第二章组织培养基本技术ppt课件

1、第二章 植 物 组 织 培 养 基 本 技 术第一节 实验室设置及根本技术第二节 组织培育所需的环境条件及营养成分第三节 培育基的配制与灭菌第四节 外植体的选择和灭菌第五节 外植体的接种和培育第六节 外植体的褐变及其预防措施第七节 玻璃化景象及其预防措施第八节 试管苗的驯化和移栽第一节 实验室设置及根本技术一、实验室组成二、仪器设备三、培育器皿及实验器具四、洗涤技术五、灭菌技术六、无菌操作 组织培育实验室规划的总体要求 便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于察看一、实验室组成根本实验室辅助实验室实验室组成预备室缓冲室无菌操作室培育室细胞生物学实验室温 室生化分析实验室根本实验室规划平面图实验台搁架

2、培育架培育架培育架培育架药品及仪器柜无菌台无菌台搁架拉窗冰箱搁 架水槽电炉门4.5m3.0m3.5m4.0m预备室缓冲室无菌室培育室组织培育预备实验室缓冲室培育室无菌室一无菌室二二、仪器设备1、根本仪器设备 6912 8 冰箱、电磁炉、酸度计、纯水器、天平、移液器、解剖镜、光照培育箱、摇床、生化培育箱、培育基分装器、搅拌器等。冰箱酸度计电炉天平纯水器培育基分装器搅拌器2、灭菌设备 蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌安装、喷雾消毒器、紫外灯。蒸汽压力灭菌锅干热消毒柜无菌瓶顶过滤安装喷雾消毒器参考图参考图3、无菌操作设备 超净任务台无菌接种箱4、细胞培育设备 摇 床培育架HZC-250恒温振荡培

3、育箱 150C250D光照培育箱 5、细胞学鉴定设备 光学显微镜、体视显微镜、倒置显微镜倒置显微镜光学显微镜1、玻璃器皿三、培育器皿及实验器具培育皿三角瓶培育瓶2、金属材质器具镊子解剖刀接种针四、洗涤技术1、玻璃器皿洗涤新购置玻璃器皿1%稀HCl浸渍12h洗衣粉洗涤清水冲洗晾干备用已用过的玻璃器皿2、塑料用品洗涤新的塑料器皿翻开即用已用过的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水冲洗2%5%盐酸浸泡30min清水冲洗蒸馏水冲洗晾干备用3、金属用品洗涤热洗衣粉水洗净冲洗擦干五、灭菌技术物理方法： 物理灭菌干热、湿热、射线处置、过滤除菌等化学方法： 消毒剂、抗菌素灭菌1、灭菌方法2、灭菌1培育基灭菌：高

4、温高压湿热灭菌法 压力在9.810410.8104Pa 温度在121 灭菌2030min2玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌 干热消毒灭菌饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力温度（）饱和蒸汽压力温度（）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.63塑料器皿

5、灭菌： 多采用高压蒸汽消毒灭菌4金属器具灭菌：灼烧灭菌 浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后运用5接种室灭菌空气消毒灭菌接种室超净任务台紫外灯照射70%75%的酒精擦洗培育资料的接种紫外灯照射6外植体灭菌流水冲洗1020min或更长时间70%75%酒精中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸馏水冲洗45次在10%的次氯酸钠、饱和漂白粉浸泡30min左右备用常用消毒剂消毒灭菌比较表消毒剂使用浓度（%）去除难易消毒时间（min）效果次氯酸钙次氯酸钠漂白粉溴水过氧化氢升汞酒精抗生素硝酸银9102饱和溶液1210120.11707545（mg/L1易易易易最易较难易中较难53

6、05305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好较好好六、无菌操作实验员消毒实验室、无菌台灭菌实验器材的灭菌无菌接种消 毒实验台卫生培育室培育1、消毒，改换实验服、帽子与鞋子，进入接种室。2、翻开超净任务台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后封锁。3、开启过滤室风机，使无菌风吹拂任务台面和周围的台壁。4、用70%75%的酒精擦拭任务台和双手。5、用沾有70%75%酒精的纱布擦拭盛培育基的培育器皿，放进任务台。6、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。7、在酒精灯火焰附近切割备用的接种资料。8、翻开瓶口，用火焰烧瓶口，

7、转动瓶口使瓶口各部分都烧到。9、取下接种器械，在火焰上消毒。10、把培育资料放入培育瓶，盖上瓶口。11、接种终了后，清理和封锁超净任务台。留意：操作期间应经常用70%75%的酒精擦拭任务台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。第二节 植物组织培育所需的环境 条件及营养成分一、环境条件 与自然条件一样，组织培育中的外植体的生长要遭到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培育基的组成、pH值和浸透压等各种化学条件，以及外植体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影响。如何根据需求来控制培育条件是组织培育中的一个重要问题。温度光照湿度气体浸透压pH值普通最适温度在25

