扁豆凝集素的分离纯化与性质描述说明书

1、 TOC o 1-5 h z HYPERLINK l bookmark7 o Current Document 一、前言2 HYPERLINK l bookmark11 o Current Document 1.1凝集素的概念及其简介 2 HYPERLINK l bookmark14 o Current Document 1.2凝集素的分类3 HYPERLINK l bookmark23 o Current Document 1.3凝集素的国内外研究现状3 HYPERLINK l bookmark26 o Current Document 1.4凝集素的应用前景4 HYPERLINK l bo

2、okmark29 o Current Document 1.5本设计的主要研究内容包括： 6 HYPERLINK l bookmark34 o Current Document 二、扁豆凝集素的分离纯化6 HYPERLINK l bookmark38 o Current Document 2.1试验材料6 HYPERLINK l bookmark41 o Current Document 2.2试验方法72.2.1扁豆凝集素粗品的制备72.2.2扁豆凝集素的纯化7 HYPERLINK l bookmark44 o Current Document 三、扁豆凝集素的性质研究7 HYPERLINK

3、 l bookmark48 o Current Document 3.1试验材料7 HYPERLINK l bookmark51 o Current Document 3.2试验方法83.2.1扁豆凝集素的基本性质检测83.2.2扁豆凝集素的热稳定性测定83.2.3 碱稳定性测定93.2.4金属离子结合特性试验93.2.5扁豆凝集素的糖抑特性试验93.2.6扁豆凝集素的抑菌试验93.2.7扁豆凝集素的凝血活性10 HYPERLINK l bookmark67 o Current Document 参考文献12扁豆凝集素的分离纯化与性质描述一、前言1.1凝集素的概念及其简介凝集素是自然界广泛存在

4、的一大类能凝集细胞、多糖或糖复合物的非源于 免疫反应的糖蛋白，进一步被定义为非免疫球蛋白本质的蛋白质或糖蛋白，它 能够特异性识别并可逆结合复杂糖复合物中的糖链，而不改变所结合糖基的共 价结构。它们广泛存在于各种各样的生物体中，并在生命活动如病毒、细菌、 支原体和寄生虫感染、细胞和可溶性组分之间的寻靶作用、受精作用、癌细胞 转移、生长、分化中都起着重要作用。Peumans和D amme在1995年将植物凝集素定义为至少具有一个可与单糖 或寡聚糖特异可逆结合的非催化结构域的植物蛋白。在植物凝集素的研究中， 豆科植物凝集素是最早进行研究，并且研究的最充分。豆科凝集素尽管在糖结 合专一性有不同，但它们

5、在生物化学特性、一级结构组成方面显示出相似性， 并且依据一级结构顺序和x-衍射品体图谱分析表明：其糖结合区段也非常相 似。由于一个植物种族的凝集素有如此广泛的同源性，有力的揭示了这些蛋白 质的基因编码有共同的祖先。豆科凝集素经常作为凝集素研究的模式蛋白质与 其它种类相互对照。凝集素可作为一种探针，广泛的应用于糖精细结构、医学 治疗和鉴定，并在农业转基因工程方面，并有着良好的前景。有些豆科凝集素 （如PHA）具有刺激外周血淋巴细胞RNA合成和有丝分裂，诱发人外周血淋巴细胞 产生抗癌淋巴因子，促进巨噬细胞的吞噬作用，能使细胞凝集和肿瘤细胞失活 等生物学活性；而且，人食用未熟透的菜豆会引起中毒，国内

6、也经常有因食用 了未熟透的菜豆而引起中毒的报道，现在知道这是由于菜豆凝集素的作用结 果，因此对豆科凝集素的研究深受重视。凝集素是一种非常有用的工具，可用 来检测，分离复合糖（主要是糖蛋白），并进行性质研究；对细胞和组织进行组 织化学研究，检测从细胞分化到癌发生的生理和病理过程中细胞表面发生的变 化。所以对豆科植物凝集素结构、功能的进一步研究，不仅可以揭示植物凝集 素存在的其他功能，还会促进分子生物学、细胞生物学、免疫学、病理学、神 经生物学、发育生物学等学科的发展。11.2凝集素的分类21.2.1按来源分类可以分为植物凝集素，动物凝集素和微生物凝集素三类。例如，扁豆凝集 素(Lens culi

