图解RCR反应原理类型应用范例

1、PCR技术及其应用生物化学实验技术1目 录PCR的反应原理PCR的类型和应用PCR示例2 多聚酶链式反应（PCR：Polymerase Chain Reaction) Kary B. Mullis PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝尔化学奖。3体内DNA的复制体系DNA聚合酶（I II III）拓扑异构酶解旋酶类SSB 引物dNTP Mg2+5 34Mullis的PCR构思引物引物DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段5Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)酶活性(%)温度()40 50 60

2、 70 80 90 100100 80 60 40 20耐热DNA聚合酶Saiki（1988）将耐热DNA聚合酶引入PCR，使利用热变性解链DNA模板可行。6PCR反应循环729455PCR循环变性退火延伸7 PCR的指数扩增（2n）引物延伸延伸5533变性、退火变性、退火变性、退火延伸8TaqP1P2PCR反应体系dATPdTTPdGTPdCTPMg2+模板：DNA引物：P1 +P2DNA聚合酶：TaqE原料：dNTP反应缓冲液10 xBuffer辅助因子：Mg2+91）PCR反应成分（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 DNA模板

3、一般100ng /100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 PCR反应条件10（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。11（4）dNTP（10mM or 2.5mM ） 含四种核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。12（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激

4、活剂。浓度为0.5-2.5mmol/L。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。132）循环参数变性 使双链DNA解链为单链 94， 30-60秒(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。14引物设计：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源 序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。（5）两引物间

5、避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。15（3）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加16 PCR的应用 1、特定DNA片段（基因、调控序列）的鉴定、分离或制备。 A、DNA B、cDNA 2、基因表达分析（原位、离体） A、基因是否表达 B、基因表达水平高低 3、基因突变17基因克隆（）逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂交双链PCR扩增181. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入2. PCR扩增细胞内

6、目的片段3. 原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达原位分析基因表达的组织特异性19荧光定量 PCR（real-time PCR)分析基因表达水平 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。内掺式染料SYBR Green I序列特异性探针Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET)引物特异性探针 Amplifluor (Intergen)205353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-Gree

7、n I 21反向PCR (reverse PCR) 扩增已知序列两侧的未知序列 用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 未知序列未知序列已知序列22已知序列未知序列未知序列限制酶连接酶23 实时荧光定量PCR仪梯度PCR仪普通PCR仪24251、材料：含0.3Kb插入片段的克隆载体2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备3、试剂：10XPCR反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mol/L 引物1和引物2二、实验材料、仪器和试剂261.反应体系（50l体系）： 10 X PCR反应

8、缓冲液 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10mol/L 引物1 10mol/L引物2 模板DNA TaqE 补充水 三、操作步骤10 X B10 X P1 P210 X T10 X E 272.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀： 三、操作步骤10 X Buffer 2.5 L10 X P1 2.5 L10X T 2.5 L10 X E 2.5 L25 L水 12.5 L10 X P2 2.5 L283.PCR扩增程序： 94 5-10min（预变性） 94 30S 55 30S 72 30S 72 5-10min（后延伸） 4 保温30Cycles29

9、屏幕显示方式30MainRun Enter List Edit File Lid运行已有程序已有程序菜单删除已有程序新建反应程序编辑已有程序热盖关闭调节31EnterEnter abcdefghi# jklmnopqr# Name #stuvwxyz#In Use! .,-+/():=#Enter PCR1Control MethodBLOCK Sim-Tube输入文件名,满8个字符自动生成程序名,不满8个字符时用#终止BLOCK:屏幕显示样品台温度(样品台温控方式)Sim-Tube:屏幕显示反应液温度(模拟管温控方式)Enter PCR1Segment #1 Hold Cycle END选择

10、预变性保温32循环内第一步温度和时间Enter PCR1Hold at 94CHold for 5m0s预变性温度和时间Enter PCR1Segment #2Hold Cycle END 3 step PCR循环参数设置Step #194.0C Hold 0m30s循环内步骤数33Step #1Option？ No yes不需要拓展功能Step #255.0C Hold 0m40s循环内第二步温度和时间Step #2Option？ No yes不需要拓展功能Step #372.0C Hold 0m30s循环内第三步温度和时间34不需要拓展功能设置循环数后延伸保温后延伸温度和时间Step #3

11、Option？ No yesTotal Cycle= 35Segment #3Hold Cycle ENDHold at 72.0CHold for 10m0s35Segment #4Hold Cycle END选择反应完后保温Hold at 4.0CHold for 99m0s设置反应完后的保温温度和时间Segment #5Hold Cycle END终止参数设置Enter PCR1Estimated Run Time：1h53m05sSave？ YES no预计反应时间，程序是否保存36LidLIDTurn off heatedLid below 9C当温度低于9度时，热盖自动关闭37RunPCR1