基于拉曼荧光光谱的分子检测系统设计(共27页)

1、 武汉轻工大学(dxu) 毕 业 设 计（论 文）设计(论文)题目：基于(jy)拉曼荧光光谱的分子检测系统设计 姓 名 王 梦 博 学 号 101204307 院 （系） 电气(dinq)与电子工程学院 专 业 电子信息科学与技术 指导教师 李 鸣 2014年6月15日目录(ml) TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc7606 摘要(zhiyo) I摘要(zhiyo)基于分子(fnz)振动的拉曼光谱被认为(rnwi)是研究分子结构的一种重要研究方法，可以反映出试样中某些特定分子的特性，其特征振动“指纹”可以作为分子身份与结构识别的重要信息。拉曼光谱能够对待检测物品进

2、行定性分析及对相似物进行区分并通过浓度进行定量分析，因此拉曼光谱分析技术凭借其优越的功能成为分析测试领域的研究热点。本课题设计的拉曼光谱仪主要用于一般生物反应及药物筛选。主要简述了拉曼光谱基本原理及拉曼光谱仪的工作原理，然后进行仪器构架的总体设计。包括光学系统的设计、三维运动平台、辅助系统的设计、CCD图像定位系统设计、仪器中精确扫描系统的设计等过程。采用了光纤拉曼探针以提高了仪器系统稳定性，并对仪器中精确扫描系统进行基本设计。进行了表面增强效果以及自动对焦验证实验、三聚氰胺检测试验，实验结果表明，所设计的分子检测系统可以实现表面增强拉曼光谱采集，自动焦点位置寻找及对芯片进行逐点扫描的功能，能

3、够用于生化反应的定性分析。关键词：拉曼荧光光谱；分子检测系统；光纤拉曼探针； IIAbstract Raman spectrum which is based on molecular vibrations has been recognized as a important method of molecular structure. It can reflect the characteristics of certain molecules in the sample. The vibration characterized fingerprint can be used as impo

4、rtant information and structure identity recognition of molecule. Raman spectroscopy has the qualitative of analysis and distinguish between similar objects by quantitative analysis of the concentration function, so Raman spectroscopy with its unique advantages has become a hot topic in the field of

5、 analytical testing.The paper outlines the basic principles of Raman spectroscopy and the working principles of Raman spectroscopy, then designs the instrument architecture. The design includes the optical system, three-dimensional motion platform, auxiliary systems, CCD image positioning system des

6、ign, instrument precision scanning system and other processes. Using a fiber-optic Raman probe instrument to improve system stability, and designs the basic system of precision instrument scanning.Conducted a surface-enhanced effects and the AF verification experiment, melamine testing, experimental

7、 results show that molecular testing system is designed to achieve a surface-enhanced Raman spectroscopy acquisition, automatic focus position to find and the chip -by-point scanning feature, which can be used as qualitative analysis of biochemical reactions.Keywords: Raman fluorescence spectroscopy

8、; Molecular Detection System; Optical fiber Raman probe; 第1章：绪论(xln)1.1 拉曼效应(xioyng)当光照射到介质(气体、液体或透明的样品)的时候，除了会被介质所吸收、反射和透过之外，光子与物质分子进行碰撞时，总会有一小部分光会按照不同的角度(jiod)被散射开来，分为弹性散射和非弹性散射两种方式。弹性散射的散射光是与激发光源波长相同的成分，光子的能量没有变化，只是改变了方向，这种散射包括丁达尔散射(Tyndall Scattering)和瑞利散射(Rayleigh Scattering)；非弹性散射的散射光不仅改变了光的传播

9、方向，而且也改变了光波的频率，即在碰撞的过程中，物质分子吸收了光子的一部分能量，使散射光频率小于入射光的频率，或者光子吸收了物质分子的部分能量，使得散射光频率大于入射光的频率，这两种碰撞都得到了与入射光频率不同的散射光，包括布里渊散射(Brillouin Scattering)和拉曼散射(Raman Scattering) 姚启钧. 光学教程M. 北京: 高等教育出版社, 2002年4月. 47-56。1928年，印度物理学家拉曼(C.V. Raman)在进行水银灯照射苯溶液的实验时发现了与入射光频率不同且强度非常微弱的散射光现象，这种现象被称为拉曼散射，散射光的光谱称为拉曼光谱(Raman

10、Spectra)。拉曼的实验发现被英国皇家学会评为“20年代实验物理学中最杰出的发现之一” 刘玲. 激光拉曼光谱及其应用进展J.山西大学学报, 2001, 24(3): 279-282。1930年，因发现这一新的散射现象和其所取得的光散射研究成果，拉曼获得了诺贝尔物理学奖。1.2 拉曼技术的发展自拉曼现象被发现后的近30年，拉曼光谱技术的发展进度都十分缓慢，这是因为当时的拉曼光谱仪是使用汞弧灯作为灯源，而其所产生的拉曼散射光十分微弱，只相当于入射光强度的百万分之一左右，想要被很好的检测到十分困难，这就极大地限制了拉曼光谱技术的应用与发展 于永爱, 吴维, 朱冬寅. 拉曼光谱技术与便携式拉曼光谱

11、仪J. 激光与光电子学 进展, 2009, 46(8): 85-87。20世纪60年代激光器问世，这种激光的功率高、能量集中、单色性好、方向性强，成为新的拉曼激发光源。与此同时，光谱技术、光电信号转换技术也有了飞速发展，高分辨率，低杂散光的双联和三联的光栅单色仪 陈玉伦. 拉曼光谱仪的研制及预处理方法研究. 杭州: 浙江大学,2006年.25-26也相继被开发出来。这些技术的革新都给拉曼光谱带来了新转机，极大的推动了拉曼光谱技术的发展。20世纪70年代科学家们以激光器和光栅单色仪为基础，选择不同的激光波长，拓展光谱仪探测的范围，发展了共振激光拉曼技术。1974年，Fleishmann等通过实验

