蛋白质含量测定考马斯亮蓝染色法

1、实 验 一蛋白质含量(hnling)的测定 考马斯亮蓝G-250染色法 朱新霞召堂梦婷三十七页实验室规则(guz)考勤实验操作实验室安全（仪器、药品、水、电等）值日（桌面、地面(dmin)、门、窗、水、电等）考试共三十七页 实验名称 实验目的 实验原理（简述) 实验材料、仪器及其试剂 实验方法与操作步骤（工艺流程图或表格方式） 实验结果及分析（实验现象或实验结果数据整理、归纳、分析和对比） 讨论（实验方法、操作步骤、实验正(异)常结果、建议等） 标准(biozhn)的实验报告应该简洁明了地给出使别人能够重复你的实验所

2、需要的全部信息。 关于实验报告: 要用自己的实验记录(jl)认真地写出一份实验报告，不得互相抄袭。实验报告的内容:共三十七页蛋白质（protein）：是由-氨基酸按一定(ydng)序列通过肽键缩合而成的具有一定(ydng)功能的生物大分子。蛋白质的组成单位：氨基酸。蛋白质的元素组成元素CHONSP其他百分比50-556-720-23160-30-3共三十七页根据功能不同，蛋白质可分为：1、结构蛋白质：建造和维持生物体结构的蛋白质；2、酶：具有催化功能的蛋白质；3、调节(tioji)蛋白质：具有调控功能的蛋白质；4、转运蛋白质。共三十七页 1、学习(xux)利用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白

3、质含量的原理及方法； 2、掌握分光光度计的使用方法； 3、掌握标准曲线的绘制。 一、实验(shyn)目的：共三十七页 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液(rngy)中游离状态下为棕红色。 当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色. 蛋白质染料复合物对595nm可见光有最大光吸收. 在一定范围内（ 10 -1000ug/ml）其OD595nm值与蛋白质含量成正比，故可用分光光度法进行蛋白质的定量测定。二、实验(shyn)原理：共三十七页考马斯亮蓝G-250染色法原理(yunl)465 nm595 nm酸性环境(hunjng)下呈棕红色与蛋白质结合变蓝色加入蛋白质共三十七页双缩脲反应(fnyng)：Fo

4、lin-酚试剂法（Lowry法）：紫外吸收法：微量凯式定氮法：其他(qt)蛋白质含量的测定方法共三十七页（1）双缩脲法： 原理是蛋白质含有两个以上的肽键（-CO-NH-）因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，故可以(ky)用来测定蛋白质含量.几种(j zhn)其他蛋白质含量的测定方法共三十七页（2）Folin-酚试剂(shj)法（Lowry法）： 是双缩脲法的发展，第一步涉及到碱性溶液中铜蛋白质复合物的形成(xngchng)，然后这个复合物还原磷钼酸磷钨酸试剂，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）比双缩脲法灵敏，但费时； 共三十七页（3）紫外吸

5、收(xshu)法： 蛋白质中Trp，Phe，Tyr的残基中的苯环含有共轭双键，吸收高峰在280nm处，所以蛋白质具有吸收紫外光的性质，并且蛋白质溶液的光吸收值与其含量成正比，可用作定量测定。 简单、灵敏、快速、不耗样品(yngpn)，低浓度的盐类不干扰。 共三十七页（4）微量凯式定氮法： 根据蛋白质的平均含氮量为16%，因此(ync)，测得1g蛋白氮，相当于6.25g蛋白质。 共三十七页 1、 实验材料：绿豆芽、小麦种子、葡萄、苹果 2、仪器：(1)S-22pc可见光分光光度计 (2)研钵 (3)离心机 (4)试管(shgun) (5)容量瓶等 3、试剂：（1）染色液：考马斯亮蓝G-250 (

6、100mg 考马斯亮蓝溶于50ml 95%乙醇，加100ml 85%磷酸，加水稀释至 1L)（2）浓度：0.25mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液。 三、实验(shyn)材料、仪器和试剂：共三十七页 1、制作标准曲线： 取7支试管，依次(yc)分别加入0.0，0.10, 0.15, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水补足到0.5ml，每管均再加5ml染色液，立即摇匀，置室温下放置5分钟。然后测各管的OD595nm 值，绘制标准曲线。四、实验(shyn)步骤： 共三十七页标准(biozhn)曲线的绘制目的(md)：得到样品中蛋白质的浓度。首先，用一组已知浓度的蛋

7、白质溶液与考马斯亮蓝G-250反应,然后在595 nm处测定吸光度（OD）。其次，绘制浓度与吸光度对应的曲线图。最后，测定样品蛋白质的吸光度然后在曲线上找到对应的浓度。共三十七页 1、制作(zhzu)标准曲线： 编号1(空白）234567样品标准蛋白 (ml)0.00.10.150.20.30.40.50.5ml 水(ml)0.50.40.350.30.20.10.0浓度(mg/ml)0.00.050.0750.10. 150.20.25C0染色液(ml)55555 55 5OD值四、实验(shyn)步骤：共三十七页标准蛋白质浓度OD值0样品OD值C00.05 0 .0750.1 0.150.