7、naris lectin，LCL)是植物凝集素素，鸡乳糖凝集素素(Chicken lactose lenin，CLL)是动物凝集素，而蘑菇凝集素素(Agaricus bisporus lectin,ABL)是真菌类的微生物凝集素。1.2.2按凝集素在细胞中存在部位分类可以分为可溶性凝集素和膜结合凝集素。例如，唾液酸糖蛋白(Major sialoglcoprotein)是红细胞膜上面结合的凝集素蛋白，这种凝集素需用缓冲溶 液，甚至采用去垢剂溶解才能进一步纯化。伴刀豆凝集素(ConcanavaliaA，ConA) 是典型的可溶性凝集素，可溶于0. 9%生理盐水，可以采用经典的蛋白质纯化 方式纯化。

8、1.2.3按凝集素的糖结合专一性分类D-甘露糖，D-葡萄糖结合，例如蚕豆凝集素(Hciafaba lcclin,VFL)和豌 豆凝集素(Pisum sativum lectin. PSL)。2-乙酰氨基2-脱氧-D-葡萄糖结合，例如马铃薯凝集素(Solanum tuberosum lecfin， STL)和麦胚凝集素(Wheat germ agglutinin，WGA).2-乙酰氨基2-脱氧-D-半乳糖结合，例如剌槐凝集素(Robinia pseudoaccacia lecfin,RPL)和蜗牛凝集素(Helixpomatia lectin。HPL)。D-半乳糖结合，例如蓖麻凝集素(Ricin

9、us communis agglutinin， RCA) 和花生凝集素(Peanut(Arachis hypogaea)agglutinin， PNA)。L岩藻糖结合，例如荆豆凝集素(Ulex europeus lectino UEL)和欧洲百脉 根凝集素(Lotus tetragonolobus leetin， LTL)。唾液酸结合，例如，龙虾凝集素(Homarus americanus lectin， HAL)。1.3凝集素的国内外研究现状目前，人们已分离纯化的凝集素逾1000种，它们大多为植物凝集素，其 中仅豆科植凝集素即达600余种。通过分离纯化人们可以对凝集素的理化性 质、蛋白结构与

10、功能及编码的基因作进一步的研究。目前已纯化的凝集素的分 子量一般为10-100kDa，如最常见的伴刀豆球蛋白A分子量为104kDa，但小麦 胚凝集素分子量仅为36kDa。通常凝集素由亚基组成，一般为2个或4个，3 个的少见。亚基产生的分子机制有三种解释：不同亚基是不同基因编码的产物； 不同亚基由同一基因编码，翻译后裂解成分子量相同或不同的肽链；翻译后发 生不同程度的修饰。大多数凝集素的前体分子都比成熟分子大，翻译后经过裂 解、糖基化或其它加工后成为成熟分子。3凝集素不同，化学组分也是不同的， 有的是简单的蛋白质，有的则为糖蛋白。不同的凝集素分子还具有特定的氨基 酸组分。同时，通过研究发现凝集素

11、的糖结合位点也是各异的，不同的凝集素 分子识别复杂碳水化合物上的特定糖残基，与糖发生可逆结合而不改变糖苷键 的共价结构。虽然它们的糖结合活性各不相同，但它们的可结合的糖基类型大 体可分为以下6类：（1）甘露糖（葡萄糖）；（2）N 一乙酰氨基葡萄糖；（3）半 乳糖；（4）N 一乙酰氨基半乳糖；（5）岩藻糖；（6）唾液酸。1.4凝集素的应用前景凝集素的特殊的生物学功能，使其具有广泛的利用前景。特别是随着生物 工程的研究手段和研究领域的不断扩大，凝集素的各种实际应用也展现了新的 途径。凝集素在生命机体中识别外来物，在体内外）起调理作用。因此它在认识 和解决集约化、半集约化的养殖生物的防病治病中有重要

12、作用。对凝集素认识 的普及和研究的深入将提高我国养殖业总体水平。对凝集素开发、利用和生化 工程技术的拓展，将会使养殖业及其病害防治转化为高技术类型。凝集素的防卫作用可应用于抗虫基因工程，为抗虫育种提供新的途径。雪 花莲外源凝集素（GNA）对某些咀嚼式和刺吸式昆虫均有抗性，如烟草夜蛾、豇 豆象、飞虱、叶蝉和蚜虫，但对高等动物没有毒性。将编码雪花莲外源凝集素 成熟蛋白的eDNA GNA 12和其前体蛋白eDNA GNA 34插入到二元载体pBin438的 双倍增强子CaM V 35S启动子或二元载体pBcop l的CoYMV启动子下游，分别构 建成植物表达载体pBGnal2、pBGna34、pBC

