多种化疗药对凋亡抑制蛋白Survivin在HL60细胞中表达的影响

1、多种化疗药对凋亡按捺卵白Survivin在HL-60细胞中表达的影响吴耀辉，邹萍，刘芳，张敏，陈建华【摘要】Survivin基因是细胞凋亡按捺卵白家属的新成员，由于其具有在人类正常构造不表达而在种种肿瘤构造高表达的特性，因此有望成为肿瘤治疗的选择性靶点；有研究还表白survivin的表达与耐药性的产生有关。本研究旨在通过查明HL-60细胞在多种化疗药物作用后RNA和卵白的改变，开端探究survivin和耐药性之间的干系。用符合浓度的柔红霉素(DNR)、米托蒽醌(IT)和三氧化二砷(As23)作用于HL-60细胞，随后用RT-PR检测给药的第1天和第3天HL-60细胞中survivinRNA的表

2、达环境，用esternblt检测survivin卵白的表达环境。效果表白：在赐与化疗药的第1天3组HL-60细胞中survivinRNA表达程度全部低落，此中DNR组落落了10%，IT组落落40%(P0.01)，As23组落落了25%(P0.01)。在赐与化疗药的第3天，DNR和IT组的HL-60细胞中survivinRNA表达较第1天有显着的升高，别离上升20%(P0.05)和65%(P0.01)；但赐与As23组中的survivinRNA表达仍连续低落，仅为第1天的68%(P0.01)。esternblt检测创造，赐与DNR和IT3天后的HL-60细胞中survivin卵白含量别离升高了1

3、4%和11%，而赐与As23组那么落落了82%。结论：在赐与化疗药后白血病细胞survivin表达先低落后升高的征象大概与化疗中耐药性的产生有关，而三氧化二砷有着差异的作用机制，这在逆转耐药性上大概发挥紧张的作用。【关键词】柔红霉素AlteratinfExpressinfSurvivininHL-60ellsTreatedithhetherapeutiDrugsKeyrdsdaunyin;itxantrne;arsenitrixide;survivin;HL-60ell细胞凋亡受阻在肿瘤的产生、生长及肿瘤化疗耐药等方面占据紧张的职位。比年来的研究表白，细胞凋亡调治的改变大概是肿瘤化疗耐药产生的

4、缘故原由之一1。Survivin作为细胞凋亡按捺卵白(inhibitrfapptsisprtein，IAP)家属的新成员，由于其具有在人类正常构造不表达，而在人类种种肿瘤构造高表达的特性2，有望成为肿瘤治疗的选择性靶点，引起了学者们的普及存眷。化疗在如今仍旧是治疗白血病的重要要领，但日益增多的耐药性的出现严峻影响了治疗的疗效，而耐药性产生气制如今尚不非常明晰。我们通过研究多种化疗药物作用人急性髓性白血病细胞系HL-60后survivinRNA和卵白的变革，开端探究survivin和化疗耐药性之间的干系。质料和要领质料与试剂RPI1640造就液、新生牛血清、TRIZL试剂购自Gib公司，LV逆转

5、录酶、RNA按捺物为Prega公司产物，DNA聚合酶购自日本TaKaRa公司，兔抗人survivin多克隆抗体为Santaruz公司产物，辣根过氧化物酶标识表记标帜的羊抗兔IgG购自北京中山生物工程公司，-atin和survivin的引物由上海生物工程公司合成，人急性髓性白血病细胞株HL-60由华中科技大学同济医学院免疫教研室惠赠，柔红霉素(daunyin，DNR)为法玛西亚普强产物，米托蒽醌(itxantrne，IT)购自四川升和制药，三氧化二砷(arsenitrixide，As23)为哈尔滨伊达制药厂产物。细胞造就人急性髓系白血病细胞HL-60以含10%胎牛血清的RPI1640造就液，于3

6、75%2条件下造就。取对数生恒久HL-60细胞，按2105/l的浓度接种于6孔板，每孔5l，实行分为柔红霉素(20ng/l)、米托蒽醌(5ng/l)和三氧化二砷(1l/L)及不加药HL-604组，别离于加药造就后第1和第3天网络细胞备用。逆转录聚合酶链反响(RT-PR)检测接纳RT-PR技能别离检测给药和不给药细胞中survivinRNA的表达。人survivin的PR引物为5-TAAGGAAGATT-3和5-TAATATGGAGAG-3，合成产物392bp;-atin为内参照，引物5-TGTAGTTGTATAGGT-3和5-TTTAATGTAGAGA-3，合成产物247bp。RT-PR接纳二

