《生物化学》本科课件第10章+酶的作用机制和酶的调节

1、第10章 酶的作用机制和酶的调节Metabolic regulation is achieved through an exquisitely balanced interplay among enzymes and small molecules, a process symbolized by the delicate balance of forces in this mobile. (Sea Scape by Alexander Colder/Whitney Museum of American Art. NY)扬州大学生物科学与技术学院 或者称活性中心（active center)与

2、酶活力直接相关的区域局限在酶分子的特定部位一、酶的活性部位 ( active site ）扬州大学生物科学与技术学院 结合中心：与S结合 决定酶促反应的专一性 催化中心：促进S发生化学变化 决定酶促反应的性质 活性中心扬州大学生物科学与技术学院必需基团：与酶的催化活性直接相关的化学基团常见：His咪唑基、Ser-OH、 Glu-COOH、Cys-SH、Asp-COOH位于活性中心活性中心以外，稳定分子构象必需基团非必需基团（一）酶活性部位的特点扬州大学生物科学与技术学院底 物 活性中心以外的必需基团结合基团催化基团 活性中心 扬州大学生物科学与技术学院（一） 酶活性部位的特点1、活性部位只占相

3、当小的部分几个残基+辅助因子（单纯/结合）2、在空间构象上集中到一起形成一个三维实体（单体/寡聚）3、与底物诱导契合4、位于酶表面裂缝 (crevice)内6、活性中心构象具有柔性或可运动性5、通过次级键与底物结合扬州大学生物科学与技术学院 酶 AA残基 活性中心AA 核糖核酸酶 124 H H K R D E溶菌酶 129 D E胰凝乳蛋白酶 241 H D S羧肽酶A 307 R E Y Zn2+胰蛋白酶 223 H D S扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院（二）、研究酶活性部位的方法1.酶分子侧链基团的化学修饰法 化合

4、物活性部位AA残基侧链基团 共价结合水解酶，确定一级结构位置扬州大学生物科学与技术学院 推测某基团是否在活性中心 某基团被修饰后： 判断修饰剂与活性部位结合的依据： S/竞争性I可以保护修饰剂的作用 酶活力影响程度与修饰剂浓度相关酶活力改变：为必需基团（1）非特异性共价修饰利用某些化学试剂与酶蛋白中某类氨基酸残基的侧链反应而使基团的结构和性质发生改变扬州大学生物科学与技术学院（2）特异性共价修饰试剂专一修饰活性部位某一AA，使酶失活。 如：二异丙基氟磷酸（DFP)专一修饰酶（主要为蛋白水解酶及酯酶）活性部位的 Ser-OH，从而使酶失活。仅修饰活性中心Ser-OH扬州大学生物科学与技术学院利用

5、DFP共价修饰法对某些蛋白水解酶进行研究，发现许多酶活性部位都含有丝氨酸，还具有相似的肽段：Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro顺序。扬州大学生物科学与技术学院(3)亲和标记法与S结构相似的共价修饰剂能被专一地引入活性部位，接近S结合位点其活泼的化学基团可与活性部位某一基团 形成稳定的共价键专一性不可逆抑制剂/活性部位指示试剂扬州大学生物科学与技术学院对甲苯磺酰L苯丙氨酸乙酯 (TPE)对甲苯磺酰L苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）胰凝乳蛋白酶扬州大学生物科学与技术学院2.动力学参数测定法 活性部位AA残基解离状态和酶活性直接相关 通过动力学方法求有关参数， 对酶活性部位化学性质作出判断。

6、3.X射线晶体结构分析法 解析与S结合的酶分子的三维结构 了解酶活性部位AA残基所处的相对位置 以及与活性部位有关的其它基团扬州大学生物科学与技术学院4.定点诱变法 利用定点诱变技术，改变编码蛋白基因中的DNA顺序，改变其中某AA后，测定酶活性的变化。扬州大学生物科学与技术学院酶催化反应的某些独特性质为许多反应所共有，可概括如下：二、酶催化反应的独特性质酶反应可分成两类，一类仅涉及电子转移（速率：108 s-1数量级）；另一类涉及电子和质子两者或者其他基团的转移（速率：103 s-1数量级）大部分反应属于第二类。酶的催化作用是由氨基酸侧链上的功能基团和辅酶为媒介的。酶催化反应的最适pH范围通常