12、发现，当在经过适当氧化还原处理的银电极表面吸附吡啶分子时，该分子的拉曼散射截面增加了106倍，这也就是后来的表面增强拉曼技术 杨序纲, 吴琪琳. 拉曼光谱的分析与应用M. 北京: 国防工业出版社, 2008年5 月. 49-52。不久以后，出现了显微系统和拉曼分析相结合的显微拉曼技术。1983年，Jessings等成功进行了傅里叶变换拉曼实验，它能够分离出荧光效应以提高拉曼光谱的分辨率。此后，人们又研究制作出了各种型号的傅里叶变换拉曼光谱仪。1987 年，第一台近红外激发傅里叶变换拉曼光谱仪由PE 公司研发制出。20世纪90年代后期，为满足社会活动的需求，人们不断突破探索多项新技术，并将其应用

13、在拉曼光谱仪上。例如：使用光纤对距离较远或者对未知威胁的样品进行安全检测，引入声光调制器 刘大禾, 黄琬云, 周伟国. 反射式窄带滤光片J. 光学学报, 1990, 16(2): 62-65 (AOTF)取代光栅作为分光元件，用以测量拉曼光谱；采用全息带阻滤光片以便更好的消除瑞利散射干扰问题等。此后，拉曼技术得到了广泛应用，开始走出实验室，进入了生物化学、精密加工、安防检查、考古发掘、文物珠宝鉴定、化妆品鉴定、医药检测等众多领域。1.3 国内外研究(ynji)现状及本课题研究的意义近年来，因为拉曼光谱对物质检测与分析所具有的重要(zhngyo)意义，国外许多国家与组织都在积极进行拉曼光谱仪的研

14、制与开发，在拉曼光谱研究方面也积累了丰富的研制经验。目前，国外的各种类型的拉曼光谱仪凭借(pngji)其优良的仪器性能，在中国拥有垄断性的市场 林中, 范世福. 光谱仪器学M. 北京: 机械工业出版社, 1989年. 19-20。其中美国的尼高力(Nicolet)公司 范世福. 分析检测技术及分析仪器的现代化发展J. 分析仪器, 2003, 13(1): l-5、海洋光学(Ocean Optics)公司、英国的雷尼绍(Renishaw)公司和法国的JY(Jobin Yvon)公司凭借其领先的技术在中国乃至全球具有很高的市场占有率。其他一些公司如法国的Kaiser Optical System公

15、司，ISA公司，Mot公司，北爱尔兰的Andor公司，德国的斯派克(Spectra)分析仪器公司，荷兰的Mantes公司，日本分光公司等，都有拉曼光谱仪产品 曹学军, 崔金泰. 神奇的纳米技术:用原子塑造世界(下)J. 国外科技动态, 2000, 15(8): 29-32。这些国外厂家的拉曼光谱仪性能较好，已广泛的应用到了实际科研和测试工作中，垄断了国内的市场份额。同时进口拉曼光谱仪的价格也比较昂贵，一般在100160万元人民币左右。而国内在激光拉曼光谱仪的领域里，研究开发起步较晚，发展相对发达国家来说比较落后。目前国内尚无拉曼光谱仪的商品生产厂家。在某些高校中都是出于科研和教学的目的，自行组

16、装了教学用拉曼光谱仪，如苏州大学信息光学研究所制作的拉曼光谱测试仪 里佐威. 近代Raman光谱技术J. 物理实验, 2002, 22(1): 3-7，浙江大学光电与科学仪器系自行设计研制的LRZ.1型拉曼光谱仪，四川大学和成都科技大学组装的脉冲激光器激发的用于光多道分析器OMA(Optical Multi-channel Analyzer)控制与探测的激光共振拉曼光谱系统 王柯敏. 光化学传感器理论与方法M. 湖南: 湖南教育出版社, 1995年. 8-13，还有北京卓立汉光仪器有限公司和中国科学院大连化学物理研究所共同研发的大型紫外共振拉曼光谱仪等，另外北京大学所属工厂也曾经尝试制作了少量

17、供教学实验用的拉曼光谱仪。拉曼光谱可使用可见光或者近红外光激光器进行激发，其拉曼位移在不同类型的物质对应着不同的“指纹”拉曼光谱，并且其强度与物质浓度在一定的条件下表现出线性关系，根据这一特点，可以对物质结构、成分、浓度等进行检测。拉曼光谱作为一个研究振动跃迁和转动跃迁的方法，具有一些重要的特点，如制样简单、水的干扰少、拉曼光谱分辨率较高等 林中, 范世福. 光谱仪器学M北京: 机械工业出版社, 1989年. 137-139。所有的转动能级和几乎所有的振动能级的拉曼频移通常都在254000 cm-1(最小可以测10 cm-1)范围内，简单的计算表明，当采用400600nm范围内的任一激光器照射

18、样品时，拉曼散射光均处于可见光谱区内。拉曼光谱对样品进行无损分析己广泛应用到如石油化工、酒类分析、医药学、宝石鉴定、环境保护、文物的考古鉴定、公安与法学样品的鉴定、工业生产监测与控制、商品检验等各个领域之中 Futamata M, Borthen P, Thomassen J. Application of an ATR Method in Raman SpectroscopyJ. ApplSpectrosc, 1994, 48(2): 253。综上所述，考虑国内外拉曼光谱技术的研究发展现状，立足于我国国情，实现拉曼光谱仪的国产化，降低制造成本，制造具有优良性能，价格相对较低的用于样品微区分析