7、步法。用TRIZL试剂提取细胞的总RNA，紫外分光光度计检测其浓度(盘算浓度的公式为：样品的A260值40稀释倍数，单元是g/l)和纯度(样品的A260/A280比值)，逆转录天生DNA。PR的总反响体系为50l，此中包罗DNA3l，10PR缓冲液5l，25l/Lgl210l，10l/LdNTP1.5l，Taq酶2U，survivin上、卑劣引物各25pl，-atin上、卑劣引物各25pl。反响条件为94预变性5分钟，94变性30秒，58复性45秒，72延伸1分钟，循环30次，末了72再延伸10分钟。PR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳阐发，紫外灯下不雅察、摄像，阐发效果。试验重复3次，效果取均匀

8、值。esternblt阐发将预冷至4的裂解缓冲液参加到经PBS漂洗的第3天网络的造就细胞中，冰上作用20分钟，12000g离心2分钟后，上清液保存于20；测定卵白质浓度，上样，SDSPAGE凝胶电泳分散，通过电转移法将卵白质转移至硝酸纤维素膜，在含5%脱脂奶粉的TTBS中37关闭90分钟，参加一抗(兔抗人survivin多克隆抗体，稀释度为11000)，4孵育留宿，参加二抗(辣根过氧化物酶标识表记标帜的羊抗兔IgG，稀释度为11000)，37作用40分钟，化学荧光法(EL)显色，不雅察效果。统计学阐发接纳SPSS10.0软件举行数据处置惩罚，各组间比力接纳方差阐发，两两比力接纳t查验。效果Su

9、rvivin基因在HL-60细胞中的表达RT-PR检测表现，与未加药的HL-60细胞比拟，赐与3种化疗药物作用1天后的HL-60细胞中survivin表达全部低落，此中柔红霉素组中落落约10%，三氧化二砷组中落落25%(P0.01)，米托蒽醌组中落落40%(P0.01)；在第3天，柔红霉素组和米托蒽醌组的HL-60细胞中survivin表达较第1天显着升高，别离升高了20%(P0.05)和65%(P0.01)，但给与三氧化二砷组的HL-60细胞中survivin表达仍连续低落，约为第1天表达量的68%(P0.01)(附表、图1)。由此可见，赐与柔红霉素和米托蒽醌后，HL-60细胞中surviv

10、inRNA表达先表示为低落，但随着时间的延伸其表达又渐渐升高，而三氧化二砷那么能使HL-60细胞中survivin的含量连续低落。Table.ExpressinfthesurvivininHL-60ellsaftertreatingiththreekindsfhetherapeutidrugs略Survivin卵白的表达应用esternblt检测Survivin卵白的表达表现，处置惩罚1天后4组细胞survivin卵白的含量大抵雷同，无显着区别。第3天，可见HL-60DNR组和HL-60IT组比比拟组survivin卵白含量别离升高了14%和11%，而HL-60As23组那么显着低落，仅约为比

11、拟组的18%(图2)。由此可见，DNR和IT能使HL-60细胞中survivin卵白含量升高，但As23那么会使survivin显着低落。讨论白血病是血液体系患者殒命率很高的一种疾病，患者5年保存率很低，化疗耐药是影响其疗效的重要缘故原由之一。因此，落服肿瘤化疗耐药成为白血病治疗的关键。传统以为，白血病化疗耐药的机制大概包罗药物代谢途径改变、药物作用靶目的修饰、DNA修复率上升、药物诱导DNA损伤落落等。比年来研究表白，细胞凋亡调治的改变大概是肿瘤化疗耐药的缘故原由之一1。Survivin是1997年创造的IAP家属新成员之一，Survivin普及表达于种种肿瘤构造中，而在正常构造不表达2。arter等3用RTPR的要领检测18例AL含AL的种种范例患者，创造有16例患者表示为差异程度的survivin阳性。Adida等4同样创造在125例AL患者中，有75例检测到survivinRNA的表达，其阳性率高达60%。上述研究表白survivin与白血病有必然的干系。固然survivin按捺化疗药在内的种种刺激因素所引起的细胞凋亡机制还不明晰，但如今研究以为，大概是通过多种途径实现的：survivin能与激活的aspase-3和apase-7结合，制止由aspase激活剂或凋亡诱导剂诱导的细胞DEVD-leaving自尽酶的积聚从而制止细胞凋亡8；survivin还大概与化疗时肿