化过程是突变的不断发生所造成的。大量的突变都是属于这种类型，只是目前还未能认识其发生的真正原因，因而名为自发突变或自然突变(spontaneous mutation)。（二）只有基因型改变的突变形成DNA的多态性这种突变没有可察觉的表型

26、改变，例如在简并密码子上第三位碱基的改变，蛋白质非功能区段上编码序列的改变等。这些现象也相当普遍。多态性(polymorphism)一词用来描述个体之间的基因型差别现象。 （三）致死性的突变可导致个体、细胞的死亡 （四）突变是某些疾病的发病基础二、多种化学或物理因素可诱发突变大量的突变属于自发突变，发生频率只不过在10-9左右。但由于生物基因组庞大，细胞繁殖速度快，因此它的作用是不可低估的。实验室用来诱发突变，也是生活环境中导致突变的因素，主要有物理和化学因素。 物理因素：紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射 UV化学因素：三、引起突变的分子改变类型有多种错配 (mismatc

27、h)缺失 (deletion)插入 (insertion)重排 (rearrangement) 框移(frame-shift) DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。自发突变和不少化学诱变都能引起DNA上某一碱基的置换。点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸改变。 （一）错配可导致编码氨基酸的改变镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) 亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链CAC GTG基因正常成人Hb (HbA)亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链CTC GAG基因镰形红细胞贫血病人图10-29膀胱癌细胞c-ras H基因点突变，基因表达产物仅12号氨基酸的变异（二）缺失、插入和框移突变造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。缺失或插入都可导致框移突变 。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。 谷 酪 蛋 丝5 G C A G U A C A U G U C 丙 缬 组 缬正