8、2之间环境条件最常用的是光照16h，黑暗8h 普通情况下，培育器内相对湿度应达100%，培育室内环境的相对湿度在70%80% 氧气是愈伤组织生长所必需的 调理浸透压经常从糖入手 培育基的pH值大多在5.06.5，5.8二、营养成分 植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为构造物质；b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活泼的新陈代谢；c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳 定、电荷平衡点等化学方面的作用；d、发育方面，特定的元素影响植物的形状发生和组织、 器官建成。Arnon和Stout1939提出确实定植物必

9、需营养元素的3个规范:阿隆和斯托德 A、缺乏该元素，植物生育发生妨碍，不能完成其生活史;B、缺乏该元素，就表现为专注的病症，且这种缺素症可以用补充该元素来预防和恢复;C、该元素在植物营养生理上表现直接的效果，而不是由于土壤的物理、化学、微生物条件的改良而产生的间接效果。 国内外公认的高等植物所必需的营养元素有1617种： C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl、Ni 在植物中含量差别很大，同一元素在植物不同时期、不同条件下含量也不同。根据植物体内含量多少，可把这些元素分为大量营养元素：占干物质分量的0.1%以上； C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等

10、9种微量营养元素：占干物质分量的0.1%以下 有的只含0.1mg/kg Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种按照国际植物生理协会的建议： 所需浓度 0.5mmol/L的元素为大量元素 所需浓度 0.5mmol/L的元素为微量元素1、大量元素N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。 P是磷脂的主要成分。培育基中常用KH2PO4 NaH2PO4等。 K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有亲密关系。Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体构造具有稳定作用；S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca是构成细胞壁的成分

11、，对细胞分裂，稳定质膜构造有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。2、微量元素 在微量元素中，铁的运用最大： 一些氧化酶的组成成分 叶绿素构成的必要条件 运用乙二胺四乙酸铁EDTA-Fe鳌合物防止铁的沉淀 硼与蛋白质合成、糖类运输有着亲密的关系 铜是某些氧化酶的成分，可以促进离体根的生长 锰参与植物的光合、呼吸代谢 钼参与氮素的代谢 氯是光协作用水光解的活化剂 微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调理。缺铁病症：叶面呈绿色网纹状失绿。随病势开展，叶片失绿程度加重，出现整叶变为白色，叶缘枯焦，引起落叶。严重缺铁时，新梢顶端枯死。 桃树缺铜病症： 新梢顶端叶片的

12、叶尖失绿变黄，叶片出现褐色斑点至扩展变成深褐色，引起落叶。 枝顶端生长不良，其下部的芽开场生长，构成丛生的细枝。 菊花缺锰病症： 叶脉间失绿褪色，但叶脉仍坚持绿色，脉间出现坏死斑，缺素病症由幼叶开场。 菜豆梨缺锰症缺钼病症：叶较小，叶脉间失绿,有坏死斑点，且叶边缘焦枯，向内卷曲。十字花科植物缺钼时叶片卷曲畸形，老叶变厚且枯焦。 白菜缺硼病症： 受精不良，籽粒减少 ，“花而不实， “蕾而不花； 根尖、茎尖的生长点停顿生长，而构成簇生状； 常引起各种腐烂病。 马铃薯缺锌病症： 小叶病，叶片变小，两节之间缩短。叶脉间失去绿色或者变白。植物缺素症缺氮：首先表如今老叶上均一的缺绿景象；缺磷：老叶片发蓝稍

13、带紫色，叶缘变为紫红色，叶尖枯死；缺钾：先表如今老叶斑驳的缺绿病症叶缘枯黄，卷曲伸展，茎的节间变短；缺钙：新叶叶片变小、枯死，即干烧心；缺硫：首先表现为新叶叶片缺绿或发紫；缺锰：新叶脉间失绿；缺铁：叶片黄，叶脉绿；缺硼：顶呀和附近的嫩叶变黑坏死，生长矮化，丛枝；缺锌：老叶脉间缺绿，出现白色坏死斑；缺铜：新叶上由叶尖沿叶缘逐渐坏死，严重整叶萎蔫过早零落；缺钼：不能构成花器或花早落。 3、碳源 碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。 糖类物质特点： 具有遇热易变 利于吸收和利用 运用浓度普通在2%-5% 提供能源和调理浸透压 4、维生素类 以各种辅酶的方式存在 参与多种代谢活动

14、 对生长，分化等有很好的促进作用 主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素 常用维生素有VB1和VB6 5、肌醇 环己六醇 细胞壁的构建资料 参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动 促进活性物质发扬作用6、氨基酸 蛋白质的组成成分 有机氮源 可直接被细胞吸收利用 培育基中常用的是甘氨酸7、天然复合物 促进某些愈伤组织和器官的生长 化学成分不明、复杂 天然营养混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物8、琼脂 是运用最普遍的凝固剂用量普通在6-10g/L之间颜色以浅、透明度高的好，干净为上品 除了琼脂外，在组织培育中还可以运用卡拉胶、琼脂糖、结冷胶等。9、活性炭 吸附培育基及培育物分泌物中的抑制