13、Gnal2和pBCGna34。凝集素由于能和糖专一性识别，而且糖的专一性范围又广，加上易于分离 纯化，所以经常作为免疫学和糖生物学的分子探针，对生理、生化过程进行研 究。首先用标记物将凝集素标记，再利用标记的凝集素来研究糖复合物的结构、 在生物体内的分布，也可用于研究生理、病理过程。比如研究精子在与卵子结 合过程中，其细胞表面受体的种类和分布的变化：研究细胞分化发育过程中， 糖结构发生的变化和蛋白质糖基化;恶性病变细胞表面糖类结构变化及转移过 程中糖类结构特征等等。由于凝集素可与糖分子专一性可逆结合，从而被广泛 用于分离纯化糖分子、糖蛋白、糖脂。利用凝集素分离糖蛋白开始于ConA分离 酵母蔗糖

14、酶。现在已有商品化的ConA、扁豆凝集素、PNA等亲合层析柱出售。 目前，己应用GNA纯化鼠血清中免疫球蛋白2M的单克隆抗体，用ConA纯化绒毛 膜促性腺激素(HGG)、人血清白蛋白、胰岛素受体等；还有，用HA分离干扰素 和免疫球蛋白等。另外，部分凝集素对人类及动物反转录病毒(含HIV)和巨细 胞病毒具有选择性抑制作用。细胞在正常分化、发育或异常病变过程中，其表面糖链结构有很大的变化， 癌变细胞往往表现出糖链的变化。且癌变细胞表面特异凝集索受体发生变化， 凝集素可作为生物探针探测细胞表面糖分布及变异细胞表面糖的变化。扁豆凝 集素和豌豆凝集素可鉴别诊断肝癌和肝炎患者血清中血清甲胎蛋白(AFP)的

15、升 高是源于肝癌细胞或是其它病肝细胞。国内有人采用此法鉴别肝癌和肝炎，使 肝癌假阳性率明显下降。ConA可用于胎儿神经管缺陷及另一些畸形，如脊柱裂 的产前诊断，这是个很有价值的辅助诊断方法，几乎所有这类畸形的妊娠妇 女，羊水中糖蛋白浓度显著降低，不与ConA发生作用或仅有轻微作用。溶酶体 蓄积性疾病以某些特殊的水解酶缺乏为特征，如岩藻糖苷蓄积症病人，缺乏a 一L 一岩藻糖苷酶，其神经元及其它某些类型的细胞可与荆豆凝集素强烈作用， 以辅助诊断。T淋巴细胞在体外经凝集素激活后，可转化为淋巴母细胞，根据淋巴母细 胞的转化情况，可反应机体的细胞免疫水平，监视各种免疫抑制和免疫增强的 疗效。用淋巴细胞转

16、化实验评价艾滋病人的免疫功效，亦是一个简单有效的方 法。PHA、ConA等植物凝集素用作皮内注射可反应肿瘤、肝炎等患者的细胞免 疫能力。我国目前普遍采用PHA作促细胞分裂原评价各种疾病患者的免疫功能。 SBA可选择性沉淀在骨髓移植中引起排斥反应的T淋巴细胞，收集SBA处理过的 骨髓成功地用于临床骨髓移植。PHA配合化疗、放疗或其它治疗能够提高单一 疗法的疗效。对顽固性白血病、晚期恶性滋养叶肿瘤应用PHA合并疗法取得了 明显疗效。甘润良等用I标记的花生凝集素对裸鼠载人胃癌进行靶向治疗，疗 效显著，肿瘤抑制率达73. 2%,可延缓肿瘤生长，延长了荷瘤宿主的生存期。 并且对小鼠没有毒性作用。凝集素也

17、可在固氮工程中发挥作用。最近的研究发现识别根瘤菌的因子是 豆科植物根上的凝集素。目前，固氮工程尝试将豆科植物的凝集素基因转化到 非豆科植物，再接种豆科植物的根瘤菌，使该种非豆科植物被侵染和结瘤。固 氮菌能在豌豆上形成根瘤，但不能在白三叶草根和发根中形成根瘤。若将PSL 基因转入自三叶草后，白三叶草根毛上也产生了根瘤。PSL定位于转基因白三 叶草根表皮细胞的外表面和根毛间段，但正常的三叶草和发根中则没有PSL。 这种固氮方法应用于粮食作物将有很大的意义。总之，凝集素最初在植物中被检测到并命名为盘凝索，一直到目前成为具 有许多重要功能和用途的普遍存在的识别分子，在这120多年来，人们对凝集 素的认

