5株第一类整合子阳性铜绿假单胞菌的耐药机制分析

1、5株第一类整合子阳性铜绿假单胞菌的耐药机制分析【摘要】目的理解5株别离于临床的第一类整合子阳性铜绿假单胞菌分子生物学特点。方法应用PR的方法确定5株铜绿假单胞菌含有第一类整合子并且对其整合耐药基因盒进展扩增和测序，通过PFGE分析该5株菌的同源性。结果5株铜绿假单胞菌均为第一类整合子阳性菌株并且都携带2360bp的耐药基因盒，包括aaA4和含有终止突变的lA1。PFGE结果显示5株铜绿假单胞菌来自同一克拢结论整合子在临床致病菌的多重耐药性中起着重要作用，本研究提示应加强细菌耐药性的监测以及防止相关病菌在院内的传播。【关键词】整合子；铜绿假单胞菌；PFGE本文对5株临床别离的第一类整合子阳性铜绿

2、假单胞菌的耐药基因盒进展检测，分析其耐药基因，并对其相关的同源性进展比拟。进一步讨论条件致病菌在院内的传播以及整合子在细菌耐药中的介导作用。1材料和方法1.1实验用菌株实验所用的5株铜绿假单胞菌均别离自2022年暨南大学附属第一医院患者样本。第一类整合子阳性对照菌株为V.hlerae1SK10，由丹麦皇家畜牧兽医和农业大学兽医微生物学研究室AnitaFrslund博士惠赠；第一类整合子阴性对照菌株为E.li600由日本大阪府立大学国际防疫学研究室山崎伸二教授惠赠。1.2细菌培养鉴定及药敏试验1.3DNA模板的制备和引物的设计菌株DNA提取参照文献3，用SDS溶液裂解细胞，用蛋白酶K水解蛋白质，

3、酚氯仿异戊醇(25241)抽提蛋白，冷冻无水乙醇沉淀DNA，最后用TE缓冲液(pH8.0)溶解。取1l作为DNA模板进展PR反响。引物分别用来扩增整合酶基因intI，耐药基因盒的引物见表1。1.4PR反响50l反响总体积的组成：10PR缓冲液5l，引物各3l，dNTP4l，DNA模板1l，无菌去离子水33.75l，0.25lTaqDNA聚合酶(5U/l，TaKaRa生物工程公司)。PR反响仪为ABI2700。intI1扩增循环条件：裂解温度945in，每个循环为940.5in，520.5in，721in，30个循环。最后72延伸7in。耐药基因盒扩增循环条件为：945in，940.5in，52

4、0.5in，722in，30个循环，最后72延伸7in。1.5PR产物的检测1.6耐药基因盒扩增产物的纯化、测序及序列分析1.7脉冲场凝胶电泳(PFGE)表1本实验用以扩增第一类整合酶和耐药基因盒的引物凝胶成像系统照相检测。2结果2.1菌株的药敏检验结果药敏实验结果说明5株铜绿假单胞菌均为多重耐药菌，且对头孢他啶、头孢哌酮、环丙沙星、头孢曲松、头孢噻肟、庆大霉素、哌拉西林、复方磺胺甲口恶唑和妥布霉素都显示出耐药性，结果见表2。2.2第一类整合子检测结果2.3耐药基因盒序列分析2.4PFGE结果PFGE结果显示5株铜绿假单胞菌P5、P6、P10、P14和P26的条带完全一致，PFGE结果一样，说

5、明5株PA来自同一克拢2.5GenBank注册号码所测序的2360bp片断在GenBank的注册号码为AB214531。:DL2000arker；1：P5；2：P6；3：P10；4：P14；5：P263讨论目前，整合子系统对于研究细菌的耐药性显得尤为重要6。来自临床的耐药菌株中，整合子的阳性率在50%以上2，7，8。同时，在畜牧业和环境等各方面别离出来的菌株也有整合子介导的耐药菌株存在。在院内感染别离出来的菌株中，由于患者抵抗才能差，致病菌在患者体内存活时间长，因此在多种抗生素的选择压力下容易形成多重耐药菌株。为此，研究院内感染细菌的耐药性非常重要，对于治疗和新型抗生素的研发有一定指导作用。另

6、外，5株铜绿假单胞菌的第一类整合子在携带aaA4耐药基因盒的同时，均携带含有终止突变的lA1耐药基因盒，因为该终止突变点在离基因起始位点的第267个核苷酸处，所以不能转录翻译出完好的蛋白质。从药敏实验的结果来看，5株阳性的铜绿假单胞菌均对氯霉素敏感，从表型上证实lA1基来由于终止突变的失效。lA1本身是一种编码对氯霉素的耐药的基因，它的产物与铜绿假单胞菌的排出泵有关。低浓度的氯霉素就可以诱导lA1的表达；A1蛋白主要位于内膜，它可以与某些细菌内源的泵出机制共同作用。在细菌的耐药机制中，泵出机制也是非常重要的一个方面。当与细菌排除泵相关的基因被整合子整合以后，更加有利于细菌耐药的传播。同时也说明细菌的耐药机制并非单独作用而是互相联络的。由于多重耐药的菌株在人体内的积累，这种细菌耐药性的传播为治疗带来较大困难，同时也为传染病的爆发及流行提供了可能性。从PFGE的结果可以明显看出，5株铜绿假单胞菌为同一个克隆株，由于该5株菌别离自暨南大学附属第一医院同一段时间内不同患者的样本，说明加强控制院内感染致病菌的重要性。因为导致院内感染的多为条件致病菌，而患者往往抵抗力低，所以应该注意合理布局病房，加强相关医疗器械和设备特别是呼吸机的消毒，加强医护人员的无菌操作等