7、是狭小的与底物相比较，酶分子很大，而活性部位通常只比底物稍大一些。酶除活性基团外，还有别的特性使反应进行更有利，并使更复杂的多底物反应按一定途径进行。扬州大学生物科学与技术学院主要有利条件： 在活性部位存在1个以上的催化基团，所以能进行协同催化 存在有结合部位，底物分子可以按固有方位结合在活性部位附近 在2个或2个以上底物反应时，存在1个以上的底物分子结合部位 底物结合到酶分子后，底物分子中的键产生张力，有利于过渡态复合物的形成。扬州大学生物科学与技术学院（一）底物和酶的邻近效应和定向效应 三、影响酶催化效率的有关因素邻近效应：酶与底物形成复合物后，底物与底物、催化基团与底物之间结合于同一分子

8、（酶）而使有效浓度极大增加，从而使反应速率大增的效应。催化中邻近效应的一个例子：（a）游离的咪唑催化乙酸对硝基苯酯的速度较慢；（b）变成分子内反应后要快24倍有机化学模式实验扬州大学生物科学与技术学院定向效应：反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。邻近效应和定向效应对酶促反应的影响：提高有效浓度、正确取位；变分子间反应为分子内反应。Page等认为两类效应在双分子反应中起的促进作用至少分别达到104倍。酶催化效率提高的实质：底物分子结合在酶的活性部位，作用基团互相邻近并定向，大大提高了酶的催化效率。定向效应的一个例子：邻羟苯丙酸的内酯形成，当两个甲基取代了苯

9、环邻近的碳原子上的氢，使羧基与羟基之间更好定向时，两个速率常数之比为2.5 1011 。扬州大学生物科学与技术学院（二）底物的形变和诱导契合酶与专一性底物结合后，酶的基团或离子使底物的某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，使底物分子发生形变而接近过渡态，反应容易发生。诱导契合：当底物和酶接触时，可诱导酶分子的构象变化，使酶活性中心的各种基团处于和底物互补契合的正确空间位置，有利于催化。扬州大学生物科学与技术学院契合后，诱导“电子云形变”:EA : B:A- : B+:电子云形变:E这样的共价键易被酶活性中心酸碱催化或共价催化扬州大学生物科学与技术学院酶活性中心瞬时地向反应物提供H+

10、/H+受体以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。（三）酸碱催化（acid-base catalysis)在水溶液中通过高反应性的质子和氢氧离子进行的催化称为专一的酸碱催化或狭义的酸碱催化通过H+和OH-以及能提供H+及OH-的供体进行的催化称为总酸碱催化或广义的酸碱催化专一酸碱催化作用总酸碱催化作用专一的酸碱催化的表观速率常数（kobs)仅依赖pH而不受缓冲液的浓度影响；总酸碱催化的kobs除依赖pH外，还与缓冲液浓度成正比扬州大学生物科学与技术学院酸催化(OH、NH3+、NH+、-COOH、SH)A- : H+EHE-H2OEH + OH-+ H+AH + B+碱催化(-COO-、-S-、咪

11、唑基等失电子态基团)A- : B+ E-COO-A- + E-COOH E-COO- + H+在生理条件下，因H+和OH-的浓度甚低，总酸碱催化作用较为重要。很多酶的活性部位的某些功能基，能在近中性的条件下，作为催化性的质子供体或受体参与总酸碱催化作用。总酸或总碱的催化可提高反应速率102到105倍。扬州大学生物科学与技术学院酶分子中作为总酸碱催化的功能基团影响酸碱催化反应速率的因素有两个：酸或碱的强度（pK值）及质子传递的速率。例如咪唑基pK约为6，在中性条件下，即可作为质子供体，又可作为质子受体。同时其接受或供出质子的速率十分迅速，因此是一个重要的酸碱催化基团。扬州大学生物科学与技术学院

12、催化剂的亲核/亲电基团分别放出电子或汲取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，形成共价中间复合物，降低活化能，使反应加速的机制。亲电基团带正电荷性质的基团亲核基团带负电荷性质的基团（四）共价催化（covalent catalysis)分为亲核催化或亲电子催化扬州大学生物科学与技术学院-OH-SH酶蛋白氨基酸侧链提供各种亲核中心，以下3种最常见：丝氨酸羟基、半胱氨酸巯基、组氨酸咪唑基磷酰酶酰化酶葡糖酶酶和底物间共价键形成的例子。中间产物不稳定，断裂，形成产物，酶复原。（不同酶促反应中的催化因素影响大小不同。）扬州大学生物科学与技术学院Enzymes That Form Covalent Int

