第十二章植物组织培养室的构建及培养基、植物材料消毒液ppt课件

1、第二章植物组织培育实验室的构建及植物组织培育基植物组织培育实验室的构建主要内容：一、植物组织培育实验室设计二、仪器和设备三、玻璃器皿和器具四、培育条件一、实验室设计 规范组织培育室包括 洗涤室区 制备室区 灭菌室区 储放室区 操作室区 培育室区 察看室区 药品室区、洗涤室区 玻璃器皿和塑料器皿、洗 包括用自来水、洗液、洗涤剂清洗、干 包括自然晾干和烘箱枯燥2、药品室存放常用的化学试剂无机盐类、有机物、生长调理剂等3、制备室完成所运用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培育基分装等。主要设备： 药品柜、防尘橱放置培育容器、冰箱、天平、蒸馏水器、酸度计及常用的培育基配制用玻璃仪器.培育基的配制生理

2、生化测定4、储存室区存放配制后的培育基或未用完的培育基5、灭菌室即消毒室，是培育基、玻璃器皿、塑料器皿和其他物品消毒灭菌的地方6、操作室也称接种室，是开展组织培育研讨包括接种、继代、细胞交融等的场所。主要用于植物资料的消毒、接种、培育物的转移、试管苗的继代、原生质体的制备以及一切需求进展无菌操作的技术程序。接种室宜小不宜大，普通78平米，要求地面、天花板及四壁尽能够密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气扰动。 7、培育室培育室：培育室是将接种的资料进展培育生长的场所。培育室的大小可根据需求培育架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原那么。高度比

3、培育架略高为宜，周围墙壁要求有绝热防火的性能。培育室： 植物组织培育资料移到田间前，先移到驯化室进展炼苗，带生根成活后，再移到田间苗圃。二、仪器和设备1、烘箱陈列于洗涤室作用：枯燥洗后的器皿 高温干热灭菌 测定培育物的干重 气浴2、冰箱陈列于制备室中作用：低温保管资料，存放药品、培育基母液 激素、酶制剂。3、灭菌锅陈列于灭菌室中类型：普通医用消毒锅 大的高压灭菌锅作用：培育基、水和各种器皿的消毒4、超净任务台陈列于操作室接种室中类型：垂直式和程度式作用：无菌操作5、pH计陈列于制备室中作用：测定培育基及酶液的pH值6、显微镜陈列于察看室中类型： 倒置显微镜 原生质体察看 普通显微镜 染色体和叶

4、片气孔察看 荧光显微镜 细胞活力察看 解剖显微镜 立体察看7、天平陈列于制备室中作用：称取大量元素、微量元素、酶制剂三、玻璃器皿及器具1、玻璃器皿培育用的：试管、三角瓶、培育皿等显微镜下察看用的：细胞微室、载玻片、培育皿等。2、微孔过滤器细胞过滤器灭菌用：如激素普通用石棉滤膜3、细胞计数器统计培育细胞的器具4、接种器具如镊子、剪刀、解剖刀、接种针等思索题1、一个正规的组织培育实验室应具备哪些房间？2、组织培育常用的设备有哪些？各有何用途？3、组织培育的环境条件有哪些？ 培育基的成分 培育基的制备 培育基的选择 培育基的制备是组培的中心任务，外植体之所以能沿着不同的组培途径生长、分化、成苗都取决

5、于选用不同成分的培育基来调理控制的。培育基的成分其它添加物固化剂植物生长调节剂有机营养成分无机营养成分培养基组成无机营养成分+有机营养成分=根本培育基1.无机营养成分：1)大量元素：指浓度大于0.5mmolL的元素。 C、H、O、N、P、K、Mg、S和Ca 氮：由硝酸盐和铵盐提供 铵盐过高会引发玻璃化苗2)微量元素：指小于0.5mmolL的元素。Fe，Cu， Zn，B， Mo， Mn等微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调理。Fe由螯合物的方式提供:Na2.EDTA 无机盐供应缺乏时，植物会出现缺素病症。 1、无机营养成分当某些营养元素的供应缺乏时，愈伤组织所表现出来的病症如

