HBV基因定量分析技术的应用价值、存在问题及展望HBV基因定量分

1、HBV基因定量阐发技能的应用代价、存在题目及预测-HBV基因定量分缪晓辉孔宪涛比年来HBV基因定量阐发的代价受到越来越多研究者的器重1。已往由于太过夸大了HBV熏染后过强的细胞免疫应答介导肝细胞损伤，无视了对病毒复制程度与致病性之间因果干系的研究。如今普及以为，只管HBV不直接粉碎寄生细胞，但病毒的活泼复制是启动或引发肝脏构造炎症反响的因素。这表白确定熏染者体内HBV复制状态，即从HBV基因定量的角度作病情阐发是非常成心义的。终究上，真正引起人们存眷HBV基因定量阐发代价的紧张缘故原由是比来创造了滋扰素治疗与HBV基因程度两者之间有非常严密的干系。HBV基因定量阐发还在转基因动物、基因治疗、卵

2、白疫苗和核酸疫苗、抗HBV药物体外试验和动物试验及耐药研究、盛行病学研究、HBV血液成品污染监测等方面具有紧张的应用代价。一、HBV基因定量阐发在滋扰素治疗中的应用尚无药物可以扫除全部HBV熏染者体内HBV颗粒。滋扰素是如今唯一有一定疗效的一类生物制剂2,它在病毒等诱导下由几种相干细胞产生，并发挥抗病毒作用。但是无论利用何种滋扰素，也无论治疗剂量或疗程怎样，滋扰素治疗后HBV转阴率迄今仍保持在40%摆布，无法进一步进步，毕竟有哪些制约因素起作用尚无定论。比年来创造滋扰素的治疗结果，即滋扰素治疗后的反响性(respnse)很大程度上取决于HBV在体内的复制程度2,3。以下几点终究值得留意:治疗前

3、HBV低程度复制者的反响性显着优于高程度复制者。HBV转阴的险些都是那些治疗前血清HBVDNA含量较低者，而治疗前HBVDNA含量特别高者大多没有疗效；治疗中病毒复制程度敏捷低落者，有望治愈。相反，治疗期间HBV基因程度落落较慢，或落落幅度较小，或变革不显着者，大多是无效者；治疗竣事后，接纳PR定量法检测，HBVDNA完全转阴者大概不再复发，而停顿治疗后HBVDNA仍保持较低程度者，反跳的大概性较大。可见，利用滋扰素治疗HBV熏染时，在种种近期和远期疗效指标中，除了病人的临床表示是否好转，生化指标(ALT)是否改进，肝构造炎症反响是否减轻等以外，血清HBVDNA定量阐发是一个非常紧张的不雅察工

4、程。从现有研究资料看，除病理查抄外，HBVDNA定量检测，大概是滋扰素治疗结果断定根据中最直接、最可靠和最有代价的指标。多数研究者以为，通过HBVDNA定量阐发来引导滋扰素治疗，有庞大意义。起首，在治疗工具的选择方面，即确定滋扰素治疗顺应症时，应对各侯选病例在某个时间段内按期重复检?釮BVDNA程度，那些恒久保持HBV高复制程度者不宜担当滋扰并素治疗，或应当团结治疗；其次，滋扰素治疗期间，可按照HBV基因程度的动态变革适时调解治疗剂量，决定是否收缩或延伸疗程，及是否停顿治疗。这不但对制定公正的治疗方案，也对减轻病人包袱，制止不适当用药有引导意义4。笔者以为，如今国际上普及接纳的所谓“六个月疗程

5、及某些中高剂量治疗方案均缺乏充实和充足的立论根据，有需要团结基因定量阐发结果，重新评价和制定滋扰素治疗筹划；末了，滋扰素治疗竣事后，对有反响者按期作定量阐发，有助于创造复发者，并按照血清HBVDNA含量颠簸环境决定是否实行再治疗。有人陈诉，初次滋扰素治疗有用者，再治疗的结果亦佳。假设第一次治疗无反响或反响较差者，第二次滋扰素治疗仍不克不及获得抱负疗效5。二、HBV基因定量阐发的其他临床代价HBV熏染后，在临床表示方面的差异非常显着,可以表示为无病症携带者、急性肝炎、慢性肝炎、爆发型肝炎、肝硬化及肝癌等多种疾病状态。病毒在肝细胞内的复制程度与种种临床疾病状态之间大概存在着某些一定接洽。由于HBV