19、的新型激光拉曼光谱仪，具有十分重要的意义。1.4 论文结构及各章节内容本课题所研制的拉曼光谱仪利用了拉曼光谱作为物质分子结构的“指纹”，设计的光谱仪用于一般生物反应及药物筛选。第二章从不同(b tn)方面介绍了拉曼光谱的特点，分别介绍了拉曼散射原理(yunl)，拉曼效应的量子力学解释，拉曼位移，详细分析了拉曼光谱仪原理，还介绍了拉曼光谱仪的种类以及每种拉曼光谱仪的体系结构。第三章详细的讨论(toln)了拉曼光谱仪的总体设计过程。包括光纤拉曼探针的采用、仪器原理构架、光学系统的设计、三维运动平台、辅助系统：温度控制系统、仪器中精确扫描系统的硬件设计、CCD图像定位系统设计等。并进行了表面增强效果

20、及自动对焦验证实验、三聚氰胺检测试验，实验结果表明，所设计的分子检测系统实现了表面增强拉曼光谱采集，自动焦点位置寻找及对芯片进行逐点扫描的功能，可以用于生化反应的定性分析。第2章：拉曼光谱基本理论2.1 光散射与拉曼效应的原理当一束频率为v0的单色光入射到透明介质(如气体、液体或透明的样品)时，除了会被介质所吸收、反射和透过之外，还有一小部分光会出现向四面八方辐射的散射现象。光的散射现象可大致分为以下四种：丁达尔散射、瑞利散射、布里渊散射以及拉曼散射。丁达尔散射的散射光频率与入射光频率v0相同，它是由于不均匀介质或介质中存在尘埃等原因引起的；瑞利散射是由于入射光电场的作用而使得介质发生极化而造

21、成的。1871年，英国物理学家瑞利在研究物质粒子(微粒粒径远小于光波长)对入射光造成的散射问题后指出，当光线入射到如乳状液、胶体溶液等不均匀的 HYPERLINK /view/298837.htm 介质中时，介质就会因为不均匀的 HYPERLINK /view/42992.htm 折射率而产生散射光，而即使是光入射到均匀介质时，因为介质中的物质 HYPERLINK /view/25255.htm 分子的无规则热运动，分子间的固定位置关系被破坏，从而也产生一种分子散射，这就是瑞利散射，散射强度和入射光波长的四次方有反比关系。瑞利散射光频率也与入射光频率0相同，其强度和数量级约为入射光强的10-4

22、10-3；布里渊散射 程光煦. 拉曼布里渊散射原理及应用M. 北京: 科学出版社, 2001年6月. 39-42是光波与声波在传播时相互作用而产生的光散射过程，布里渊散射光的频率与入射光v0不同，但其频率变化并不明显。拉曼散射是由于介质内部物质分子的振动与转动而造成的，拉曼散射光的频率变化程度较大，情况比较复杂，即=0|，其强度数量级约为瑞利散射的10-810-6，最强的也只是瑞利散射的10-3。根据经典电动力学理论，可以(ky)推导出散射光的散射公式。当单色光源(电矢量(shling)为 E )入射到物质(wzh)上时，电子的位移会产生电偶极矩，在某一入射光范围内，单位体积的感生偶极矩 P

23、与入射电矢量 E 成正比，即： (2-1)式中是极化率张量。其数量级为。电场强度是取决于单色光束光子频率0的振动函数： (2-2)将式(2-2)代入式(2-1)可得： (2-3)系统中电荷的分布决定了极化率的取值，即若振动期间原子配位发生改变，则表征电荷分布的参量会发生变化，那么的取值也要发生变化。在某一特定条件被满足时，振动着的电偶极子会辐射出电磁波，成为散射光。散射光的频率、波矢都与入射光的频率、波矢不同，这可以被理解是电偶极矩被机械或声子“调制”的结果 张树霖. 拉曼光谱学与低维纳米半导体M. 北京: 科学出版社, 2008年. 171-183。因此，光散射就是一种电磁辐射，是在很小范围

24、的不均匀性引起的衍射，且在4立体角内都可以检测得到。2.2 拉曼散射的量子解释拉曼效应起源于分子振动(点阵振动)与转动，散射物质的内部信息可由拉曼光谱中的拉曼频率、强度及偏振等反映出来，因此从拉曼光谱中可以得到分子振动能级(点阵振动能级)与转动能级结构的信息，得到物质结构及物质组成成分的相关数据。拉曼散射的完善解释还需用量子力学理论，不仅可解释散射光的频率差，还可解决强度和偏振等问题。当处于基电子态的散射物微粒分子受到入射光照射时，可以将激发光与微粒分子发生作用而引起的极化看作为虚的吸收，称作电子跃迁到虚态(Virtual state)，虚能级上的电子立即跃迁到下能级而发光，即成为散射光。设仍

25、回到初始的电子态，则有如图2.1所示的三种情况。散射光中既有与入射光频率相同的瑞利谱线，也有与入射光频率不同的拉曼谱线。在拉曼谱线中，把频率小于入射光频率的谱线称为斯托克斯(Stokes)线，又称为红伴线；而把频率大于入射光频率的谱线称为反斯托克斯(anti-Stokes)线，又称紫伴线。斯托克斯线比反斯托克斯线通常要强一些。图2.1瑞利、拉曼散射过程(guchng)中量子跃迁由图2.1可知(k zh)：在入射光(量)子()被吸收后，使电子(dinz)和晶格振动初态( )跃迁到一个虚中间态( )；然后辐射出散射光子()由中间虚态回到终态( )，同时产生(或湮灭)了一个频率为而波矢为的元激发 吴