6、下：氮：某些组织表现出一种花样素苷的颜色；不能构成导管；氮，钾或磷：细胞过度生长，构成层组织减退；硫：非常明显的褪绿；铁：细胞分裂停顿；硼：细胞分裂停滞，细胞伸长；锰或钼：影响细胞伸长。不同营养条件对植物组织培育的影响-MS Salts Growth medium is optimised for regeneration of plantletsThe explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface No MS saltsNo sign of rege

7、neration from explant at all.MS salts reduced to 0.47 g. l-1 Some root growth but reduced development of shoots1/10MSMS salts increased to 9.52 g. l-1 Shoots developed on upper surface of explant. No roots or callus.(2MS) 碳源：最常用的是蔗糖，提供碳源；维持培育基浸透压。 葡萄糖和果糖也是较好的碳源，可支持许多组织很好的生长。 麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培育中也有运用

8、。 蔗糖运用浓度在2%3%，常用3%，即配制一升培育基称取30g蔗糖，有时可用2.5%，但在胚培育时采用4%-15%的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。 2、有机营养成分维生素：维生素(vitamin) 这类化合物在植物细胞里主要是以各种辅酶的方式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。 虽然大多数的植物细胞在培育中都能合成所必需的维生素，但在数量上，还明显缺乏，通常需参与一至数种维生素，以便获得最良好的生长。 主要有VBl (盐酸硫胺素)、VB6 (盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc抗坏血酸、有时还运用VH(生物素)、 VB11(叶酸)、VB12钴胺素)等。 普通用量为0.1

9、1.0mgL。有时用量较高。VB1 对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6 能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc有防止组织变褐的作用。氨基酸(AA)：是很好的有机氮源，可直接被细胞 吸收利用。最常用的是甘氨酸，其 他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、 天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。 有时运用水解乳蛋白或水解酪蛋白，它们含有约20种氨基酸的混合物，用量在10-000mg/L之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培育中无特别需求，以不用为宜。天然复合物：其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明

10、显。它的成分大多不清楚，所以普通应尽量防止运用。 1)椰乳 是椰子的液体胚乳。 2)香蕉 主要在兰花的组织培育中运用，对发育有促进作用。 3)马铃薯(potato) 去 4)水解酪蛋白 5)其他 酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)肌醇 (myoinosltol)又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。通常可由磷酸葡萄糖转化而成，还可进一步生成果胶物质，用于构建细胞壁。肌醇与6分子磷酸残基相结合构成植酸，植酸与钙、镁等阳离子结合成植酸钙镁，植酸 可进一步构成磷脂，参与细胞膜的构建。 运用浓度普通为100 mg/L，适当运用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的构成。对组织和细胞

11、的繁衍、分化有促进作用，对细胞壁的构成也有作用。Growth medium is optimised for regeneration of plantletsNo sucrose (0%)Sucrose reduced to 1%Sucrose increased to 5%The explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface Very few shoots have developed on the explant. No roots and no

12、 callus.Shoots developed on edges of upper surface, and some root development has occuredShoots have developed over the surface of the explant, along with roots from the lower surface. The result is comparable with the control medium不同营养条件对植物组织培育的影响-sucrose 3、植物生长调理物质 在培育基的各成分中，植物激素是植物培育基的关键物质，它以很微小

13、的量影响着再生植株的形状建成。 根本培育基 保证培育物的生存和最 低的生理活性 植物激素 定向的诱导外植体的生长分化国际植物生理协会公布的植物激素包括：赤霉素GA细胞分裂素 ( CTK )生长素(AUX)乙烯Eth零落酸ABA油菜素内酯BR 作用：顶端分泌，诱导细胞分裂，促进生根。 用量：mg/L 1生长素(AUX)：吲哚乙酸：IAAindo acetic acid萘乙酸 ：NAAnaphthalene acetic acid吲哚丁酸：IBAindolebutyri acid2,4-二氯苯氧乙酸：2,4-D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid) 用法：溶于95%酒

