32P后标记DNA加合物的

1、32PDNA加合物的检测技术1 1.DNA加合物 DNA加合物是指环境化合物直接或经体内代谢,以及体内自身产生的亲电性活性有毒化合物,与DNA碱基上亲核的位点特异性结合形成的共价结合物。可与DNA发生加合作用的化学物质包括：烷化剂，多环芳烃，苯乙烯氧化物，醌类，醛类，黄曲霉素，N-亚硝基化合物，杂环芳香胺和丙烯酰胺等。2 四种碱基上易形成加合物的位点如同所示。3 DNA加合物是DNA化学损伤的最重要的形式，并是引发肿瘤过程的病理原因，若形成的DNA加合物不能被生物系统的修复酶及时修复,会引起相关基因发生突变，因此具有遗传毒性，已有的研究表明许多化学品的致突变、致畸、致癌效应是与DNA加合物的形

2、成有关。 DNA加合物既可作为环境毒性物质靶向暴露剂量的生物接触标志物，为分析致化学毒害物质的暴露提供手段，又可以作为遗传毒性和致癌作用的生物效应标志物，为生物体的致癌风险评价提供重要信息。4 2.检测原理 检测的基本过程是，首先对样品DNA进行水解，然后对水解的核苷酸进行非选择或选择性32P标记，最后进行分离和测定。因为生物体内加合物的含量极低，要求检测灵敏度大于0.1-1个/108核苷酸，至少能检测到每108核苷酸中有1个加成物的水平。5 DNA MN+SPD P1+PAP Xp+Np XpN+N -32PATP 固/液相抽提 -32PATP P1/S1 T4激酶 *pXp+*pNp Xp

3、+N Xp *pXpN TLC T4激酶 -32PATP VPD 测定 *pXp *pX+pN 标准法或 核酸酶P1 顶醇抽提/ 二核苷酸/ 限量AIP法 富集法 HPLC富集法 5-单核苷酸32p后加成DNA加成物的检测方案 如图。6符号表示 图中X表示加合核苷酸，N表示正常核苷酸，左边的磷酸P表示5端，右边的表示3端。酶及特性酶特性微球菌核酸酶（MicrococcalNuclease，MN） 是一种内切核酸酶，作用于单链及双链核酸，生成3-磷酸末端。对单链核酸的作用较好，能较好地分解DNA或RNA的富含AT或AU区域。本酶催化作用不需要Mg2+，但需要Ca2+的存在。脾脏磷酸二酯酶(spl

4、een phosphodiesterase，SPD) 是把具有5-OH末端的DNA、RNA从5-末端向3-端进行逐步降解游离出3-核苷酸的酶。7酶特性核酸酶P1（NucleaseP1） 是一种磷酸二酯酶，具有二酯酶或单酯酶两重活性，即一是作用于DNA单链中的3 ,5 -磷酸二酯键，生成5 -核苷酸；二是3分解单核苷酸或寡聚核苷酸中的3-磷酸单酯键。检测中利用了其可以水解正常单核苷酸上的3-磷酸,但难以水解含较大体积加合物的单核苷酸上的3-磷酸,随后加合的加合的核苷酸可以被T4多核苷酸激酶进行5-32P标记，而正常的则不能。前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase，

5、PAP) 可以使脱去单核苷酸或二核苷酸5的磷酸。T4多核苷酸激T4 Polynucleotide Kinase 够催化P在ATP的位置和多核苷酸（单链、双链的DNA、RNA）5羟基末端和核苷3单磷酸核苷之间的转移与交换。82.1基本方法1）标准方法将DNA用微球菌内切酶（MN）及脾磷酸二酯酶（SPD）消化成单核苷酸（Xp+Np）。T4多聚核苷酸激酶（PNK）催化-32pATP中的32p至单核苷酸的5末端（*pXp+*pNp）。以PEI-纤维素薄层层析分离,用放射自显影定性。用液闪测定进行定量。92）限量ATP法 在标记反应中不再加入过量的而限制加入ATP的量，由于对加合物核苷酸的标记优于正常核

6、苷酸，从而提高了灵敏度。3）丁醇富集法 在DNA样品被消化成3-单核苷酸后，加入丁醇及反相试剂四丁基氯化铵，在酸性的条件下抽提富集的加合核苷酸，然后再进行标记。104）核酸酶P1/S1富集法 在进行32P标记前，用核酸酶P1或S1处理3-单核苷酸，正常3-单核苷酸可以被核酸酶P1去磷酸化,而不为T4多聚核苷酸激酶作用,但核酸酶P1不能使3-加合的核苷酸去磷酸化,这样在进行标记时就只有其被标记上32P。5）HPLC富集法 利用HPLC 分离DNA 的消化混合液,富集被加合的核苷酸,然后进行标记,进而用薄层色谱分离测定。11 6）二核苷酸/5-单磷酸法首先在酸性条件下（PH5.0）,加入核酸酶P1