26、国安. 光谱仪器设计M. 北京: 科学出版社, 1990年3月. 77-82。分子振动的感生电偶极矩PG的跃迁矩阵元为： (2-4)其中和都是波函数，引入符号nk上式中的极化率跃迁矩阵元 (2-5)由于极化率是实数，因此是对称矩阵。从电偶极矩的跃迁矩阵元的公式和极化率矩阵元的式（2-5）可以看到，若极化率为常数C，就可以将它们提到积分号前面,由波函数和的正交性，则有： 或 (2-6)n=k表示跃迁出现在同一能量的能级间，nk表示跃迁出现在不同能量的能级间，若出现光散射现象，则分别对应于瑞利散射(入射光能量不变)和拉曼散射(入射光能量发生变化)。这也意味着，原子或分子要产生拉曼散射的条件为电子的

27、波函数分布位置r和分子的极化率发生改变，而这种改变就是源于原子中电子或者分子中原子在平衡位置附近存在振动。于是量子力学就在微观运动的层面上解释了拉曼散射效应。斯托克斯拉曼散射(snsh)或反斯托克斯拉曼散射分别对应于从低能级(nngj)到高能级的跃迁或高能级到低能级的跃迁。因此，拉曼散射的斯托克斯线的光强为： (2-7)反斯托克斯线的光强为： (2-8)其中(qzhng)为波尔兹曼常量，T为绝对温度。二者的强度比是： (2-9)一般情况下，比1大许多，因此量子理论正确地说明了斯托克斯散射强度大于反斯托克斯散射强度的问题，并且能够很容易获得斯托克斯和反斯托克斯散射强度的比值。2.3 拉曼位移所谓

28、拉曼位移(Raman Shift)，即斯托克斯散射光与反斯托克斯散射光的频率与激发光源频率v0之差，表示为v0。最简单的拉曼光谱如图2.2所示。图2.2拉曼光谱图在光谱图中出现了三种谱线，位于中间的是瑞利散射线，或者叫激发谱线，它的频率为v0.，也就是激发光的频率，它的强度最强。斯托克斯线在瑞利线的低频一侧，斯托克斯线的强度约为瑞利线强度数量级的10-210-4。反斯托克斯线在瑞利线的另一边，反斯托克斯散射光的强度要比斯托克斯散射强度弱得多，因此拉曼光谱分析技术 彩风. 拉曼光谱旋转样品技术的研究J. 现代科学仪器, 1995, 19(4): 33-35中常采用斯托克斯散射光线。分子振动能级间

29、跃迁决定了拉曼位移，不同的化学键或基态有不同的振动方式，决定了其能级间的能量变化，与之对应的拉曼位移是特征的，也是分子振动能级的直接量度，这成为运用拉曼光谱进行分子结构定性分析的理论依据。附加频率值与振动能级有关的称作大拉曼位移，与同一振动能级内的转动能级有关的称作小拉曼位移：大拉曼位移：(为振动能级带频率)： (2-10)小拉曼位移：(其中(qzhng)B为转动常数): (2-11)利用转动(zhun dng)常数： (2-12)转动(zhun dng)能级： (2-13)能级的选择为： (2-14)因此有： (2-15)2.4 拉曼光谱分析的技术特点通过测定拉曼光谱的强度与位置，可鉴定试样

30、的分子结构，并可分别进行定性分析和定量分析。拉曼光谱可提供有关样品分子中存在何种功能团的结构信息，所以可用于鉴别试验和结构解析。将样品与对照品的拉曼光谱在相同的测定条件下进行比对，若两者光谱相同，即鉴定为同一化合物。拉曼光谱的优点 周光明, 盛蓉生, 曾云鹗. 表面增强拉曼光谱技术应用于生物体系的最新进展J. 分析测试学报, 1996, 15(6): 85-87：(1)、快速，准确，样品制备简单甚至不需要制备，测量时通常不会破坏样品（固体，半固体，液体或气体）；(2)、处于可见或近红外光范围的谱带信号可以有效地与光纤联用。这也意味着谱带信号可以从包封在任何对激光透明的介质，比如玻璃、塑料之内，

31、或将样品溶于水中获得；(3)、现代拉曼光谱仪分析速度快（仅需几秒到几分钟），使用操作简单，性能真实可靠。因此，可将拉曼光谱与其他分析技术联用，这比起与其他光谱联用技术从某种意义上说会更加简便（可以使用单变量和多变量方法以及校准）。除常规的拉曼光谱外，还有一些较为特殊的拉曼技术。它们是共振拉曼，表面增强拉曼光谱，拉曼增益或减失光谱以及超拉曼光谱等。其中，共振拉曼和表面增强拉曼光谱法在药物分析应用相对较多。荧光、样品的热效应和基质或样品自身的吸收是影响拉曼光谱测量的主要干扰因素 马艳皎. 便携式拉曼光谱仪技术的研究D. 苏州: 苏州大学, 2004年. 50-54。在拉曼光谱中，荧光干扰的表现为一