15、物质 抑制外植体褐变 防止玻璃苗的产生 促进培育物生长和分化 促进生根10、抗生素 防止外植体内生菌呵斥的污染活性炭11、生长素类 促进细胞伸长和分裂 促进生根、抑制器官零落、性别控制、延伸休眠、顶端优势、单性结实 诱导愈伤组织构成 溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好 常用的生长素： IAA(吲哆乙酸) NAA (奈乙酸 ) 2,4-D(二氯苯氧乙酸) IBA(吲哆丁酸)12、细胞分裂素类 促进细胞分裂和分化 诱导胚状体和不定芽的构成 延缓组织的衰老并加强蛋白质的合成 用于离体成花的调控 溶于0.5-1.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中 常用的细胞分裂素： K

16、T (激动素) BA(6-卞基腺嘌呤) 2-ip(异戊烯氨基嘌呤)玉米素13、赤霉素类和零落酸 A、赤霉素类 组织培育中不常运用 加速细胞的伸长生长 促进细胞的分裂 主要是GA3 B、零落酸(ABA) 抑制细胞分裂和伸长 促进零落和衰老 促进休眠和提高抗逆才干培育基形状不同：固体培育基、液体培育基培育过程不同：初代培育基、继代培育基其作用不同：诱导培育基、增殖培育基、生根培育基 营养程度不同：根本培育基、完全培育基一、培育基的种类第三节 培育基的配制、灭菌与保管1、MS培育基 无机盐浓度高 高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐 含有一定数量的铵盐 营养丰富 不需求添加更多的有机附加物二、几种常见培育基

17、的特点2、White培育基 1943年由White为培育番茄根尖而设计 1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和添加硼元素 无机盐浓度较低 运用广泛 在生根培育、胚胎培育中有良好的效果大量元素含量微量元素含量铁盐含量有机物含量其他含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇100蔗糖30000Ca(NO3)2 4H2O300MnSO4 4H2O7.0烟酸0.3琼脂8000MgSO4 7H2O720ZnSO4 7H2O3.0盐酸硫胺素0.1NaH2PO4 4H2O16.5MoO30.0001盐酸吡哆辛0.1KCl65CuSO4 5H2O0.001甘氨酸3Na2SO4200附表：

18、White培育基3、B5培育基 1968年由Gamborg等为培育大豆根细胞而设计 含有较低的铵盐 较高的硝酸盐和盐酸硫胺素组成成分 数量(mg/l）组成成分 数量(mg/l) KNO3 2500 FeSO47H2O27.8 CaCl22H2O 150 CuSO45H2O 0.025 MgSO47H2O 250 蔗糖40 (NH4)2SO4 134 pH 5.5KI 0.75 肌醇100 H3BO4 3.0 烟酸 1.0 MnSO44H2O 10 盐酸吡哆醇 1.0 ZnSO47H2O 2.0 激动素 0.1 Na2MoO42H2O0.25 2,4D 0.11.0 CoCl26H2O0.025

19、 盐酸硫铵素 10 Na2-EDTA37.3 B5培育基的组成和配方4、N6培育基 1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培育设计 KNO3和NH4SO4含量高，不含钼组成成分 数量(mg/l) 组成成分(mg/l) KNO3 2.3 Na2EDTA 37.3 CaCl22H2O 166 FeSO47H2O 27.8 MgSO47H2O 185蔗糖 50 KH2PO4 400 pH 5.8 (NH4)2SO4 463 烟酸 0.5 KI 0.8 盐酸吡哆醇 0.5 H3BO3 1.6 甘氨酸 2.0 MnSO44H2O 4.4 盐酸硫铵 1.0 ZnSO47H2O 1.5N6培育基组成及配方

20、配制培育基应做好几点任务：1、实验器具的预备。包括配制过程中所需电炉、酸度计、高压灭菌锅等设备及其他玻璃器皿的清洗和预备.2、试剂、药品的预备3、根据培育基的配方、母液扩展倍数及需求配制的培育基体积计算所需各种母液及其他附加物的量三、培育基的配制详细操作如下：1、取规定数量的糖源和凝固剂置于烧杯或搪瓷锅内，加蒸馏水加热使之溶解，并不断搅拌；2、根据计算所需量依次参与大量元素、微量元素、铁盐、有机物、生长调理物质母液及其他特殊的附加物，搅拌均匀；3、加水定容至规定体积，搅拌均匀；4、调整培育基的pH值；5、分装倒；6、封口拧盖。 组织培育必需在无菌环境中进展，因此培育基的灭菌操作非常重要。 培育

21、基分装封口后立刻进展灭菌，至少在24h内完成灭菌程序。 普通采用的是高压蒸汽灭菌。四、培育基的灭菌 灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，运用时要留意一下几点：1、锅中应放足量的水，以免呵斥空烧或干烧；2、装锅时不要过度倾斜，可坚持内部有一定的空 间，利于蒸汽流动；3、增压前高压锅内的空气必需排净，否那么易影响 灭菌效果；4、灭菌过程中，应尽量坚持压力恒定，严厉遵守灭菌时间；5、排气降压时应缓慢进展；6、只需待高压锅内压力表指针恢复到零后，才干开启压力锅；7、高压锅任务时，应有专人看守。高压灭菌的原理在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度