14、精或者NaOH种类：生长素作用强弱顺序：IAANAAIBA2,4-D强弱2，4-D常用于诱导愈伤组织，IBA和NAA常用于生根No NAAPoor shoot development and no roots. Extensive callus generation(1/5)NAAPoor shoot development and no rootsNAA reduced to 0.1 mg. l-1Growth medium is optimised for regeneration of plantletsThe explant is completely covered with gre

15、en shoots, and roots are developing on the lower surface NAA increased to 5.0 mg. l-1Profuse development of roots over the explant upper and lower surface, and few shoots. Some callus(10 xNAA)不同营养条件对植物组织培育的影响-AUX 种类：6-BA(6-苄基腺嘌呤)Kt (kinetin 激动素)Zt (zeatin 玉米素)TDZThidiazuron 用法：溶于0.5 MHCl和NaOH 2细胞分裂素

16、(CTK): 作用：根尖分泌，促进细胞分裂, 诱导芽的分化，延缓组织衰落。Growth medium is optimised for regeneration of plantletsThe explant is completely covered with green shoots, and roots are developing on the lower surface No BAPBAP reduced to 0.1 mg. l-1More balanced development of roots and shoots. However, undifferentiated cal

17、lus is developing at the edges of the explantProfuse development of roots and a reduced number of shoots. Undifferentiated callus is developing at the edges of the explant不同营养条件对植物组织培育的影响-CTK (1/5BAP )GA3：作用：促进幼胚发育，促进细胞伸长，突破休眠。用法：易溶于水，普通用95%的酒精配成母液储存。 3赤霉素(GA)4乙烯作用：催熟，促进植物落叶、早衰等，影响培育物的生长和分化。5零落酸作用：促

18、进零落和衰老，在组培中或许促进，或许抑制愈伤的分化作用：作用能够与CTK类似，但是用量远小于CTK。6油菜素内酯生长素促进DNA的复制赤霉素促进G1-S,并缩短S期细胞分裂素促进细胞质的分裂琼脂是一种由海藻中提取的多糖类物质，本身并不提供任何营养，40 凝固。固体培育时最好的固化剂。 用量：0.7%-1%。4 固化剂-琼脂活性炭(active carbon)： 活性炭为木炭粉碎经加工构成的粉沫构造，它构造疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决议着吸附才干、粒度越小，吸附才干越大。温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至解吸附。 通常运用浓度为 0.530g/L。它可以吸附非极性

19、物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培育物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5羟甲基糖醛及激素等。5 其他成分活性炭(active carbon)：作用：利用其吸附才干，减少一些有毒物质的影响，防止褐变；利于生根。浓度：530g/L。5 其他成分AgNO3:作用：抑制乙烯活性，防止玻璃化苗的出现浓度：1-10mg/L抗生素：种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等。作用：可防止外植体内生菌污染。浓度：520mg/L。6、水作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。 留意：用蒸馏水，最好是双蒸水,以坚持母液及培育基成分的准确性，防止贮藏过程发霉蜕变。 大规模消费时

20、可用自来水。但在少量研讨上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。1、 母液(stock solution)的配制和保管所谓母液是欲配制液的浓缩液。意义: 保证各物质成分的准确性 配制时的快速移取 便于低温保藏。3.2 培育基的配制化学药品及试剂 汉语名 分子式 消费公司 分子量 纯度 硝酸铵 NH4NO3 上海通亚精细化工厂 80.04 分析纯 磷酸二氢钾 KH2PO4 中国江苏南京中山集团公司化工厂 .09 硝酸钾 KNO3 上海鑫达精细化工 101.10 硫酸镁 MgSO4.7H2O 山东省化工研讨院 246.47 氯化钙 CaCl2.2H2O (上海)四联化工厂 147.03 硫酸锰