7、,DNA分子中的正常核苷被水解成5-单磷酸核苷(pN),而被加合的核苷则由于结构改变而对该酶不敏感,其消化产物是5-磷酸二核苷酸(pXpN) 。然后加入前列腺酸性磷酸酶(PAP),5-单磷酸核苷(pN)被进一步酶解成核苷(N),而5-磷酸二核苷酸(pXpN)则被酶解成二聚核苷(XpN)。 最后再加入-32pATP与T4激酶进行标记，被加合的二聚核苷(XpN)被标记为32pXpN,而正常核苷(N)不被标记。也可以再加入蛇毒磷酸二酯酶,进一步将32pXpN酶解成单核苷32pX和pN,然后进行分离测定。12 2.2方法比较 32p后标记法的优点是灵敏度高，不需要复杂的仪器设备，缺点是特异性和稳定性差

8、、步骤繁琐、不能提供结构信息等。方法 灵敏度应用特点标准法 1000 32P标记效率及灵敏度较低，目前已很少应用。限量ATP法 0.11 提高了灵敏度，但重现性较差，一般用于加合物不能富集的情况。丁醇富集法 0.010.1灵敏度很高，广泛应用，但对不同种类的加合物的富集效率不同。核酸酶P1 0.010.1灵敏度高，操作简便，重现性好，广泛应用，但某些加合核苷亦对核酸酶P1敏感。HPLC富集法 0.11 能将复杂成分的加合物分开，进行定性定量分析，但背景值较高。选择标记法 0.01 灵敏度高，特别用于富集法回收不完全的情况，为最广泛应用的方法。13 3.操作过程 3.1标准方法 DNA的酶解过程

9、为，取一份含2.5gDNA样品的溶制溶液，置1ml聚丙烯离心管用真空离心蒸发器蒸干，然后用含5g（0.6u）微球菌核酸酶（micrococcal nuclease）,和5g脾磷酸二脂酶（spleep phosphodiesterase）的12l 10mM CaCl2，20mM琥珀酸缓冲液（PH6.0），在370C下消化3h。 参见：32P-Postlabeling Analysis of Aromatic DNA Adducts in Fish from Polluted Areas1. Cancer Research 47, 6543-6548. December 15, 198714 3.

10、2丁醇富集 DNA消化 同标准方法，取5g DNA ,和各5g微球菌核酸酶（Micrococcal Nulease)和脾磷酸二脂酶（spleen phosphodiesterase ）,置12.5l 10mM 琥珀酸缓冲液（pH6.0）: 5mM CaCl2，在370C下消化3h,然后被稀释成50l。DNA富集 取1g 10l DNA 消化液，与5l 100mM 甲酸铵（pH3.5）和 5l 10mM TBA，及30l的水，置1.5ml的微量离心管，用等体积的丁醇提取两次，混合液涡旋30秒后用台式离心机离心1min进行分离，合并提取液并用90l 水反相萃取2次，以除去正常核苷酸的污染，最后丁醇

11、提取液加1 l 200mM Tris-HCl（pH9.5)进行中和。参见：Enhanced Sensitivity of 32P-Postlabeling Analysis of Aromatic Carcinogen:DNA Adducts. Cancer Research 45, 5656-5662, November 198515 3.3酶P1富集 取12.5gDNA，与750mU微球菌核酸酶 ，12.5mU脾脏磷酸二酯酶，在12.5l的缓冲液（20mM 琥珀酸钠，8mMCaCl2，pH6.0），于370 C温育3h，移取2.5l水解液，进行1:1500倍稀释用以测定正常核苷酸的含量，对

12、于核酸酶P1方案，取10l水解液，加3l含5g（5U）核酸酶P1的缓冲液（0.8M NaAc（pH5.0），2mM ZnCl2），在370C水浴30min后，用3l 427mM tris base 中止反应，然后如前法用丁醇抽提，最后加4l标记混合液（400mM N-二（羟基）甘氨酸（pH9.5），300mM二硫苏糖醇，200mM MgCl2 ，10mM亚精胺，100Ci-32pATP（15pmol），0.5l 90 M ATP ，10U T4多核苷酸激酶），在室温下水浴30min，20l 被用于聚乙烯亚胺包被纤维素板薄层层析，并用储磷屏检测和定量。16参见：DNA adduct format

13、ion from quaternary benzocphenanthridine alkaloids sanguinarine and chelerythrine as revealed by the 32P-postlabeling technique. Chemico-Biological Interactions 140 (2002) 231242.3.4选择标记 取3g DNA，加入0.5l Nu.P（1g/l），1lPAP（100U/l），0.5l缓冲液（88mM NaAc，0.5mM ZnCl2，pH5.0）置380C水浴90min，加0.7l 1M CHES-NaOH （pH9.5）终止反应，取1l水解液，溶于300l 10mM Tris-HCl （pH7.5）中，测定OD260值用于计算总核苷酸的浓度。在剩余的4.7l DNA水解液中，加入0.5l PNK（10U/l），1.3l-32pATP(10-15Ci)，0.7l 10PNK缓冲液（0.1M Bicinc-NaOH，0.1M MgCl，0.1M 二硫苏糖醇，10mM精脒，pH9.5），置于380C水浴90min，然后加入1.7l APy（11mU/l）进一步水解30min，用以水解多余的ATP，最后取6l标记混合液用TCL定性和定量。1