32、个典型的倾斜宽背景。测量固态物质前，用激光照射样品一定时间，则荧光干扰可以被减弱。样品测定中另一个需要考虑的重要因素是光谱的污染，拉曼效应很弱，可以被许多外源影响掩蔽。普通的污染源包括样品支持物（容器或基质）和周围光线。通常，这些问题可以通过细致的实验方法来识别和解决。2.5 拉曼光谱仪的分类按照仪器将来自试样的拉曼散射光随频移分散开的方式不同，拉曼光谱仪可分为三种类型：单色型，分光光谱仪型和迈克尔逊干涉型光谱仪 乔锋, 叶勇, 胡继明等. 拉曼光纤探针的研究进展及应用J. 山西大学学报, 2003, 23(2): 1-5。(1)、单色型拉曼光谱仪的组成结构最简单，它是由单色光源，一个仅允许通

33、过单一波长拉曼光的滤光器和一个光学检测器所组成。这种仪器虽然结构简单，但对给定波长拉曼光波的光通量能达到与其他任何类型的光谱仪一样高甚至(shnzh)更高。然而，单滤光器拉曼仪仅能检测到拉曼光谱的一个波长（实际上是一个很窄的波段），它阻挡了来自试样的绝大部分拉曼散射而只允许很狭窄的光谱段进入检测器，造成光能量(nngling)分散。对大多数试样而言，这意味着绝大部分拉曼散射光波被浪费掉了，因此(ync)它的使用具有局限性。(2)、分光光谱仪则很好的克服了单色型光谱仪的这个缺点。分光仪中使用的光栅几乎都是反射式光栅，它的优点是能将单缝的中央最大值的位置从没有色散的零级光谱转移到其他色散的光谱级上

34、。分光光谱仪能将不同波长的光分散开并在平面的不同位置上成像。来自入射狭缝的光照射衍射光栅，然后衍射光聚焦在光谱仪输出平面上。为了能够同时测得不同波长光束的强度，可以在该平面上安置多元件探测器（例如CCD）。分光光谱仪光路如图(2.3)所示。图2.3分光光谱仪光路示意图入射光由狭缝进入，经反射镜准直入射于平面反射光栅，来自光栅的衍射光被另一个反射镜聚焦于探测器上，也就是像平面上。为了减小各种像差，两个反射镜是独立安置的。如果用复曲面代替球面反射镜，也能有效地降低像散差。分光光谱仪使用了几个探测元件，可以同时检测几个不同波长，因而使得检测时间获得显著缩短。多通道检测的最大好处，从理论上讲，是其检测

35、时间在相同光谱分辨率下，比单色仪快了5002500倍，使用阶梯衍射光栅或全息光栅的光谱仪还能将光谱叠加。(3)、迈克尔逊干涉仪型拉曼光谱仪拉曼光谱仪中很重要的一类是使用了傅里叶变换的干涉仪型光谱仪。干涉仪收集来自试样的拉曼散射光，进入探测器后获得干涉图，对干涉图进行傅里叶变换就能得到拉曼光谱。迈克尔逊干涉仪光路如图2.4所示。 图2.4迈克尔逊干涉仪光路示意图入射光进入分光镜被分为两束，一束作为透射光入射于固定反射镜，另一束作为反射光入射于移动反射镜。两束相干光来自同一光源，因此探测器检测到的结果是两束光干涉所得的光强度。两光束光程差的变化(binhu)可由平移平面镜引起，从而使得入射与探测器

36、上光强度发生变化。当光程差发生一个波长的变化时，检测到的光强度将从极大变到零，又回到极大。光强度与光程差之间是余弦函数关系，加上不变的偏置值即可画出干涉图。多数情况下而言，许多不同波长的光同时进入干涉仪所产生的干涉图是每个波长所产生余弦信号的相加。用下列(xili)傅里叶变换可从干涉图得到光谱图。 (2-16)式中S()为光谱(gungp)函数；I(x)为干涉函数；为频率，以波数为计数单位；x为光程差，以厘米为计数单位。傅里叶变换拉曼光谱 邓江东. 扫描近场光学显微镜原理及使用J. 激光与光电子学进展,1997,6(2):3-6是起源于上世纪90年代的新技术，当用波长为1064nm的近红外钕钇

37、铝石榴石激光照射样品时，采用傅里叶变换技术对信号进行采集并多次累加，可以大大减弱拉曼光谱中的荧光背景干扰，提高信噪比和分辨率。另外，许多试样对1064nm光波的吸收与可见光相比要小得多，因此这大大降低了对试样可能引起的损伤。它与傅里叶变换红外光谱仪的结构在原理上相似，因而还可以和傅里叶变换红外光谱仪联用。2.6 拉曼光谱仪工作要求总的来说，一台拉曼光谱仪主要有两点要求：(1)、阻挡瑞利散射光和其他杂散光进入探测器；(2)、将拉曼散射光分散成它所组成的各个频率，并使用探测器进行收集。第一点要求是因为瑞利散射光强度是拉曼散射光强度的千倍，如果这样高强度的光束未受到衰减或阻挡而被探测器所收集，则会将

38、拉曼光谱完全或部分地遮盖。第二点要求是为了保证来自试样的拉曼散射光被最大程度地探测到，有较高或合适的光谱分辨率和频移精度，有合适的光谱范围，以及能够快速获得资料和操作简便。为达到以上要求，不论何种类型仪器都必须配置激光光源，光学系统，分光仪，探测器和计算机处理系统，并以它们的最佳组合满足要求。其主要的工作原理为：激光光源产生一束光强稳定的单色激光，经过样前准直光学装置，在滤除激发激光的杂散光后，将激发光聚焦到待测样品上，待测样品便被激发出拉曼散射光，然后对激发出的拉曼散射光进行收集，滤去瑞利散射光，最后通过收集光纤传输到单色器中。根据拉曼散射光波长的不同，单色器内的分光光谱仪的内置光栅会对其进