22、也随之添加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。 本卷须知 完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才干彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：封锁放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，翻开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再封锁放气阀。关阀再通电后，压力表上升到达0.1MPa时,开场计时，维持压力0.10.15MPa 20分钟。 在同一温度下，湿热的杀菌效能比干热大，其缘由有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量添加，所需凝固温度降低

23、，二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100时，由气态变为液态时可放出226kJ千焦的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而添加灭菌效能。 在运用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除能否完全极为重要，由于空气的膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 假设压力未降到0时，翻开排气阀，就会因锅内压力忽然下降，使容器内的培育基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，呵斥棉塞沾染培育基而发生污染。 灭菌后的培育基经冷却和凝固后即可运用检验灭菌效果。 检验方法： 将培育基置于培育室中3天，假设没有

24、污染景象，阐明灭菌可靠，可以运用。 保管在低温条件下。常温下保管时要进展防尘和避光处置。 保管时间不可过长。五、培育基的保管第四节 外植体的选择和灭菌 一、 外植体的选择 二、 外植体的灭菌方法 三、 污染缘由和预防措施 一、外植体的选择 植物组织培育的主要过程大致包括：外植体的选择、培育基的制备、器具的消毒、无菌操作和环境条件的调控。 1、选择优良的种质 无论是离体培育繁衍种苗，或者是进展生物技术研讨，培育资料的选择都要从主要的植物入手，选取性状优良的种质，或特殊的基因型。对资料的选择要有明确的目的，具有一定的代表性，提高胜利机率，添加其适用价值。 2、选择强壮的植株 组织培育用的资料，最好

25、从生长强壮的无病虫的植株上，选取发育正常的器官或组织。由于这些器官或组织代谢旺盛，再生才干强，比较容易培育胜利。3、选择最适的时期 组织培育选择资料时，要留意植物的生长季节和植物的生长发育阶段。如快速繁衍时应在植株生长的最适时期取材，这样不仅成活率高，而且生长速度快，增殖率高。4、选取适宜的大小 建立无菌资料时，取材的大小根据不同植物资料而异。资料太大易污染，也不需求；资料太小，多构成愈伤组织，甚至难于成活。普通选取培育资料的大小，在0.5cm-1.0cm。假设是胚胎培育或脱毒培育的资料，那么应更小。二、外植体的灭菌方法1、常用灭菌药剂的运用和效果2、外植体的灭菌方法1、常用灭菌药剂的运用和效

26、果灭菌剂使用浓度（%）清除的难易消毒时间效 果次氯酸钙910易530很好次氯酸钠2易530很好漂 白 粉饱和浓度易530很好氯 化 汞0.11较难210最好酒 精7075易0.22好过氧化氢1012最易515好溴 水12易210很好硝 酸 银1较难530好抗 菌 素450mg/L中3060较好2、外植体的灭菌方法 外植体在接种前先要灭菌，在灭菌前，又先要进展预处置。植物资料普通采取的预处置方法是：先对植物组织进展修整，去掉不需求的部分，将预备运用的植物资料在流水中冲洗干净。经过预处置的植物资料，其外表仍有很多细菌和真菌，因此还需进一步灭菌。 常规的外表灭菌处置方法把资料放进70%的酒精中约30

27、s。用0.1%的升汞HgCl2浸泡5 10min 。 或用10%的次氯酸钠溶液浸泡10 15min。无菌蒸馏水冲洗35次。灭菌时进展搅动，使植物资料与灭菌剂有良好 的接触。在灭菌剂里滴入数滴0.1%的Tween20吐温 或Tween80潮湿剂，那么灭菌效果更好。 三、污染缘由和预防措施1、污染的缘由污染是指在组织培育过程中培育基和培育资料繁殖杂菌，导致培育失败的景象。污染的缘由：从病原菌方面来分析主要有细菌及真菌两大类；从污染的途径而言，主要是由于外植体带菌、培育基及器皿灭菌不彻底、操作人员未遵守操作规程等引起的。细菌污染的特点：是在资料附近的培育基中出现浑浊和云雾状痕迹。普通在接种后12天即

28、可发现。缘由：资料带菌； 培育基灭菌不彻底； 操作人员未遵守操作规程。因此接种人员的手应经常用70%酒精擦洗，镊子、剪刀、接种针在运用前必需在火焰上烧红。真菌污染的特点：培育瓶内往往会出现白、黑或绿等不同颜色菌丝块。在接种后310天才干发现。缘由：周围环境不清洁； 超净任务台的过滤安装失效； 培育瓶等器皿的口径过大。为了减少损失，提高任务效率，必需在每个操作环节留意防止污染的发生。 2、污染的预防措施发现污染的资料应及时处置，否那么将导致培育室环境污染。对一些特别珍贵的资料，可以取出再次进展更为严厉的灭菌，然后接入新颖的培育基中重新培育。要处置的污染培育瓶最好在翻开瓶盖前，先集中进展高压灭菌，