13、ermediatesEnzymesReacting GroupCovalent Intermediate1. Chymotrypsin ElastaseEsterasesSubtilisinThrombinTrypsin 2. Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase Papain 3. Alkaline phosphatase Phosphoglucomutase 4. Phosphoglycerate mutase Succinyl-CoA synthetase 5. Aldolase Decarboxylases Pyridoxal phosphat

14、e- dependent enzymes 扬州大学生物科学与技术学院1、需要金属离子的酶（几乎1/3的酶催化活性需要金属离子）（1） 金属酶 (metalloenzyme)含紧密结合的金属离子（多为过渡金属离子如：Fe2+，Fe3+,Cu2+,Zn2+,Mn2+,Co3+）（2）金属-激活酶 ( metal-activited enzyme)含松散结合的金属离子（多为碱和碱土金属离子如：Na+、K+、Mg2+、Ca2+。（五）金属离子催化扬州大学生物科学与技术学院2、金属离子以3种主要途径参加催化过程 A、参与底物反应的定向 B、通过价态改变参与电子转移 C、通过静电稳定/屏蔽负电荷金属离子的

15、催化作用往往和酸的催化作用相似，有些带多价正电荷的金属离子甚至比质子的作用更强金属离子具有络合作用在中性溶液中能维持一定浓度扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院（六）多元催化和协同效应酶的活性中心部位，一般都含有多个起催化作用的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作用，从而使底物达到最佳反应状态。扬州大学生物科学与技术学院（七）活性部位微环境的影响 活性部位位于酶分子表面疏水环境的裂缝中：非极性环境中的介电常数较在水介质中低，根据库仑定律，在非极性环境中两个带电基团之间的静电作用比在极性环境中显著增高。疏水环境有利于酶

16、的催化作用。扬州大学生物科学与技术学院四、酶催化反应机制的实例（一）溶菌酶（lysozyme）Alexander Fleming存在鸡蛋清和眼泪中由129个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，含4对二硫键。扬州大学生物科学与技术学院溶菌酶生物学功能是催化水解细菌细胞壁多糖扬州大学生物科学与技术学院溶菌酶催化底物C1-O键裂解扬州大学生物科学与技术学院溶菌酶的结构和水解特性溶菌酶分子近椭圆形，内部几乎全部是非极性，分子表面有一个较深裂缝，其大小恰好能容纳多糖底物的6个单糖。溶菌酶催化水解NAM的C1与NAG的C4之间的糖苷键，也催化仅由NAG残基通过b(1-4)糖苷键连接的几丁质。(NAG)3是溶菌酶

17、的竞争性抑制剂，其最小底物为(NAG)6。水解部位只能发生在D-E之间。ABCDEF溶菌酶的活性部位的必需基团是Asp52和Glu35，扬州大学生物科学与技术学院第一步是质子转移,糖苷键被裂解,形成一个碳正离子中间物溶菌酶的催化机制：扬州大学生物科学与技术学院第二步是OH-和H+分别加合到正碳离子中间物和Glu35的侧链后,水解反应完成扬州大学生物科学与技术学院形成碳正离子时葡萄糖环的形变扬州大学生物科学与技术学院羧肽酶 A（二）扬州大学生物科学与技术学院碱催化酸催化扬州大学生物科学与技术学院稳定活性中心吸附羧氧原子使肽键失稳扬州大学生物科学与技术学院胰蛋白酶蛋白质水解酶巯基蛋白酶天冬氨酸蛋白

18、酶丝氨酸蛋白酶锌蛋白酶胰凝乳蛋质酶凝血酶弹性蛋白酶（三）丝氨酸蛋白酶扬州大学生物科学与技术学院以胰凝乳蛋白酶为模型疏水口袋活性位点残基扬州大学生物科学与技术学院4.丝氨酸蛋白酶的催化机制催化三联体亲核攻击稳定His的正电形式扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院乙酸硝基苯酯硝基苯酚：400nm处有强吸收 乙酰酶复合物酰化作用脱酰化作用用人工底物研究胰凝乳蛋白酶催化反应机制扬州大学生物科学与技术学院趋同进化（convergent evolution）：催

19、化三联体趋异进化（ divergent evolution）：底物专一性扬州大学生物科学与技术学院OH的亲核催化(胰凝乳蛋白酶)扬州大学生物科学与技术学院（四）天冬氨酸蛋白酶（asparitic proteases）天冬氨酸蛋白酶产生于哺乳动物、霉菌和高等植物。酶在酸性pH（或有时中性）呈现活性，活性部位有两个Asp。酶的活性部位是一个深宽的裂缝，是由2个并列的结构域形成的，能容纳7个氨基酸残基天冬氨酸蛋白酶胃蛋白酶凝乳酶组织蛋白酶肾素HIV-1蛋白酶扬州大学生物科学与技术学院碱催化天冬氨酸蛋白酶的作用机制：蛋白酶活性的pH依赖性支持广义酸碱的催化模式活性部位存在两个高度对称的天冬氨酸残基，称