18、识已经有了很大的提高。凝集素作为生物体内一类特殊的蛋白质(糖蛋 白)，在防御病原体入侵、存贮营养物质、专化识别等方面有其独特的功能。 我们可以利用这些特性，在生物工程、临床研究等各方面发挥作用，利用凝集 素的功能造福人类。1.5本设计的主要研究内容包括：对扁豆凝集素分离、纯化过程。对扁豆凝集素的性质特性，包括糖结合特性，金属离子结合特性，热 稳定性，pH稳定性等进行研究。二、扁豆凝集素的分离纯化2.1试验材料扁豆种子，无水乙醚，0.15 mol/L NaCl,0.02 mol/L Tris-HCl,硫酸铵，聚乙 二醇，DEAE-52，Sephacryl S-300 CMFastFlow、Sep

19、hadexG-25，丙烯酰胺， 亚甲基双丙烯酰胺，链霉蛋白酶(pronase E)，牛血清白蛋白(BSA)，对二甲基氨基苯甲醛(DAB)、N-漠代丁二酰亚胺(NBS)。2.2试验方法2.2.1扁豆凝集素粗品的制备取扁豆种子100g，去皮磨成粉末，用无水乙醚(1： 4, v:v)于4C浸泡脱 脂 2 次。然后，用含 0.15 mol/L NaCl 的 0.02 mol/L Tris-HCI, pH 7.8 缓冲液(1： 4, v:v)在4C下浸提两次每次24小时。提取液经离心(4C, 10000rpm, 30 min) 后，弃去沉淀，上清液采用硫酸铵分段盐折法，取饱和度为40%80%的沉 淀，将

20、沉淀溶于0.02mol/L Tris-HCl，pH 7. 8缓冲液中得到相应的粗品。2.2.2扁豆凝集素的纯化粗品4C下充分透析除盐，然后上经0.02mol/L Tris-HCI,pH 7.8缓冲液平 衡的DEAE-52阴离子交换柱，充分淋洗后，换用含0.5mol/LNacl的相同缓冲 液进行离子线性梯度洗脱，分部收集，流速0.5 ml/min，3 ml/管，经紫外和凝 集兔红细胞活性检测后，收集活性部分。此活性部分对0.02 mol/L NaAc-HAc,pH 5.0缓冲液充分透析，然后上用相同缓冲液平衡的CM Fast Flow 阳离子交换柱，充分淋洗后，换用含0.5 mol/LNaCl的

21、相同缓冲液进行离子线 性梯度洗脱，分部收集，流速0.5 ml/min，3 ml/管，经紫外和凝集兔红细胞 活性检测后，收集活性部分。此活性部分用聚乙二醇20 000浓缩后，对含0. 15 mol/L NaCl的0. 02mol/L Tris-HCl，pH 7.8缓冲液充分透析，并用相同缓 冲液平衡Sephacryl S-300柱，然后在FPLC上进行分子筛层析纯化，分部收 集，流速为l ml/min，3 ml/管，经紫外和凝集兔红细胞活性检测后，收集活 性部分，再过Sephadex G-25柱除盐后得扁豆凝集素纯品。三、扁豆凝集素的性质研究3.1试验材料扁豆凝集素提取液，考马斯亮蓝，高碘酸-S

22、chiff试剂，生理盐水，PBS 缓冲液，2 %兔血细胞悬液，缓冲系统，金属离子，乳糖，蔗糖，麦芽糖，a- 半乳糖，D-果塘和葡萄糖的蒸馏水溶液，大肠杆菌，产气杆菌等PDA培养平板3.2试验方法3.2.1扁豆凝集素的基本性质检测3.2.1.1纯度鉴定和糖蛋白的确定采用柱状圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳，用考马斯亮蓝和高碘酸-Schiff试剂 分别染色，根据凝胶呈现色带的情况确定扁豆凝集素的纯度和是否是糖蛋白。3.2.1.2扁豆凝集素的等电点测定采用聚丙烯酰胺凝胶电聚焦发测定其等电点，所用凝胶浓度为7%，两性 电解质为ph3.0-10.0的Ampholin，其最后浓度为1.5%左右，上下电极分别是 5%