29、再去除污染物，然后洗净备用。现就根据污染途径，论述污染的几个预防措施:1防止资料带菌的措施1用茎尖作外植体时，可在室内或无菌条件下对 枝条先进展预培育。枝条 水洗净 插入无糖的营养液或自来水 抽枝 以这种新抽的嫩枝条作为外植体 接种。这样便可大大减少资料的污染。在无菌条件下对采自田间的枝条进展暗培育，待 抽出徒长的黄化枝条时采枝，经灭菌后接种也可明 显减少污染。 2选择适宜的时间去田间采取外植体防止阴雨天去田间采取外植体。在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因资料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。 但目前对资料内部污染还没有令人称心的灭菌方法。在菌类长入组织内部时，不但要除去

30、上年生的鳞片，甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，以收到一定的防污染效果。2外植体的灭菌1多次灭菌法： 首先除去主脉因主脉与支脉交界处常有真菌休眠孢子存在； 其次，将切好的外植体放入1.3%的次氯酸盐溶液中，灭菌30min； 第三，在无菌蒸馏水中冲洗3-5次； 第四，将资料封锁在无菌的培育皿中过夜，坚持一定温度； 第五，次日将叶片用2.6%次氯酸钠灭菌30min，然后用蒸馏水洗3-5次。2多种药液交替浸泡法 对容易污染而难灭菌的资料：首先取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分洗净，外表不可附着污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片；第2，将资料放入70%酒精中灭菌数

31、秒钟；第3，在1：500Roccal B一种商品灭菌剂名稀释液中浸5min；第4，放入5%10%次氯酸钠溶液中并滴入“吐温80数滴，灭菌1530min，或浸入0.1%0.2%升汞溶液中并参与“吐温80数滴，灭菌510min；第5，用无菌水冲洗5次。也可从次氯酸钠溶液中取出后，再放入无菌的0.1M盐酸中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。 3玻璃器皿的灭菌湿热灭菌法即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进展高温高压灭菌，灭菌时间可延伸达25min30min。干热灭菌法即将玻璃器皿置入电热烘箱中进展灭菌。煮沸灭菌即将玻璃器皿放入水中煮沸进展灭菌。4金属器械的灭菌 火焰灭菌法：即把金属器械放在95%的酒精中浸一

32、下，然后放在火焰上熄灭灭菌。这一步骤该当在无菌操作过程中反复进展。干热灭菌法：即将擦洗干净或烘干的金属器械用纸包好，盛在金属盒内，放在烘箱中灭菌。湿热灭菌法：任务服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，121C的温度，灭菌20 min30min。5布质制品的灭菌 6无菌操作室的灭菌 无菌操作室的地面、墙壁和任务台的灭菌可用2%的新洁尔灭或70%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20-30min。运用前用70%的酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。7操作人员在接种时一定要严厉按照无菌操作的程序进展在接种前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉

33、溶液洗手，最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10min，后用70%的酒精擦手，并用70%的酒精擦拭母种瓶外表进展消毒，以防把微生物带进超净任务台。任务人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话。操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染。如脱毒培育抽取茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌。 小 结第一节 外植体的选择 ：优良种质、强壮植株 、最适的时期、适宜的大小。 第二节 外植体的灭菌方法：9种常用灭菌药剂的运用及其效果 、外植体的灭菌方法。第三节 污染缘由和预防措施：污染的缘由、污染的预防措施防止资料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器械的灭菌、布质制品的灭菌、

34、无菌操作室的灭菌、操作人员在接种时一定要严厉按照无菌操作的程序进展。 第五节 外植体的接种和培育 一、 外植体的接种 二、 培育条件 一、外植体的接种 外植体的接种是把经过外表灭菌后的植物资料在无菌环境中切割或分别出器官、组织、细胞并转入到无菌培育基上的全部操作过程。 操作过程中引起的污染，主要由空气中的杂菌和任务人员本身引起的。因此除接种室空气消毒外，应特别留意防止任务人员本身引起的污染。整个接种过程均须无菌操作：1操作人员需穿着经消毒的白色任务服，戴口罩、帽子、鞋套。进入接种室前，双手必需进展消毒，用肥皂和水洗涤能到达良好的效果, 进展操作前再用70%的酒精擦洗双手。2操作期间经常用70%

35、的酒精擦拭双手和台面。特别留意防止“双重传送的污染，例如器械被手污染后又污染培育基等。3在翻开培育瓶、三角瓶或试管时，最大的污染危险是管口边沿沾染的微生物落入管内，处理这个问题，可在翻开前用火焰烧瓶口。假设培育液接触了瓶口，那么瓶口要烧到足够的热度，以杀死存在的细菌。为防止灰尘污染瓶口，可用纸包扎瓶口和塞子，以遮盖瓶子颈部和试管口，相对地减少污染机会。4工具用后及时消毒，防止交叉污染。5任务人员的呼吸也是污染的主要途径。通常在安静呼吸时细菌是很少的，但是说话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程应制止不用要的说话并戴上口罩。6由于空气中有灰尘，因此在操作时，仍要留意防止灰尘的落入。尽量把盖子盖好，当

