SurvivinsiRNA在体外诱导Panc1细胞凋亡的实验研究

1、Survivin-siRNA在体外诱导Panc-1细胞凋亡的实行研究邱文洪郭凯文宋文剑沈体贴【摘要】探究RNA滋扰技能按捺Survivin对人胰癌细胞株Pan-1细胞凋亡的影响。要领：体外方案、合成针对survivin基因的小分子滋扰RNA(survivin-siRNA)，应用脂质体介导survivin-siRNA转染Pan-1细胞后，TT试验测定转染细胞的增殖按捺率，RT-PR检测细胞survivinRNA表达，琼脂糖凝胶电泳阐发其对Pan-1细胞凋亡诱导作用。效果：转染survivin-siRNA的Pan-1细胞增殖显着受按捺，与比较举行比力，具有明显性差异P0.01；经琼脂糖凝胶电泳，转

2、染survivin-siRNA的Pan-1细胞可见到DNA梯形条带，而比较细胞未见到。结论：survivin-siRNA可以或许明显诱导Pan-1细胞凋亡。【关键词】siRNAsurvivinPan-1凋亡保存素Survivin是凋亡按捺卵白(inhibitrfapptsisprtEin,IAP)家属新成员。它作为一种新的凋亡按捺因子，其构造漫衍和作用机制的奇特性已引起外洋学者的普及存眷1。深化研究RNA滋扰技能的作用将为人胰腺癌的基因治疗提供一种较有用的要领。1质料和要领1.1质料Pan-1细胞本室保存；脂质体LipfetaineT2000购自Invitrgen公司；TT(噻唑蓝)购自San

3、taruz公司；TaqDNA聚合酶，逆转录试剂盒购自BI公司；RPI1640造就基，TRIzlRNA分散试剂盒购自GIB公司；细胞凋亡-Hehst染色试剂盒购自BeytieBitehnlgy公司。1.2方案survivin特异性siRNA根据survivin基因在GenBank中的序列，应用美国Abin公司的方案软件方案相应的siRNA，同时在GenBank表达序列标签(EST)数据库中用BLAST检索，确认所方案siRNA序列的唯一性，人工合成针对740761nt位碱基靶序列的两条寡核苷酸链模板。1.3合成survivin特异性siRNA稀释上、卑劣模板，终浓度均为100l/L，别离与T7启

4、动子序列毗连，705in，室温5in，37延伸30in，体外转录，372h，siRNA的正、反义RNA结合，37留宿，去除前导序列和DNA模板，372h，用层析要领纯化siRNA。测定合成的siRNA260n的吸光度(A)值，定量后-70保存。1.4细胞转染接纳通例要领造就Pan-1细胞，取对数期生长的细胞用于实行。将处于对数生恒久的Pan-1细胞接种于6孔板，当细胞交融达70%，根据lipfetaine2000试剂盒说明书将survivin特异性siRNAsurvivin-siRNA转染Pan-1细胞。同时转染GAPDH特异性的siRNAGAPDH-siRNA作比较。1.5接纳TT法检测细胞

5、增殖按捺实行转染48h后，离心网络上述各组1106个细胞。24后应用TT法，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度()值，每个浓度设3个复孔，盘算肿瘤细胞按捺率=1-实行孔A值/比较孔A值100%。1.6转染细胞survivinRNA表达的检测转染48h后，离心网络上述各组1106个细胞。根据试剂盒说明提取总RNA逆转录成DNA，举行PR反响检测survivinRNA的表达。引物序列为，上游引物：5-ATGGGTGGAGTT-3，卑劣引物：5-TAATATGGAGAGT-3，并以-atin为内参照，扩增片断长度313bp。反响条件：94预变性5in，94变性1in、50退火45s、72延伸1in，共

6、30个循环，末了延伸10in。产物经20/琼脂糖凝胶电泳，不雅察效果并照相。1.7接纳DNA凝胶电泳检测细胞凋亡转染48h后，离心网络上述各组1106个细胞。洗涤并重悬，参加细胞裂解液1%NP40，20l/LEDTApH8.0，50l/LTris-lpH7.5，离心取上清参加10%SDS、卵白酶K，50孵育2h，再参加RNaseA室温安排1h。酚、氯仿抽提，取10lDNA，70放5in后，15/琼脂糖凝胶，4V/电泳3h，不雅察效果并照相保存。1.8统计学要领以上实行重复3次，部门数据以均匀数尺度差(s)表现，接纳SAS软件举行统计阐发。2效果2.1Survivin-siRNA对Pan-1细胞

7、增殖的按捺脂质体介导的Survivin-siRNA转染Pan-1细胞后，TT法检测Survivin-siRNA对Pan-1细胞增殖的影响。表1效果表现：Survivin-siRNA对Pan-1细胞的增殖按捺显着，GAPDH-siRNA比较组和未转染空缺比较组不克不及对细胞产生显着的按捺作用。表1Survivin反义寡核苷酸对Pan-1细胞增殖的影响略注：与各比较组比力，P0.01。2.2Survivin-siRNA对Pan-1细胞survivinRNA表达的影响2.3Survivin-siRNA诱导Pan-1细胞DNA片断的变革转染48h后，DNA琼脂糖凝胶电泳效果如图2表现：脂质体介导的Su

8、rvivin-siRNA转染的Pan-1细胞，15/琼脂糖凝胶电泳即可看到DNA梯形条带，而脂质体介导的GAPDH-siRNA转染的Pan-1细胞和空缺比较组一样，DNA电泳均表现分子量很大的一条带，未见到DNA梯形条带。这反响了Survivin特异性siRNA作用Pan-1细胞时导致了差异于坏死的DNA落解。3讨论人胰腺癌是一种多基因操纵疾病，其产生生长和多种癌基因的激活与抑癌基因的失活及细胞增殖和凋亡(apptsis)调治失控严密相干2。比年研究创造凋亡卵白按捺因子(InhibitrsfapptsisprtEin,IAPs)家属在凋亡的基因调控中发挥紧张作用3。定位于人染色体17q25的s

9、urvivin基因是IAPs家属在哺乳类动物中的同系物。与其他IAPs因子差异，survivin仅表达于胚胎发育构造，在分化的正常构造中沉默沉静，但特异性地表达于包罗生齿腔上皮癌在内的人类绝大多数肿瘤构造。据此，我们以为survivin大概是生齿腔上皮癌选择性治疗的抱负靶标。由于RNA干预干与RNAi技能是新近生长起来的一种关闭基因表达的有用要领。它能在特定位点，特定隔断落解与siRNA序列相应的RNA，从而高效阻断基因的表达，可以实现细胞程度的基因敲除4。因此假想通过人工合成survivin特异性siRNA按捺survivin基因的表达，诱导Pan-1细胞凋亡，盼望为临床生齿腔上皮癌的治疗开发一条新途径。本实行中，我们应用脂质体介导的survivin特异性siRNA转染Pan-1细胞，可显着低落Pan-1细胞survivinRNA的表达，对胰癌Pan-1细