23、的磷酸而后5%的乙二胺溶液。3.2.1.3分子量的测定采用Bio-Gelp 100凝胶色层法，以牛血清蛋白（68000）、卵清蛋白（45000）、 胃蛋白酶或乳球蛋白（35000）、和糜蛋白酶原（24500）等为标准蛋白，用1 molNaCl溶液作为平衡也和洗脱液，在01.2X 100cm玻璃柱内进行。3.2.1.4扁豆凝集素的活力测定取96孔微型凝血板，在每一个孔内滴入25叫0.9%生理盐水。取25p l硫 酸铵沉淀样品，进行系列倍比稀释（从前一孔吸取25叫液体，放入下一孔内， 充分混合后25p l液体放入下一孔内，如此操作至倒数第二个孔），留下每一 排的最后一孔，作为对照。在每一个孔内滴入

24、25 u1 2%兔血红细胞，室温下 放置30 min后观察。73.2.2扁豆凝集素的热稳定性测定在96孔V型血凝板上加4 5叫凝集素溶液与等量PBS缓冲液倍比稀释后, 放在温度为 30C、40C、50C、60C、70C、80 C、90 C水浴中保温 5min 后取出，待其冷却全室温，加入等量的2 %兔血细胞悬液，振匀。1h后，用 显微镜进行检测。血凝活力以凝集素最大稀释倍数（以2n表示），以PBS作空 白对照。比较凝集活性。3.2.3碱稳定性测定在凝血性试验的基础上，选定兔红血球配制成2% (体积浓度)生理盐水重 悬液，分别使用以下缓冲液为溶剂配制浓度为1-5 mg/mL的凝集素溶液：NaAc

25、-HAc 缓冲液(pH 3.7-5.8)NaH2P04Na2HP04 缓冲液(pH 6.2-7.8)TrisHcl 缓冲液(pH 8.23-9.10)Na2C03-NaHC03 缓冲液(pH 9.5-10.83)Na2HP04 一 NaOH 缓冲液(pH 11.2-11.9)KCl-NaOH 缓冲液(pH 12.2-13.0)0.09%生理盐水配制好的溶液在25r水浴锅保温30min后，分别加入融含25p l血球缓 冲液和50p l此2% (体积浓度)红血球重悬液的“，形板孔中，振荡Imin, 室温下静置1.5-2h，观察凝血结果。3.2.4金属离子结合特性试验将离子交换层析得到的样品装入透析

26、袋内，放入20 mm EDTA溶液中24 h， 以螯合凝集素中的金属离子。然后用0.9%NaC!溶液充分透析去除EDTA。取透 析后的样品进行倍比稀释，加入25 p l 2%兔红血细胞悬液。取25p l浓度 为10mm的10个过渡金属离子和一种非金属离子，即Ba2+、K2+、Za2+、Li2+、 Mg2+、Fe2+、Ca2+、Fe3+、Al3+和Mn2+等lO个金属离子和NH+4离子放入V型血 凝孔内。另取25pl 0.09%NaCl溶液作为对照。静置1 h后观察现象并读取 血凝孔数。103.2.5扁豆凝集素的糖抑特性试验用0.9%生理盐水倍比稀释离子交换层析得到的样品后，在每一个稀释孔 内加

27、入依次分别加入25叫50 mM，100 mM和200 mM浓度的乳糖，蔗糖，麦 芽糖，a-半乳糖，D-果塘和葡萄糖的蒸馏水溶液。随后在每一个稀释孔内加入 25p l2%兔红血细胞悬液。静置30 min后观察凝血现象并读取凝血孔数。m3.2.6扁豆凝集素的抑菌试验本过程采用滤纸圆片法，在超净工作台内进行如下操作(所有器材均已灭 菌)：将1mL灭菌生理盐水注入长满菌丝或已形成孢予的病菌试管中，振 荡、摇匀。将菌液移入从50C烘箱取出的PDA平皿，仔细摇晃、混匀，平放至 冷却、凝固。将生理盐水过滤到1小试管中，用细菌过滤器将扁豆凝集素生理盐水 溶液过滤到另一小指管中。12用小镊子将滤纸圆片在凝集素溶液中、生理盐水中浸润(但不滴沥)将滤纸圆片按以下规格摆放到先前准备好的PDA平皿中，沿平皿圆周 (距皿沿0.5cm)绕圆心每隔60度摆放1片，共5片，余下位置放生理盐水片。将PDA平皿倒置，25C培养，此后l周内，每天察记录抑菌情况。133.2.7扁豆凝集素的凝血活性3.2.7.1红血球溶液的制备按如图1所示的流程进行操作：从动物体或人体现采的新鲜血液，按血： 抗凝剂=9:1的比例保存在预装有抗凝剂的30 mL塑料离心管。带回实验室离 心、去除上清液，沉淀用生理盐水重悬，再离心(如此重复4次)，最后用生理 盐水将沉淀配制成2 % (体积浓度)红血球溶液