39、行分离，然后光谱仪检测器(CCD)就开始记录收集不同波长的拉曼信号，并转换成数字信号，最后光谱仪通过USB传输线将转换后的数字信号传送到计算机数据处理中心。因为傅里叶光谱仪在的出现大大拓宽了拉曼光谱仪的应用范围，其扫描速度比色散型拉曼光谱仪要快得多，可以消除70%的荧光干扰，因此在第三章中将进行傅里叶变换型拉曼光谱仪的设计，设计中采用光纤拉曼探针对拉曼光谱实现聚焦、过滤和收集，简化了系统的设计难度。2.7 光纤与光纤拉曼探针(tn zhn)光纤是优越的低损耗传输线，在使用时对于测量设备与被测对象的相对位置可以不用考虑，它的适应场合非常广泛。由于能够结合不同光谱仪器进行测量使用，因此在不同领域都

40、获得了越来越广泛的应用，使用光纤制作(zhzu)的光纤传感器也越发引起人们的注意 张工力, 白永林等. 一种高透过率光纤探针的制作J. 光子学报,1999,15(28):436。光纤传感器具有很好的抗干扰能力和很强的抗化学(huxu)腐蚀能力，能够在环境恶劣的情况中使用。它的探头小巧灵活，可以直接插入活体组织或活体细胞、毛细血管等对分析物进行在位连续测量。许多光谱分析法结合光纤进行创新，获得了崭新的应用前景，比如在较远的距离对样品进行检测分析，在危险环境中进行取样，或将多种光谱仪器进行结合，制造出新的测量仪器等。拉曼光纤探针有以下几种重要的类型：(1)、单光纤探针：在单光纤探针中，入射光纤和收

41、集光纤用同一根光纤来制作。因为其入射和收集光锥完全是重合的，所以理论上单光纤探针的收集效率会是最高，但实际的应用中却发现它的收集效率并没有达到理论值，造成这种情况的原因有两个：一是光纤材质中的硅材料拉曼散射背景较强，对那些高反射或散射性的样品更是如此；二是要分开激发光和入射光，必须要使用一个分光镜，这造成了信号的损失。(2)、双光纤探针：使用了两根光纤探针，一根用于照射样品，另一根用来收集拉曼散射信号，由于入射光纤和收集光纤光锥重合体积会影响到光纤探针的效率，而如果使入射光纤和收集光纤互相成相应的角度，或者将光纤的末端削减到一定角度，就可以有效地提高入射光纤和收集光纤的光锥重合体积，从而提高光

42、纤的收集效率，因此其最主要的研究方向是光纤探针的几何形状。(3)、多光纤探针：McGreey等人研究发现 郝雅琼, 吴玉清, 刘俊秋等. 半胱氨酸在银基底表面吸附机理的拉曼光谱研究J. 光散射学报. 2002, 14(3): 172-175，增加收集光纤的数目可以增加入射光纤和收集光纤光锥重合的体积，提高光纤探针的效率。这种光纤后来被许多研究者采用。但增加了光纤的数量会增强光纤中硅材料的拉曼散射背景，而且这种探针价格也比较昂贵。拉曼光纤探针的工作原理与传统的拉曼光谱分析方法主要差别在于，传统方法中样品必须被放置在测量光路中；而现代光纤具有使光线弯曲传播的能力，使用光纤探针后，可以通过光纤将检测

43、光从光源引出，与样品进行相互作用，再经过光纤的收集和传输，将信号光送至检测系统。这可以大大提高仪器系统的可靠度。拉曼光纤探针(图2.5)的基本原理为：激光光源经过聚焦进入光纤到达探头部分，而探头与样品接触，再经光纤拉曼探头收集激光与样品作用后产生的可测量的拉曼散射信号，通过光纤将信号传到检测器得到拉曼光谱。图2.5光纤拉曼探针的结构及工作2.8精确(jngqu)扫描系统在本课题(kt)设计仪器的扫描过程中，使用激光拉曼探针扫描硅片上附着的生物分子团。扫描过程中，在三维运动平台的支持下，拉曼探针会进行扫描及对焦动作，而生物芯片则保持静止状态。由于生物芯片在扫描完后要进行更换，属于消耗品，而芯片的

44、更换必然导致其自身(zshn)的重复定位出现误差，因此与芯片的夹紧定位相关的所有零部件都是精确扫描系统需要研究的对象。同时，影响其位置的一个重要因素是生物分子团在硅片上的点样精度。生物分子团是附着在硅片上的，而硅片又固定在生物芯片中，生物芯片则通过装夹机构固定在仪器托架上，而温度等因素都会影响仪器托架与拉曼探针的位置关系。所以直接利用仪器的制造装配精度来达到生物分子团在仪器中的定位，是非常不可靠的。因此三维运动平台的精度在精确扫描系统中的重要性是不言而喻的，它决定了拉曼探针的运动定位精度以及对焦精度。不同的扫描算法则决定了拉曼探针的行走路径，不同的行走路径显然需要不同的时间，这决定了扫描过程的

45、工作方式。要可靠的完成对生物反应过程的拉曼光谱扫描，需要使在仪器坐标系中表达的拉曼探针光斑的计算直径大于仪器坐标系中生物分子团中心位置的分布直径。其中由三个直线电机组成的三维移动平台是影响仪器坐标系中的拉曼探针光斑计算直径的主要因素。故仪器坐标系中表达的拉曼探针光斑的计算直径会具有更大的稳定性，而仪器坐标系中生物分子团中心位置的分布直径则根据不同的设计方式有较大变化。拉曼探针光斑的计算直径就是当生物分子团与激光光斑的重合度刚好可以激发足够强度的拉曼散射时，以激光光斑和生物分子团的中心距为半径所做的圆的直径。在实际过程中，由于纳米表面增强技术的应用，拉曼光斑并不需要覆盖生物分子团的全部就可获得可