20、为“催化二联体”扬州大学生物科学与技术学院HIV-I蛋白酶是一种天冬氨酸蛋白酶扬州大学生物科学与技术学院五、酶活性的调节控制扬州大学生物科学与技术学院（一）别构调控（allosteric regulation） 定义 别构调节：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进而改变酶活性状态。 别构酶：具有别构现象的酶。 别构剂：能使酶分子发生别构作用的物 质。通常为小分子代谢物或辅因子扬州大学生物科学与技术学院别别别别别别别扬州大学生物科学与技术学院效应物（调节物、别构剂）底物其他对酶活性影响促进同促反应正协同效应异促反应正协同效应抑制同促反应负协同效应异促反应负协同效应扬

21、州大学生物科学与技术学院ATP 别构激活剂CTP 别构抑制剂1. 天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase)扬州大学生物科学与技术学院调节亚基催化亚基扬州大学生物科学与技术学院ATCase由催化亚基和调节亚基构成： 大亚基为催化亚基，有催化活性， 不与ATP和CTP结合；小亚基为调节亚基，无催化活性， 能与ATP和CTP结合;扬州大学生物科学与技术学院 2. 3磷酸甘油醛脱氢酶是糖分解途径中的重要酶。与供能有关。 具有负协同效应的别构酶代表 该酶含4个亚基，可和4个NAD+结合，但结合常数不相同，酶结合NAD+后，发生构象变化。扬州大学生物科学与技术学院 即使NAD+浓度很低，酶也能结合，但是结合两个

22、NAD+后，再要结合第三/四个NAD+就很难，需要提高浓度至少两个数量级。实验结果表明，酶只能结合两分子NAD+，酶结合NAD+的位点，只有一半起反应称为半位反应性 这是一种极端负协同效应。说明在一定底物浓度范围内，底物浓度的变化不足以影响酶反应速率。这是负协同别构酶的特点。扬州大学生物科学与技术学院别构激活剂别构抑制剂3、 别构酶的性质（1）多亚基一部分亚基有活性中心，另一部分有别构调节中心扬州大学生物科学与技术学院S形曲线（正协同）表观双曲线（负协同效应） （2）别构酶的动力学扬州大学生物科学与技术学院 协同指数CI（cooperativity index）又称为饱和比值Rs（satura

23、tion ratio）可用于鉴别不同的协同作用以及协同作用的程度。n 代表协同系数（Hill系数）典型的米氏酶Rs81具正协同效应别构酶Rs81，愈大效应愈显著。n =1n 1n 1扬州大学生物科学与技术学院（3）K型效应物和V型效应物：K0.5：别构酶催化反应达到1/2 Vmax时的S改变K0.5不改变Vmax：K型效应物改变Vmax，不改变K0.5 ：V型效应物扬州大学生物科学与技术学院A为K型效应物B为V型效应物+.加激活剂；-.加抑制剂扬州大学生物科学与技术学院别构酶经加热或用化学试剂等处理，可引起别构酶解离，失去调节活性。 脱敏后表现为米氏酶动力学双曲线（4）脱敏作用扬州大学生物科学

24、与技术学院4、别构模型 1、对称或协同模型（symmetry or concerted model,也称齐变模型、MWC模型） 1965年由Monod、Wyman和Changeux提出。 该模型的要点 : 扬州大学生物科学与技术学院2、序变模型（sequential model，也称KNF模型） 1966年由Koshland、Nemethy和Filmer提出。 该模型的要点 :扬州大学生物科学与技术学院（二）酶原的激活酶原(zymogen)：酶的无活性的前体酶原的激活：由无活性的酶原转变为有活性的酶的过程。酶原激活的意义：在特定的环境和条件下发挥作用；避免细胞自身消化；有的酶原可以视为酶的储存

25、形式。扬州大学生物科学与技术学院酶原激活的机理:酶 原分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽在特定条件下扬州大学生物科学与技术学院胰蛋白酶的激活缬天天天天赖异缬甘组SS丝SS肠激酶（激活作用）缬天天天天赖异甘组SS丝缬SS活性中心胰蛋白酶原胰蛋白酶为什么不直接以酶形式存在呢？保护正常组织不受伤害。活性部位扬州大学生物科学与技术学院胰蛋白酶原胰蛋白酶六肽+弹性蛋白酶原弹性蛋白酶 + 碎片胰凝乳蛋白酶原-胰凝乳蛋白酶 +两个二肽羧基肽酶原A羧基肽酶A + 碎片肠激酶自身催化肠激酶启动的酶原激活出血性胰腺炎发病机制？扬州大学生物科学与技术学院扬州大学

