蛋白质分子设计精选

1、蛋白质分子(fnz)设计共五十四页分子(fnz)设计分子设计的提出的背景1927 年HeitlerLondon 用量子力学(lin z l xu)成功讨论氢分子的结构,量子化学迅速发展。计算技术的革命和计算方法的改善,量子化学的应用范围越来越广,其概念和计算方法逐渐应用到了化学动力学、催化、电化、生物、药物等领域,产生了一个个新的学科分支微观反应动力学、量子催化、量子电化、量子生物和量子药物等,和光谱学结合,更促使化学及其相邻学科朝着推理化、定理化、微观化的方向发展。2共五十四页分子设计(shj)的定义20 世纪70 年代,美国麻省理工学院霍恩贝尔教授提出了分子设计。即从分子、电子水平上,通过

2、数据库等大量实验数据,结合现代量子化学(lin z hu xu)方法,通过计算机图形学技术等设计新的分子。设计的新分子或具有某种特定性能,可以是药物、材料或其他,或是一种概念、一种复合物或具有分子意义的物质(如催化剂等) 。3共五十四页蛋白质的分子(fnz)设计蛋白质分子设计是一门新兴的研究领域，其本身在不断(bdun)地发展，其内容也在不断(bdun)地更新。蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案。蛋白质分子设计的目的：蛋白质工程提供指导信息探索蛋白质的折叠机理。 4共五十四页蛋白质设计目前存在的问题1、与天然的蛋白质比较(bjio)，缺乏结构的独特性及明 显的功能优越性2

3、、三级结构的确定性较差共五十四页第一节 基于天然蛋白质结构(jigu)的设计一、概述(i sh) 计算机模拟 基因构建突变蛋白质产品功能分析蛋白质设计循环共五十四页蛋白质设计涉及多种学科的配合，如计算机模拟专家、X射线晶体学家、蛋白质化学家、生物技术专家等的合作和配合专一性突变产物是蛋白质设计成败的关键。一些新技术，如PCR及自动化技术的发展使各种类型的基因工程变得快速、容易。计算机模拟技术在蛋白质设计循环中占有重要位置，建立蛋白质三维结构模型，确立突变位点或区域以及预测(yc)突变后的蛋白质的结果和功能对蛋白质工程是至关重要的。在明确突变位点或蛋白质序列应改变的区域后，可以进行定位突变，但要

4、得到具有预期结构和功能的蛋白质是不容易的，可能需要经过几轮的循环共五十四页蛋白质三维结构(jigu)知识的必要性8蛋白质三维结构知识对于蛋白质工程是绝对必要的。目前PDB(Protein Data Bank)已收集数以万计个蛋白质晶体结构，但是通常蛋白质序列的数目比蛋白质三维结构的数目大100倍。当我们开始对某一天然蛋白质进行蛋白质分子设计时：首先要查找PDB了解这个蛋白质的三维结构是否已被收录。如果PDB中没有(mi yu)收录又未见文献报道，我们需要通过蛋白质X射线晶体学及NMR方法测定蛋白质的三维结构，或者通过结构预测的方法构建该蛋白质三维结构模型。共五十四页蛋白质分子设计(shj)的流

5、程天然(tinrn)蛋白质蛋白质结构预测蛋白质晶体学蛋白质三维结构结构与功能的关系蛋白质突变体设计及结构预测几何优化及蛋白质动力学研究结果分析与原先的结构比较蛋白质合成定位突变分离、纯化及表征新蛋白质数据的输入共五十四页Pr突变体设计(shj)的3个步骤从天然蛋白质的三位结构出发（实验测定或预测），利用计算机技术确定突变位点及替换的氨基酸利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构预测的结构与原始的蛋白质结构比较，利用蛋白质-功能或结构稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质共五十四页二、 蛋白质分子设计(shj)原理内核假设。蛋白质的独特的折叠形式是由蛋白质内核中残基的相互

6、作用决定。（内部十分保守的区域）Pr内部都是密堆积（很少有空穴大到水分子可以结合一个水分子或惰性气体），没有重叠所有(suyu)内部的氢键都是最大满足的（主链和侧链）。蛋白质的氢键形成涉及一个交换反应，溶剂键被蛋白质键所取代疏水及亲水基团需要合理的分布在溶剂可及表面及不可及表面。分布代表疏水效应的主要驱动力共五十四页 蛋白质分子(fnz)设计原理金属Pr中配位残基的替换要满足(mnz)金属配位几何。要求围绕金属中心放置合适数目的蛋白质侧链或溶剂分子，并符合正确的键长、键角以及整体的几何。对于金属Pr，围绕金属中心的第二壳层中的相互作用是重要的。氢键的第二壳层通常涉及与蛋白质主链的相互作用。最优