8、20.25OD1OD2OD3OD4OD5OD6 标准(biozhn)曲线的制作（图）y=ax+bR2=共三十七页 称取豆芽叶片1g 研钵(yn b)中加2ml水研成匀浆转入离心管用水分三次冲洗研钵(yn b)，每次2ml均转入同一离心管 等重后8000转/分离心10分钟取上清液转入25ml容量瓶定容。2、样品(yngpn)蛋白质提取：共三十七页 取0.5ml提取液于试管中,加入考马斯亮蓝G-250 染色液5ml，充分混匀，放置5分钟，以制作标准曲线的1号试管为参比溶液，调吸光度为“0”，测豆芽提取液的吸光度A595nm，记录结果(ji gu)，查标准曲线，得蛋白质浓度X(mg/ml)。3、测定

9、(cdng)：共三十七页五、结果(ji gu)计算： 样品(yngpn)蛋白质含量（mg/g） = C0提取液的总体积/ 样品鲜重(g) 共三十七页分光光度(gungd)技术 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术(jsh)，使用的仪器称为分光光度计. 红外吸收光谱：波长范围2.51000 m,主要用于有机化合物结构鉴定。 紫外吸收光谱：波长范围200400 nm（近紫外区）可用于结构鉴定和定量分析。 可见吸收光谱：波长范围400750 nm ，主要用于溶液等的定量分析。共三十七页 光吸收定律

10、：朗伯比尔(Lambert-bee)光吸收定律： Alg（I0/It) -lgT b c（1）A吸光度 “OD”：描述溶液对光的吸收程度； 同一种(y zhn)溶液对不同波长光的吸光度是不相同的，在吸光度最大处所对应的波长称为最大光吸收处。同一种物质不同浓度的吸光度，在某一定波长下有差异，在最大光吸收处吸光度的差异最大。这是分光光度法进行物质定量分析的重要依据。I0：表示入射光强度，It ：表示光线通过溶液后的强度。共三十七页（2）T透光度：描述入射光透过(tu u)溶液的程度； （3）摩尔吸光系数(是溶液的特征常数)，在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光

11、度；单位molL1；（4）b样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收池，b=1cm（5）C样品浓度（mol/L）由上式可以看出：吸光度OD与物质的浓度“C”和溶液吸光的厚度成正比。 Alg（I0/It)=-lgTb c共三十七页 分光光度计的组成(z chn)和构造： （1）光源； （2）单色器 （3）吸收池； （4）接收检测放大系统(检测器)； （5）信号指示系统(显示或记录器)。共三十七页 光源： 用于可见光光源是钨灯和卤钨 ，现在最常用的是卤钨灯（Halogen lamp），适用(shyng)波长范围是3201100nm。 用于紫外光区的是氢灯和氘灯适用波长范围是195400nm。共

12、三十七页 单色器：单色器是分光光度计的心脏部分。把来自光源的混合光波分解(fnji)为单一波长的光能随意改变光的波长。单色器一般由入射狭缝、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。其核心部分是色散元件:主要是棱镜和光栅共三十七页吸收池吸收池（即比色杯）：用来盛装被测试的溶液。光学比色杯和石英(shyng)比色杯两种。 光学比色杯适用波长范围是400nm2000nm ，只能用于可见光。 石英比色杯可透过紫外光、可见光和红外光， 是最常使用的吸收池，使用波长范围是180nm3000nm。光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容积3ml）共三

13、十七页吸收池使用注意事项： 比色杯在使用前后(qinhu)都要彻底的清洗。 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。 严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。 共三十七页 检测器： 检测器是一种光电转换(zhunhun)设备，即把光强度以电讯号显示出来，常用的检测器有光电管，光电倍增管和光电二极管等。 显示装置：分光光度计现在(xinzi)已都使用数字显示，有的还连有打印机。高性能分光光度计均可以连接微机，而且有的主机还使用带液晶或CRT荧屏显示的微处理机和打印绘图机，有的还带有标准软驱，存取数据更加方便

14、。共三十七页偏离朗伯比耳定律(dngl)的原因 标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯比耳定律的偏离(pinl)。 引起这种偏离的因素（两大类）： （1）物理性因素，即仪器的非理想引起的； （2）化学性因素。共三十七页（1）物理(wl)性因素 难以获得真正的纯单色光。 朗伯比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。 分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带(un di)。复合光可导致对朗伯比耳定律的正或负偏离。 非单色光、杂散光、散射光和反射光、非平行入射光都会引起对Beer-Lambert定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏

15、离。 共三十七页(2) 化学性因素(yn s) 朗比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液(c10 2 mol/L 时，溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合、互变异构、配合物的形成和与溶剂间的作用，使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。 例： 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡： CrO42- 2H = Cr2O72- H2O 溶液中CrO42-、 Cr2O72-的颜色不同(b tn)，吸光性质也不相同。故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液。共三十七页四、实验步骤1、分光光度计的使用透明溶液(rngy)吸光度的测定步骤预热设定波长置入空白溶液调100%T，0%T置标尺为“吸

16、光度”样品置入光路读出数据共三十七页离心机使用方法1、打开电源开关，按要求装上所需的转头，将预先等重平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 2、按功能选择键，设置各项要求：温度、速度、时间 ，按启动键，离心机将执行上述参数进行(jnxng)运作，到预定时间自动关机。 3、待离心机完全停止转动后打开机盖，取出离心样品。共三十七页1 列出原始数据，包括标准曲线各浓度蛋白质的吸光度（A595nm），样品吸光度（A595nm）2 绘制标准曲线，算出相关系数和回归方程。3 列出计算过程，根据回归方程，计算出豆芽(du y)中蛋白质的含量。 豆芽蛋白质含量= x mg/g（每克豆芽中蛋白质的质量（mg数）实验(shyn)结果 共三十七页内容摘要实 验 一。关于实验报告: 要用自己的实验记录认真地写出一份实验报告，不得互相抄袭。蛋白质（protein）