46、用的拉曼散射强度。为了保证所获得的拉曼光谱的质量，现取拉曼探针光斑全部覆盖生物分子团为设计条件。第3章 激光拉曼光谱仪的设计本章结合前两章的拉曼光谱技术和拉曼光谱仪基本原理等内容，设计了一种用于检测分子结构的傅里叶变换型激光拉曼光谱仪。采用了激光拉曼探针代替了传统光路，仪器的原理构架如图3.1所示。整个仪器系统分为光学系统，三维运动平台系统，温度控制系统，CCD图像定位系统以及计算机处理系统五大部分。进行了表面增强效果及自动对焦验证实验、三聚氰胺检测试验。图3.1激光拉曼光谱仪的原理(yunl)构架 由图3.1可以知道，由合适的激光光源发出(fch)一定波长的激光，经过光纤传导，由对应的光纤拉

47、曼探针收集，经过探针聚焦等处理之后，照射在待检测物质上，产拉曼散射(snsh)。拉曼探针收集散射光，通过光纤传入CCD分光光谱仪。在光谱仪中散射光按频率分开，CCD阵列检测不同频率的光强以便得到数字化的散射光谱，再由光谱仪把散射光谱送到计算机，通过光谱分析获取用户感兴趣的信息，如分子结构等。同时，与拉曼探针相连接的三维移动平台可以使得激光在不同的空间位置聚焦，并收集光谱，这能够大大改进仪器的检测使用效率。3.1 光学系统的设计本仪器光路系统设计如图3.2所示。它由一个激光发生器，一个激光拉曼探针，一个分光器及CCD阵列以及相应的电源适配器组成。由于采用了光纤拉曼探针，本仪器的光路系统相当简单。

48、这些光学器件间都是通过光纤连接的，光学系统本身相当灵活。其中陷波滤光器的作用是能针对性地将瑞利散射光能量有效地滤除5到6个数量级，这些瑞利散射光波长在以激光波长为中心的几个纳米的波长范围内，从而让该波长范围以外的光信号顺利通过，因此后面就只需使用小型光谱仪色散分出光谱了。这种设计使得整个系统变得小巧紧凑，易整合，能够增强系统稳定性。图3.2光学系统原理图3.1.1 拉曼光纤探针拉曼探针是拉曼光谱仪中最重要的光学器件之一。它集聚焦和过滤，发射和收集于一体，小巧而轻便。根据需要使用的激发光频率，本设计采用必达泰克(BW TEK)的拉曼探针BACl00-532Q，其外形和主要参数如图3.3所示：产品

49、型号适用波长激发光纤参数接收光纤参数光学密度有效工作距离(mm)聚焦光斑密封BAC100-532Q532nm纤芯：105m数值孔径：0.22纤芯：200m接口：SMA905OD65.97.590m 5.9mm环氩材料密封图3.3激光(jgung)拉曼探针外形及主要参数BAC100拉曼探头采用了革新性的外形包装和领先的光学设计，可用在液体、粉末和固体样品的检测。可选波长包括785、532nm。灵活的SMA905端口光纤耦合和耐久(niji)的保护外套十分适合光谱仪。拉曼探头适合实验室、野外和过程控制检测使用。3.1.2 激光器在拉曼光谱中所需要的光源必须要求线宽窄，输出(shch)波长稳定，能量

50、相对较高的光源来作为激发光，以此满足高分辨率和信噪比的要求。由于拉曼散射的强度与入射光的电场强度平方成正比，因此增大样品上的电场强度是产生足够强的拉曼信号的关键，也就是说要提高光源的功率密度。激光在这方面可以很好的满足需求。另一方面，因为拉曼散射频率与激光光源的发光频率一一对应，而多频率的光源必然会导致多频率的散射光，影响拉曼光谱的检测，所以通常在选择光源时，单色性是首先要考率的第一要素 向小飞. 光纤拉曼光谱仪的设计与改进D. 吉林: 吉林大学物理学院. 2005年. 129-132。本设计采用的激光器为由上海幻晟光电科技有限公司提供的型号为MR.IR.980.1W的激光光源，其外型及主要参

51、数如图3.4所示： 图3.4激光器外形及主要参数其输出波长可有808, 830, 850, 980nm等多种选择，恒温结构设计，稳定性较好，可配TTL进行调制，可以调节功率。应用领域：激光照排系统、近红外激光夜视、长距离激光遥测、固体激光激励系统应用等。3.1.3 分光(fn un)光谱仪分光(fn un)光谱仪(单色仪)的作用是将复合(fh)光分解成单色光或具有一定宽度的谱带，并实现光谱在CCD 上的精确成像。单色仪由入射狭缝、准直镜和衍射光栅组成。单级单色仪系统体积紧凑，可以提供高的通光效率，是最常采用的配置。拉曼散射光经光栅分光后在光谱仪焦平面 (探测器平面)上按波长线性展开。本设计采用

52、的是必达泰克光电科技(上海)有限公司研发的型号为BTCll2E的制冷型光谱仪，其外形和主要参数如图3.5所示：图3.5分光光谱仪的外观及其主要参数3.2 三维运动平台依照本课题所选定的设计方案，光谱仪需要拉曼探针做平面扫描运动和垂直对焦运动。现拟用高性能直线电机来搭建该平台以降低开发难度与周期。三维运动平台由三个直线电机及相应的适配零件组成，是整台仪器的核心部件。扫描过程的最高精度取决于三维平台的定位精度，因此为了获得稳定的定位运动性能，需要对其进行详细的综合设计。同时，如果有必要，需要为其加上防尘降噪措施，这是因为三维运动平台是仪器运行中一个主要的运动部件，是产生噪音的主要来源。本设计选用的