7、的aa侧链几何排列。Pr侧链构象由空间两个立体因素所决定(一是立体势垒，二是aa的位置)结构及功能的专一性。这是Pr设计最困难的问题共五十四页蛋白质分子设计(shj)的分类蛋白质分子设计又可按照改造部位的多寡分为三类(sn li)：第一类为“小改”，可通过定位突变或化学修饰来实现；第二类为“中改”，对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装；第三类为“大改”，即完全从头设计全新的蛋白质（de novo protein design）。13共五十四页小改少数(shosh)残基的替换定义： 小改是指对已知结构(jigu)的蛋白质进行少数几个残基的替换，这是目前蛋白质工程中最为广泛使用的方法。采用的方法：

8、 主要通过定点突变技术或盒式替换技术有目的改变几个氨基酸残基，借以研究和改善蛋白质的性质和功能。 14共五十四页小改两个(lin )层次1已知立体结构基础上所进行的工作，直接将立体结构信息(xnx)与蛋白质的功能相关联的高层次的设计2借助蛋白质一级结构的序列信息及生物化学性质，在未知立体结构的情形下所进行的分子设计工作本部分只介绍第一种，实际上第一种已经包含第二种，第二种只是在不得已的情况下采取的一种努力。15共五十四页一、定位(dngwi)突变 基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前(mqin)蛋白质工程中最广泛使用的方法，

9、主要可分为蛋白质修饰和基因定位突变两类。 共五十四页（一）定位突变的设计目标(mbio)及解决方法 定位突变常见的设计(shj)目标是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构-功能关系的研究等。 共五十四页Hartley等于1986年完成了一个设计(shj)目标及解决的办法 ：热稳定性对氧化的稳定性对重金属的稳定性pH稳定性提高(t go)酶学性质引入二硫桥，增加内氢键数目，改善内疏水堆积把Cys转换为Ala或Ser，把Trp转换为Phe或Tyr替代表面羧基，把Met转换为Gln、Val、Ile或Leu替换表面荷电基团，His、Cys以及Tyr

10、的置换专一性的改变，增加逆转数， 改变酸碱度 共五十四页（二）定位(dngwi)突变的种类 要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变技术等。 根据基因突变的方式，分为以下三类： 插入一个或多个(du )氨基酸残基； 删除一个或多个氨基酸残基； 替换或取代一个或多个氨基酸残基。 要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组DNA技术或PCR方法。共五十四页蛋白质中功能(gngnng)残基的鉴定根据结构(jigu)信息确定残基的突变突变方法鉴定突变功能残基利用蛋白质同源性鉴定功能残基三、蛋白质中功能残基的鉴定共五十四页1根据(gnj)结构信息确

11、定残基的突变最有效最直接(zhji)的方法 Alan Fersht和GregWinter等测定了酪氨酰-tRNA合成酶突变体的三维结构，通过分析该酶的Cys35被结构相似的丝氨酸所取代后的结构，发现Cys35可能与酪氨酰腺苷酸中间体中的3羟基形成氢键，突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。 共五十四页例一：核糖核酸(h tn h sun)酶 小改举例结构知识：核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，该天然酶具有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys103）。小改设计：在不失去酶活性的基础(jch)上增加它的稳定性，日本大阪大学蛋白质工程研究所的Satoshi N

12、ishikawa等人尝试在Tyr（酪氨酸）24和Asn（天冬酰氨）84位引入第三个二硫键。22共五十四页分子设计和理论验证：从该酶晶体结构可以看出这两个残基是远离催化位点的，经过分子动力学计算证明在这两个残基之间有可能形成二硫键，并且不会影响催化位点的结构。并且采用分子力学和分子动力学方法从核糖核酸的复合物晶体结构建立起核糖核酸突变体的模型。将Tyr24和Asn84两个残基侧链（保留C，C）消除，将C转变为S。P3然后经过1000轮突变部位能量最小化和2000轮整体能量最小化以及分子动力学模型建立突变体的结构模型，结构模型中没有不合理的键长、键角和二面角。从设计的角度看这个突变是合理的。方案的