36、翻开瓶子或试管时，应拿成斜角，以免灰尘落入瓶中。刀、剪、镊等器具，普通在运用前浸泡在95%酒精中，用时在火焰上消毒，待冷却后运用。每次运用前均需进展器具消毒。 二、外植体的培育条件 接种后的外植体应送到培育室去培育。组织培育的优点之一就是在人工控制的环境条件下，使培育物生长发育，研讨植物的生命活动。培育室的培育条件要根据植物对环境条件的不同需求进展调控。其中最主要的是光照、温度、湿度、氧气和培育基的pH值等。1、光照 对离体培育物的生长发育，光照条件有重要的作用。通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，在有光条件下培育的愈伤组织质地和颜色也有不同。但分化器官需求光照，并随着芽苗的生长需求加强光

37、照。加强光照，可以使小苗生长强壮，促进“异养向“自养转化，提高移植的成活率。普通培育室要求每日光照12h-16h，光照强度1000lx-5000lx。假设培育资料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适宜的黑色资料包裹在容器的周围，或置于暗室中培育。 2温度 离体培育中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多数植物最适温度在23C-32C之间。培育室普通所用的温度是25C2C。低于15C或高于35C，对生长都是不利的。 3湿度 组织培育中的湿度影响主要有两个方面，一是培育容器内的湿度，它的湿度条件常可保证100%。二是培育室的湿度，它的湿度变化随季节和天气而有很大变动。湿

38、度过高过低都是不利的，过低会呵斥培育基失水而干枯，或浸透压升高，影响培育物的生长和分化；湿度过高会呵斥杂菌滋长，导致大量污染。因此，要求室内坚持70%-80%的相对湿度。4氧气 植物组织培育中，外植体的呼吸需求氧气。在液体培育中，振荡培育是处理通气的良好方法。第六节外植体的褐变及其预防措施一、褐变的概念二、褐变的缘由三、褐变的影响要素四、褐变的预防措施葡萄嫩茎接种48h马铃薯茎尖接种40d 褐变：是指外植体在培育过程中本身组织从外表向培育基释放出褐色物质，以致培育基逐渐变成褐色，外植体也进一步变褐而死亡的景象。一、褐变的概念 褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少和多酚氧化酶活性有直接关

39、系。酚类很不稳定，溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致组织代谢紊乱，生长停滞不前，最终衰老死亡。 二、褐变的缘由 植物资料不同，褐变的程度有所不同。三、影响褐变的要素枣蝴蝶兰苹果环境、培育基、转接周期不同，褐变的程度不同。1、植物资料1基因型 不同种植物，同种植物不同类型、不同种类在组织培育中褐变发生的频率、严重程度都存在很大差别。木本植物木质素、单宁含量或色素含量高的植物容易发生褐变。这是由于酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体，酚类化合物含量高

40、，木质素、单宁或色素构成就多，而酚类化合物含量高将导致褐变的发生，因此，木本植物普通比草本植物容易发生褐变。苹 果苜 蓿 2资料年龄 幼龄资料普通都有比成龄资料褐变轻的趋势。幼龄资料褐变较轻与其酚类化合物含量少有关。Chever 分析欧洲栗的酚类含量变化的结果阐明，幼龄资料酚类化合物含量少，而成龄资料比较多。平吉成从山定子刚长成的实生苗上切取茎尖进展培育，接种后褐变很轻，随着苗龄增长，褐变逐渐加重，取自成龄树上的茎尖褐变就更严重。梨一年生枝、二年生枝接种3d3取材部位 Yu和Meredith在葡萄上发现从侧生蔓切取茎尖进展培育，比从延伸蔓切取的茎尖更容易成活，进一步分析酚类含量发现前者比后者少

41、。而苹果那么顶芽作外植体褐变程度轻，比侧芽容易成活。石竹和菊花也是顶端茎尖比侧芽茎尖更容易成活。 4取材时期 多酚氧化酶活性和酚类含量根本是对应的，春季较弱，随着生长季节的到来，酶活性逐渐加强，因此有人以为取材时期比取材部位更加重要。Chever报道，欧洲栗在3月15日-30日醌类物质构成少，而在5月-6月醌类物质明显提高。 蒋迪军和牛建新报道，金冠苹果茎尖小于0.5mm时褐变严重,当茎尖长度在5mm-15mm时褐变较轻,成活率可达85%。在多个苹果种类上实验结果阐明，用5mm-10mm长的茎尖进展培育效果最好，茎尖假设太小很容易发生褐变。另外，取外植体时还要思索其粗度，细的可切短些，粗的可切