53、是Opt Sigma公司的电机组件。X，Y方向采用型号为SGSP20-35(XY)的组合型运动平台，行程35mm。Z方向采用型号为SGSP20-20(Z)的直线电机，其行程为20mm。SGSP系统电机的标称重复定位精度及回程误差都达3m以下。X，Y平台与Z方向电机间通过连接块连接，而激光拉曼探针通过一个探针夹持件连接至Z向电机上。为了充分发挥高精度直线电机的定位性能，所有这些零件都有较高的公差要求。3.3 辅助系统：温度控制系统由于生物化学反应过程对温度十分敏感，故为了更好的重现反应在生物体内的过程，仪器需要对芯片温度进行控制。由热交换装置，温度控制电路及若干温度传感器组成了测试控制系统。基于

54、生化检测仪器的特点，将半导体制冷片作为热交换的执行机构。温度控制系统加热/制冷原理块如图3.6所示：向芯片托架输送热量或是从中抽取热量都是由半导体制冷片的不同工作模式来控制的，这构成温度控制系统的执行器。为了监测芯片托架的温度变化，采用了高精度玻封NTC热敏电阻作为温度传感器。以威佛兰斯(WAVELENGTH)公司的型号为WTC3243的超稳型温度控制器为核心，构架温度控制系统。图3.6芯片温度(wnd)维持系统原理图由于制冷片的性能直接受到半导体制冷片的热端的散热能力影响，所以必须要在半导体片热端加导热散热装置以提高制冷速率。在风冷系统中，散热面积及气流流速是影响制冷效率(xio l)的两大

55、主要因素。导热片与气流的接触面积越大，则散热效果越明显。在制冷片上方增加了专用的散热片，从而尽可能的增大制冷片与气流的接触面积。同时为了加快热量在散热片内部的传导速度，在散热片离制冷片的远点和近点之间设置了一个热管，这些措施都能使得制冷片热端上的热量能很快的传导到大面积的散热片上。同时在散热片上方设置了风道，这是为了增加有效的气流流速。并且在风道口安装有一个静音型风扇，这样风扇就可以直接把冷风送入风道，进而(jn r)有效的冷却散热片了。3.4 CCD图像定位系统设计由光学原理可知，简单CCD系统的定位精度计算公式为： (3-1)式中： ：CCD图像系统的定位精度； ：CCD光敏元件颗粒大小；

56、 ：物镜放大倍数；要使： m (3-2)则有： (3-3) 对于一般CCD，其光敏元件颗粒直径约为8m，由此可得： (3-4)现取： (3-5)则可以满足系统要求。3.5 仪器中精确扫描系统的硬件设计由第二章可知，拉曼探针光斑的计算直径如图3.7所示：图3.7曼探针光斑恰好(qiho)完全覆盖生物分子团示意图生物分子团计算用直径(zhjng)表达式如下： (3-6)其中(qzhng)： ：计算用生物分于团直径； ：生物分子团最大直径； ：生物分子团最小直径； ：在 中 的权值； ：在 中 的权值；显然，有下式成立： (3-7)由图3.7可知，拉曼探针光斑刚好覆盖生物分子团时，光斑计算直径的计算

57、公式为： (3-8)将式(3-6)、式(3-7)代入式(3-8)得： (3-9)由此计算出拉曼探针光斑计算直径为： m (3-10)本设计需要通过连续的激光发射并收集拉曼光谱来监测一个反应的全过程。为了达到高通量和实时动态等的检测要求，在不增加昂贵的光学器件预算的情况下，我们采用了软件的方式实现的两者有机结合的方法，如图3.8所示。监测方案会根据不同的检测要求而有所不同。对于反应过程中需要检测的不同状态的时间间隔较小，即有完全实时要求的反应过程，则对拉曼探针连续的对准反应区进行控制，实时采集光谱。而对于一般反应速度的过程，可以采用循环扫描采样的方式，按次序扫描若干反应点，以提高反应通量。反应的

58、最小检测间隔(或采样间隔)为一个扫描周期。图3.8两种不同扫描(somio)方式原理示意图 (3-11)其中(qzhng)： ：扫描(somio)周期； n ：扫描通量，即一个周期内的扫描点数； ：与拉曼光谱积分时间相关，为每个反应点的单次检测时间； ：拉曼探针从一个反应点移动到下一个反应点所用的时间； ：拉曼探针在一个扫描周期中回程等所需的辅助时间；在式(3-11)中，取n=l，则，即检测时间间隔为0，这就实现了实时检测。因此，两种扫描方案在式(3-11)里是统一的。3.6 实验检测与结果分析3.6.1表面增强效果及自动对焦验证实验用于检测反应载体的生物芯片的设计思路大体是这样的：在单晶硅片上加工出微截面的小槽，再把硅片和玻璃片键合成一个整体，以形成微流道。在微流道基础上，加上合适的用于加入试剂或样品的结构，形成芯片核心部分。芯片核心部分再与装载芯片的外壳相配合，使之具有适合加液及和仪器相适配的能力。芯片的结构如图3.9所示，它的主要组成部分为核心芯片组及其外壳。其中核心芯片组由五层片状结构组成，内部形成两道小槽，槽两端分别为加液漏斗结构和抽气吸嘴结构，该槽即为生化反应的容器。由于生物芯片小槽表面附有用于增强拉曼效果的纳米金属，因此应该能够看到表面增