13、实施：通过基因(jyn)技术得到突变体，实验证明突变体在保持天然酶活性的基础上大幅度提高了酶的热稳定性。 23共五十四页例二、酪氨酰-tRNA合成酶的分析(fnx)在酪氨酰-tRNA合成酶中Cys35被结构(jigu)相似的氨基酸Serine(19)所取代。在这个酶的低分辨率的晶体结构（0.3nm）中看出，Cys35在结合腺苷酸中间体中的3羟基形成氢键，见图。突变效应降低了酶的活性，证实了Cys35在结合腺苷酸部分的作用。以后的高分辨率的酶结合酪氨酸腺苷酸的晶体结构表明在酶与底物之间可能存在11条氢键，每个氢键基团都经过突变实验证实每个基团对于催化功能的贡献。共五十四页共五十四页2其他实验方法

14、鉴定(jindng)突变功能残基随机突变删除分析(fnx)连接片段扫描突变 共五十四页例1：HIV-1蛋白酶蛋白酶的99个残基的编码区的每个残基用不同的氨基酸替换，得到33个突变体，平均每个残基有3.3个替代物。在82位置非保守残基的替换会引起误导。缬氨酸在这个(zh ge)位置视疏水残基（Ile,Leu,Phe）或小的中性残基（Ala,Thr）的取代对蛋白质的功能没有产生有害影响。而非保守残基（Asp或Gly）的置换是没有可容忍性。实验证明三个区域对突变是灵敏的，而且推测其有功能重要性。基于位置9的脯氨酸用Thr、His及Arg替代没有可容忍性，说明它是重要的。用Ser(典型的保守残基)替代

15、对活性没有影响，说明这个位置是结构灵敏而不涉及蛋白酶的活性共五十四页例2：扫描(somio)删除分析对鼠和人GM-CSF重要活性区域的鉴定GM-CSF（粒状白细胞大噬菌体激活因子）的功能是刺激血细胞的增殖。通过突变在5个氨基酸的间隔(jin g)里删除3个氨基酸。通过蛋白质的E.coli大肠杆菌中表达以及检测它们刺激骨髓细胞线的增殖能力，与天然的GM-CSF比较，大多数的删除使活性完全丧失，只有很少几个删除保持中等的活性。鉴定出删除后完全失活的五个区域，其中两个是有专一性的，它们对受体结合活性有重要影响。共五十四页3利用(lyng)蛋白质同源性鉴定突变功能残基高度保守的残基与同源蛋白的共同功能

16、以及维持(wich)结构有关 。非保守残基是分析的靶位点，特别是对于专一性研究。探测突变蛋白质的结构整体性质，以鉴定突变残基。 共五十四页四、天然(tinrn)蛋白质的剪裁共五十四页第二节 全新(qun xn)蛋白质设计共五十四页一、引言(ynyn)共五十四页二、蛋白质结构(jigu)的从头设计共五十四页1.二级结构(jigu)模块单元的自组装共五十四页2.配体诱导(yudo)组装共五十四页3.通过共价交叉连接(linji)实现肽的自组装共五十四页4.在合成(hchng)模板上肽的组装共五十四页5.线性多肽(du ti)折叠为球状结构共五十四页6.基于(jy)组合库的全新蛋白质设计共五十四页三

17、、蛋白质的功能设计共五十四页1.通过反向拟合天然(tinrn)蛋白质设计新的功能共五十四页2.键合及催化的从头(cngtu)设计共五十四页3.在全新(qun xn)蛋白质中引入结合位点共五十四页4.催化活性蛋白质的设计(shj)共五十四页5.膜蛋白及离子通道的设计(shj)共五十四页6.新材料(cilio)的设计共五十四页第三节、计算(j sun)蛋白质设计共五十四页一、能量(nngling)表达共五十四页二、能量(nngling)优化共五十四页三、序列(xli)优化共五十四页四、序列(xli)-结构专一性共五十四页五、底物(d w)专一性设计共五十四页六、金属结合(jih)位点的设计共五十四页内容摘要蛋白质分子设计。分子设计的提出的背景。预测的结构与原始的蛋白质结构比较，利用蛋白质-功能或结构稳定性相关