42、得长些。 5外植体大小 主要是光照与温度。温度过高或光照过强，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。2、培育条件 1培育基形状 由于培育基中琼脂的用量和pH值的高低不同，培育基可配成固体培育基、半固体培育基或液体培育基。许多实验证明，液体培育基可以有效抑制外植体褐变，液体培育基再加上滤纸桥，效果就更好。在液体培育基中，外植体溢出的有毒物质可以很快分散，因此对外植体呵斥的损伤较轻。3、培育基2无机盐 在初代培育时，培育基中无机盐浓度过高，酚类物质将会大量外溢，导致外植体褐变。缘由是无机盐中的有些离子，如Mn2+、Cu2+是参与酚类合成与氧化酶类的组成成分或辅因子，因此盐浓度过高会添加

43、这些酶的活性，酶又进一步促进酚类合成与氧化。 3植物生长调理物质 初代培育处在黑暗条件下，生长调理物质的存在是影响褐变的主要缘由，此时去除生长调理物质可减轻褐变。细胞分裂素6-BA或KT不仅能促进酚类化合物的合成，而且还能刺激多酚氧化酶的活性，这一景象在甘蔗的组织培育中明显。而生长素类如2，4-D和IAA可延缓酚类化合物的合成，减轻褐变景象发生。 4抗氧化剂 培育基中参与抗氧化剂可改动外植体周围氧化复原电势，从而抑制酚类氧化，减轻褐变。 5吸附剂 活性炭和聚乙烯吡咯烷酮PVP作为吸附剂可以去除酚类氧化呵斥的毒害效应，这在东北红豆杉、猪笼草、鹤望兰、杜鹃花、苹果、桃和倒挂金钟等植物上都有过报道。

44、在倒挂金钟茎尖培育中只参与0.01%PVP便对褐变有抑制造用。 6pH值 培育基的pH值较低时，可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，从而抑制褐变。而pH值升高那么明显加重褐变。4、资料转瓶周期 对于易褐变的资料，接种后转瓶时间长，伤口周围积累醌类物质增多，褐变加重，以致全部死亡。而缩短转瓶周期可减轻褐变。在山月桂树的茎尖培育中，接种后12h24h，便转入液体培育基中，这之后的一周内，每天转一次瓶，褐变得到完全控制。在无刺黑莓上也有类似阅历 。四、褐变的预防措施1选择适宜的外植体 外植体应选择分生才干较强的资料。如采用实生苗茎尖、枝条顶芽、幼胚等资料培育褐变程度比较轻。2采用适宜的培育基和光温条件

45、 培育基的无机盐成分、蔗糖浓度、激素程度、温度适宜及在黑暗条件下培育，或在取外植体之前对母株进展遮光处置20d40d，可以显著减轻资料的褐变。 3在培育基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂 在培育基中参与0.1%0.5%的活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显。在许多热带树木的组织培育中均曾察看到活性炭防止外植体褐变的明显效果。如在培育基中加抗坏血酸、血洁白蛋白、有机酸、蛋白质、氨基酸等抗氧化剂和其他抑制剂，或用它们进展资料的预处置或预培育，可有效地预防醌类物质的构成。4缩短转瓶周期 这是组培中控制褐变常用且有效的方法。第七节 玻璃化景象及其预防措施一、玻璃化景象 是指组培苗出现叶、嫩梢呈水晶透明或

46、半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片伸展成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮短少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低的景象。 二、玻璃化苗的危害性 由于其组织畸形，吸收养料与光合器官功能不全，分化才干大大降低，因此很难继续用作继代培育和扩展繁衍的资料；加上生根困难，很难移栽成活。 三、玻璃化的缘由 玻璃化的原因是细胞生长过程中的环境变化。试管苗为了顺应变化了的环境而呈玻璃状。 产生玻璃化苗的要素主要有激素浓度、琼脂用量、温度、离子程度、光照时间、通风条件等。1、激素浓度 激素浓度添加尤其是细胞分裂素浓度提高或细胞分裂素与生长

47、素比例高，易导致玻璃化苗的产生。 2、琼脂浓度 培育基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例添加，水浸状严重，苗向上长。随着琼脂浓度的添加，玻璃化苗比例减少，但由于硬化的培育基影响了营养的吸收，试管苗生长减慢，分蘖亦减少。因此，琼脂的浓度一定要适当。 3、温度 适宜的温度可以使试管苗生长良好，当温度低时，容易构成玻璃化苗，温度越低玻璃化苗的比例越高。温度高时玻璃化苗减少，且发生的时间较晚。 4、光照时间 不同的植物对光照的要求不同，满足植物的光照时间，试管苗才干生长正常。大多数植物在12h14h光照下都能生长良好，光照时数大于16h时，玻璃化苗的比例明显添加。 5、通风条件 试管苗生长期间，要求有足够的气

48、体交换，气体交换的好坏取决于生长量、瓶内空间、培育时间和瓶盖种类。在一定容量的培育瓶内，愈伤组织和试管苗生长越快，越容易构成玻璃化苗。假设培育瓶容量小，气体交换不良，易发生玻璃化。 6、离子程度 植物生长需求一定的矿物质营养，但是，假设营养离子之间失去平衡，试管苗生长就会遭到影响。植物种类不同，对矿物质的量、离子形状、离子间的比例要求不同。假设培育基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会添加。 四、预防玻璃化的措施1适当控制培育基中无机营养成分 大多数植物在MS培育基上生长良好，玻璃化苗的比例较低，主要是由于MS培育基的硝态氮、钙、锌、锰的含量较高的缘故。适当添加培育基中钙、锌、