6、基因定量技能的生长和成熟，如今已有大概从某些征象上阐发HBV复制与致病性之间的“量效干系。“无病症携带者大概为运动性乙肝患者6。有部门HBV熏染者，由于免疫耐受或别的缘故原由，体内HBV呈复制不活泼的“暗藏状态，但并不料味着不存在举行性肝损害。els等研究创造无病症携带者在其天然生长史上，HBV复制处于颠簸状态，时有加剧，病毒复制积聚到一定程度后ALT程度增长。一样平常纪律是:血清HBVDNA程度上升ALT活性增长Ig抗HB滴度进步。因此无病症携带者应接纳积极治疗方法，不然这类人群不但作为紧张的病毒库流传HBV，并且由于隐匿性肝细胞损伤的不竭积聚，不颠末慢性肝炎阶段，直接向肝硬化和肝癌生长。H

7、BVDNA程度与HBV熏染者病情和预后的干系严密。上述无病症携带者是一个特别群体。而对那些急性和慢性乙型肝炎患者而言，HBVDNA程度对预后断定有帮助。研究创造HBVDNA不停保持较高程度的急性肝炎患者易慢性化，而HBV复制程度较高的慢性肝炎患者不但对滋扰素治疗的反响性差，并且肝构造炎症反响更显着，病情更重，更易产生肝硬化和肝癌。如今在可否用血清HBVDNA程度来断定肝构造炎症损伤程度这类题目上尚有争议。动物实行表白，鸭肝被DHBV普及熏染的同时，并不陪同显着病毒血症,肝细胞扫除病毒的同时也无病毒血症加重的证据7。然而比来有人对HV熏染者举行基因定量阐发研究，创造HVRNA程度与ALT程度以及

8、肝脏kndell分级之间有严密干系8。肝移植者HBVDNA定量的意义azzaferr等陈诉肝移植前患者血清HBVDNA程度的凹凸决定移植后肝脏是否再熏染HBV9。作者不雅察到，14例移植前血清HBVDNA含量低于103拷贝/l，移植后不中断地接纳HBsAb免疫防范，随访36个月，无一例再发肝炎，但别的两例移植前病毒拷贝数大于105/l那么产生了严峻HBV再熏染。发起移植前利用抗HBV药物，最大限度低落血清HBVDNA浓度，有助于防范HBV侵占移植后肝脏，进步肝脏移植的结果。前核基因突变HBV定量意义HBV前核基因突变可导致HBeAg表达缺失。熏染不表达HBeAg的HBV突变株，或野生型HBV在

9、体内突变并成为上风株均产生较严峻的结果，如易产生爆发性肝炎，预后差，滋扰素治疗无效等9,10。如今已能接纳核酸序列测定技能、PR技能、限定性片断长度多态性(RFLP)阐发技能等来定性检测HBV前核基因突变。比来Baxall创立了一种PR及产物的显色反响点突变阐发技能(lurietripintutatinassay)，用来定量阐发突变前核基因，有助于进一步探究HBV突变与致病性之间的干系11。基因定量阐发是一项临床应用型技能，但对底子研究也有一定的应用代价12，尤其是在当前基因治疗、转基因动物、核酸疫苗等热门研究范畴，基因定量阐发大概是一种很好的帮助本领，对创造一些成心义的征象大概有一定帮助。好

10、比HBV在转基因小鼠构造脏器漫衍纪律可用定量尺度来权衡，以及用定量本领不雅察种种药物、细胞因子和别的物质对转基因小鼠HBV基因复制的调治作用。又如对核酸疫苗注入肌构造后的种种动力学变革的研究远未深化，如能接纳定量本领，阐发抗原表达基因在体内的存在状态无疑是有益的。至于种种抗HBV药物，无论是在体外细胞模子(包罗转基因细胞模子)照旧在动物模子的研究，或在人体研究，接纳基因定量阐发，应当是稽核药物疗效的最正确本领13。HBV因定量阐发存在的题目及将来预测HBV基因定量技能的生长汗青不长，但由于有定性技能为底子，以及与别的学科要领的融汇，生长速率很快，如今趋于成熟。但应用定量技能去研究HBV熏染的临