21、 MnSO4.4H2O 上海试剂工厂 169.02 硫酸锌 ZnSO4.7H2O 山东潍坊市试剂厂 287.54 硼酸 H3BO3 济南化学试剂厂 61.83 碘化钾 KI 上海化学采购站 166.064 钼酸钠 Na2MoO4.2H2O 北京五十六0一化工厂 241.95 分析纯 氯化钙 CaCl2.6H2O 济南试剂总厂 237.93 五水硫酸铜 CuSO4.5H2O 济南化学试剂厂 249.68 汉语名 分子式 消费公司 分子量 纯度 乙二胺四乙酸钠 Na2-EDTA.2H2O 济南试剂总厂 372.24 分析纯 硫酸亚铁 FeSO4.7H2O 山东博山化学试剂厂 278.01 分析纯

22、甘氨酸 C2H5NO2 中国科学院上海生物化学研讨所 75.07 分析纯 盐酸吡哆醇 B6 C8H11O3N.HCl 中国医药上海化学试剂站 205.64 盐酸硫胺素B1 C12H17ClH4OS.HCl 中国新兴化工试剂研讨所 337.27 烟酸B3 C6H5NO2 北京芳草医药化工研制公司 123.11 化学纯 肌醇 C6H12O6 中国政翔化学试剂研讨所 180.16 3-吲哚乙酸IAAb-Indoleacetic acid 天津天泰精细化工品 125.1 分析纯 萘乙酸 NAA C12H10O2 中国医药上海化学试剂公司 186.21 化学纯叶酸 C19H19O6N7 上海化学试剂厂

23、441.42 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 上海雪满生物科技 6-BAN6-benzylaminopurine 上海伯奥生物科技 225.25 蔗糖 sucrose 天津市广成化学试剂 342.29 分析纯 琼脂 Agar 国药集团化学试剂 B.R单配法：将培育基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。普通用mg/ml。混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩展一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。 母液的配制方法：MS培育基配制表母液化合物含量（终浓度）mg/L母液称量（mg） 配制量（

24、ml）吸取量（ml/L）1号NH4NO3KNO3KH2PO4MgSO4.7H2O16501900170370165001900017003700500（扩大20倍）502号CaCl24404400同上503号ZnSO4.7H2OMnSO4.4H2OH3BO3NaMoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCl2.6H2OKI8.622.36.20.250.0250.0250.83430111531012.51.251.2541.5500（扩大100倍）104号Na2EDTAFeSO4 .7H2O37.327.8746556100（扩大200倍）55号VB1VB6甘氨酸烟酸0.40.520.520

25、2510025500（扩大100倍）106号肌醇1001000100107蔗糖330 g8琼脂0.61.2612 gMS母液配制：MSI 大量元素 20X MSII 微量元素 200X MSIII铁 盐 200X MSIV有机 物 200X MSV肌 醇 200X 激 素 0.1mg/ml植物激素母液的配制生长素类：IAA、NAA、2，4-D、IBA配制：先按要求称好100mg药品，置于小烧杯中，用0.1N NaOH溶解，再用蒸馏水定容到1000mL，再于试剂瓶保管。那么实验室NAA浓度为0.1mg/ml细胞分裂素类： BA、KT、ZT配制：先用0.5N盐酸溶解100mg药品，再用蒸馏水定容至1000mL，然后保管。那么实验室BA浓度为0.1mg/ml3.灭菌： 通常培育基应在汽相121摄氏度的条件下在高压灭菌锅内灭菌20 min。 在高压灭菌锅的加热过程中，在气压指针上升到0.05 Mpa时，放一次气，然后在温度达121摄氏度时，坚持此压力灭菌15-20 min。灭菌完成后，待灭菌锅的压力降到0时，翻开灭菌锅，取出培育基，放平，待培育基凝