49、锰、钾、铁、铜、镁的含量，降低氮和氯元素比例，特别是降低铵态氮浓度，提高硝态氮浓度，可减少玻璃化苗的比例。2适当提高培育基中蔗糖和琼脂的浓度 适当提高培育基中蔗糖的含量，可降低培育基中的浸透势，减少外植体从培育基中可获得的水分；而适当提高培育基中琼脂的含量，可降低培育基的衬质势，呵斥细胞吸水阻遏，也可降低玻璃化。如将琼脂浓度提高到1.1%时，洋蓟的玻璃化苗完全消逝。衬质势因衬质成分外表吸附力(细胞胶体物质亲水性和毛细管对自在水束缚)而产生的水势。由于某种缘由而降低的水化学势而言。吸附在土壤粒子和细胞壁微纤维上的水，可分为1基于土壤粒子外表强有力的吸附力，主要是23层的水分子；2表现为来自弯月形

50、液面的外表张力的毛细管水；3外表电荷与水的氢结合所吸附的水。在这些情况下，作用力可使水的势能降低。 浸透势 溶液中由溶质存在所产生的水势。由于溶质对水分子的吸附作用，使水的活性下降，所以和纯水相比，含有溶质的水做功的才干降低了，故浸透势为负值。细胞吸水情况取决于细胞水势，典型的水势是由三个势组成的：w=+p+g w为细胞水势，为浸透势p为压力势，g为重力势。浸透势亦称溶质势浸透势是由于溶质颗粒的存在，降低了水的自在能，因此其水势低于纯水的水势,这种水势差即为浸透势。由于纯水水势被定为零，所以浸透势为负值。某溶液浸透势的绝对值与该溶液浸透压的绝对值相等。在规范压力下，溶液的浸透势等于溶液的水势，

51、由于溶液的压力势为0MPa。溶液的的浸透势决议于溶液中溶质颗粒总数。 3适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度 细胞分裂素和赤霉素可以促进芽的分化，但是为了防止玻璃化景象，应适当减少其用量，或添加生长素的比例。在继代培育时，要逐渐减少细胞分裂素的含量。4添加自然光照，控制光照时间 在实验中发现，玻璃苗放在自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消逝。这是由于自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。光照时间不宜太长，大多数植物以10h 14h为宜；光照强度在1500lx1800lx之间，就此可以满足植物生长的要求。5控制好温度 培育温度要适宜植物的正常生长发育。假设培育室的温度过低，应采取增温措施。

52、热击处置，可防止玻璃化的发生。如用40热击处置瑞香愈伤组织培育物可完全消除其再生苗的玻璃化，同时还能提高愈伤组织芽的分化频率。6改善培育器皿的气体交换情况 如运用棉塞、滤纸片或通气好的封口膜封口。7在培育基中添加其它物质 在培育基中参与间苯三酚或根皮苷或其它添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻璃化，如添加马铃薯法可降低油菜的玻璃化苗的产生频率，而用0.5mg/L多效唑或10mg/L的矮壮素可减少重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生；而添加1.5 g/L2.5g/L的聚乙稀醇成为防治苹果砧木玻璃化的措施。在培育基中参与0.3%的活性炭还可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃化有良好作用。第八节 试管苗的驯

53、化与移栽一、试管苗的特点1.试管苗的生态环境 组织培育中培育出来的苗通常称试管苗或组培苗。由于试管苗长期生长在试管或三角瓶等培育器皿中，与外界环境隔离，构成了一个独特的生态系统。 与外界环境条件相比具有以下4大差别，即高温、高湿、弱光和无菌。1高温且恒温 在植物试管苗整个生长过程中，通常均采用恒温培育，即使某一阶段稍有变动，温差也是极小的；并且在培育过程中，通常温度控制在252，有的植物需将温度控制得更高；而外界环境条件，温度处于不断变化之中，温度的调理完全是由自然界太阳辐射的日辐射量决议的，温差很大，而且普通不会到达252。2高湿 植物组织培育中试管或培育瓶内的水分挪动有2条途径，一是试管苗吸收的水分，从叶面气孔蒸腾；二是培育基向外蒸发，而后水汽凝结又进入培育基。这种循环就是培育瓶内的水分循环，其循环的结果呵斥培育瓶内空气的相对湿度接近于100，远远大于培育瓶外的空气湿度，所以试管苗的蒸腾量极小。可见培育瓶内的水分形状直接影响着试管苗的生长和各种生理活性。3弱光 组织培育中的光强与太阳光相比普通很弱，故幼苗普通生长也较弱，经受不了太阳光的直接照射。4无菌 不仅培育基无菌，而且试管苗也无菌。