26、生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院凝血机制：1、受伤血管收缩减少血流；2、血小板粘聚成栓堵住伤口；3、凝血相关因子的级联激活作用扬州大学生物科学与技术学院共价调节酶通过其它酶对其多肽链上的某些基团进行可逆的共价修饰。可逆的共价修饰，使酶处于活性/非活性的互变状态，从而调节酶的活性。（三）可逆的共价修饰可逆的共价修饰形式有56种，其中最重要的一种是磷酸化修饰。扬州大学生物科学与技术学院酶 酶-P 蛋白激酶，磷酸化磷酸酶，脱磷酸化酶的活性形式：可能是磷酸化也可能是脱磷酸化由核苷三磷酸（ATP）提供磷酸基，都需Mg2+。1. 蛋白质的磷酸化蛋白质的磷酸化与脱磷酸化是生物体普遍的调节方式，几

27、乎涉及所有的生理及病理过程，在细胞信号转导过程极其重要，真核细胞1/2到1/3的蛋白质可以磷酸化。扬州大学生物科学与技术学院底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基有两类：（1）“P-O”键连接，如Thr, Ser, Tyr, Asp, Glu（2）“P-N”键连接，如Lys, Arg, His主要是磷酸化Ser、Thr，个别为Tyr。被磷酸化的残基可以是一个、两个或多个。多数蛋白激酶表现一定的底物特异性，但是很少绝对特异性。底物蛋白质被磷酸化的氨基酸残基附近的氨基酸组成和顺序有其共有的特性。见下表扬州大学生物科学与技术学院X代表任何的氨基酸；B代表任何疏水氨基酸；Sp, Tp, 和Yp表示已经磷酸化的

28、Ser, Thr和Tyr残基。扬州大学生物科学与技术学院主要是SerThr扬州大学生物科学与技术学院信使依赖性非信使依赖性cAMP依赖性（PKA）cGMP依赖性（PKG)Ca2+ /磷脂依赖性 （PKC)胞内信使激素/生长因子依赖性 蛋白激酶2. 蛋白激酶一个非常大的家族，已发现至少200种，结构上有很大的相似性，进化上相关。根据底物磷酸化类型分为：Ser/Thr型和 Tyr型。根据调节物分为：扬州大学生物科学与技术学院3. 几种重要的蛋白激酶（1）蛋白激酶A（PKA）或cAMP依赖性蛋白激酶（cAPK)激活：磷酸化酶激酶、甘油三酯酶、酪氨酸羟化酶、RNA聚合酶II等，抑制：糖原合成酶、乙酰C

29、oA羧化酶、丙酮酸激酶等。（2）蛋白激酶C（PKC)广泛分布在真核细胞特别是哺乳动物细胞的一种蛋白激酶，以无活性形式存在胞液中，当被Ca2+等激活后转移到膜上，PKC对调节细胞代谢，分化，生长，增殖及信号转导等起重要作用。（3）磷酸化酶激酶（PhK)是糖原代谢中一个关键的调节酶，其催化的反应是通过磷酸化作用使无活性的磷酸化酶b转化成有活性的磷酸化酶a，从而加强糖原分解代谢扬州大学生物科学与技术学院六、同工酶（isoenzyme）（一）定义： 催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。扬州大学生物科学与技术学院（二）特点： 1、都是寡聚酶 2、不同的

30、亚基组成 3、不同亚基的活性中心非常相似 4、组织分布部位不同 5、所催化的反应有侧重点扬州大学生物科学与技术学院如：扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院扬州大学生物科学与技术学院生理及临床意义 同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究；用于解释发育和组织分化过程中阶段特有的代谢特征；在代谢调节上起着重要的作用；同工酶谱的改变有助于对疾病（尤其是癌症）的诊断。心肌梗塞和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化1酶活性心肌梗塞酶谱正常酶谱肝病酶谱2345扬州大学生物科学与技术学院12345酶活性迁移位置酶活性迁移位置ab(a) LDH同工酶电泳图谱 (b)（a）正常人LDH同工酶电泳图谱,（b）心肌梗塞病人血清LDH同工酶电泳图谱