11、床题目还不充实，同时定量技能自己也有很多题目值得探究。一、国际尺度化。这是一个最为突出而又必需尽快办理的题目。欧洲有一个“病毒性肝炎研究组EurpeanStudyGrupinViralHepatitis)，常常向欧洲的某些研究机构提供HBV血浆尺度品作定量阐发参考14。有需要在国际上设立同一的HBV基因尺度品，包罗种种HBV亚型的尺度参照。笔者以为，克隆的HBVDNA质粒不相宜作尺度品。克隆HBVDNA与载体组成了闭环超螺旋布局，并且，一级布局单一，这与体内存在的HBV基因布局差异很大。后者呈部门双链，在血清中尚有裂解片断及复制中心体等情势。因此，无论是在分子杂交，照旧在PR历程中，质粒HBV

12、DNA布局与人体内熏染的HBVDNA布局在杂交服从或扩增服从上一定有渺小不同，结果将影响定量阐发的正确性。如从高程度HBV阳性病人血清大量抽提，或从转基动物血液中纯化得到HBVDNA，大概是一个制备尺度品的途径。总之，国际化的尺度参照，是包管HBVDNA定量技能正确性和可靠性的条件。二、分子杂交定量技能和PR定量技能应当共存下去吗?以下两点值得思量:起首，有需要弄清体内HBV复制程度极低者(如低于1fg/l)占HBV熏染人数的比例有多大？这类低程度复制者预后怎样?假设这类人群属于急性熏染规复期，或有天然扫除病毒倾向者，那么似无需要作通例PR定量阐发，按期举行PR定性检测即可。其次，有需要创立一

13、种敏感度介于分子杂交和PR定量技能之间的检测体系。比来有人利用电化学技能不雅察到DNA双链互补杂交，乃至单个碱基对结适时产生了微电反响，这给我们以很大启发，以后如有大概在这方面翻开打破口，那么基因定量阐发两大技能共存的场面会产生变化。但是，在如今这两大技能仍有很强的互补性。三、HBV突变株定量阐发意义的研究。HBV基因突变15，尤其是前核基因突变，直接影响HBV熏抱病情转归及抗毒治疗结果，同时也反响了来自体内或外界选择压力的作用。因此，突变株在体内产生简直切缘故原由，突变株与野生株混淆存在的生长趋向，突变株是否为耐药株，突变株与野生株相对含量的变革与致病性的干系，突变株与免疫耐受的干系等均是有

14、需要进一步澄清的题目。四、基因定量技能在HBV熏染盛行病学方面的应用16。HBV经血液流传致病已十明白确，但是体液流传的题目还必需有富足的证据来增补。体液及别的分泌液或分泌物流传HBV是一样平常生存严密接后熏染HBV的直接缘故原由，但此中一定存在“含量与熏染性的干系，那么这个致病的量值完全可以通过HBV熏染盛行病学研究得到确证。别的，被污染血成品中HBV基因含量与利用血成品后熏染HBV的伤害性之间的干系也值得研究。五、增强HBV低程度复制者预后研究。如今看来，所谓康健携带者或无病症带病毒者、滋扰素治疗部门反响者(partialrespnders),以及其他种种HBV在体内呈低复制状态者，在病情

15、、机体免疫状态、预后等方面大概都有一些特别性，这类病人是否有天然扫除病毒的倾向，是否应当实行抗病毒治疗，是否成为紧张的熏染源等题目都应该作出切合现实的答复。六、HBV复制程度与抗病毒药物疗效之间的干系研究有待深化。笔者以为，HBVDNA程度与滋扰素治疗结果之间的所谓接洽在理论上缺乏按照，大概是一种外貌征象，有需要探究其本质。病毒复制程度凹凸取决于病毒自身的生物活性和机体的免疫成效，应当从病毒和机体两方面探求打破口，进步滋扰素抗HBV的结果。末了，在中国，有天下上为数最众的HBV熏染及相干慢性肝病患者，但我们在HBV熏染诊治研究方面仍处于落伍状态。就HBV定量技能而言，如今尚未创立分子杂交定量阐发技能，现已陈诉的PR定量阐发法也属于低程度重复，以后有需要器重这方面的投资和开拓。在临床研究范畴应当有自己的安身点，不该简朴重复外洋研究结果。就HBVDNA定量阐发意义的研究而言，简朴重复的征象已不