基因诊断3ppt课件

1、 第 10 章 基因诊断 Gene diagnosis China Medical University Department of Medical Genetics p480. 本章内容提示 基因诊断概念 基因诊断方法 直接诊断Southern 间接诊断PCR-RFLP DNA多态 基因诊断 实例：.第一节 基因诊断技术 第二节 基因诊断方法及实例. 基因诊断： 利用分子生物学技术从DNA 程度检测人类遗 传性疾病的基因缺陷，又称DNA分析法。 传统的诊断：表现型基因型 基 因 诊 断：基因型表现型 逆向诊断.基因诊断的特征：1 不受资料来源影响 外周血、活体穿刺组织、孕妇外周血、血斑等2

2、病症前诊断 尤其对于一些延迟显性疾病如Huntingtong舞蹈病3 产前诊断 防止患儿出生，提高人口质量.第一节 基 因 诊 断 技 术Southern印迹杂交.基 因 诊 断 技 术Northern印迹杂交.基 因 诊 断 技 术斑 点 杂 交点样Probe-32P检测AB1 2 3 4.基 因 诊 断 技 术荧光原位杂交.基 因 诊 断 技 术荧光原位杂交.基 因 诊 断 技 术聚合酶链反响.基 因 诊 断 技 术聚合酶链反响.基 因 诊 断 技 术 多重PCR在一个PCR体系中参与数对PCR引物，覆盖区域不重叠用于检测同一基因多个外显子的缺失E1 E2 E3.基 因 诊 断 技 术 R

3、T-PCR以mRNA为模板，经逆转录酶合成cDNA用于研讨基因表达使微量mRNA迅速扩增，提高mRNA检出的灵敏度.基 因 诊 断 技 术 PCR-SSCPSingle Strand Conformation Polymorphism单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差别，这种差别将呵斥一样或相近长度的单链DNA电泳迁移率的不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。.基 因 诊 断 技 术 - primer - 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 变性 单链DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影 1为正常 结果分析 2、4、5为纯合患者 3为杂

4、合子 . .基 因 诊 断 技 术生 物 芯 片.第二节 基 因 诊 断 方 法及实例直接诊断直接检测致病基因的突变 基因突变类型缺失、点突变、反复、插入等间接诊断运用DNA多态为遗传标志进展连锁 分析，确定待测者能否得到带有致病的染色体，从而间接地作出诊断 DNA多态RFLP、VNTR、SNP.一 DNA多态DNA多态DNA Polymorphism： 群体中每个个体DNA区域中等位基因或片段存在两种或两种以上的方式，对基因功能没有影响，称DNA多态。 它经过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标志。.DNA分析中常用的遗传性多态性标志有3类：1RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性

5、标志；2反复序列多态性VNTR：如短串联反复序列STR，为第二代多态性标志；3单碱基多态性SNP：DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标志。.一) 限制性片段长度多态性 Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP由于碱基变异能够导致限制酶切点消逝或新的酶切点出现，引起不同个体DNA在用同一限制酶切割时，产生不同长度的DNA片段，称 RFLP RFLP按孟德尔共显性方式遗传，是非常有用的遗传标志。.Allele II 产生了新的酶切点 Allele I Allele II12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8Kb RFLPSouther

6、n blot检测结果 .AlleleII酶切位点消逝 .二)数目变异串联反复，variable number tandem repeats, VNTR反复序列以各自的中心序列反复单元，首尾相连多次反复，称为串联反复序列，其反复次数在人群中存在变异，构成多态即 VNTR。散在分布于染色体上。反复单位625bp长，称为小卫星DNA。反复单位26bp长，如TAn, (CGG)n等，称为微卫星DNA。.VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联反复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。DNA多态可以经过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态amplified fragment length p

7、olymorphism, Amp-FLP.VNTR 酶切，电泳后的检测结果大小.PCR-VNTR检测.PCR-VNTR.三)单核苷酸多态性SNPSingle Nucleiotide PolymorphismSNP：发生在基因组中的单个核苷酸的替代根据SNP在基因中的位置，分为： 基因编码区SNP 基因周边SNP 基因间SNP在人类基因组中每100300个核苷酸就有一个SNP.二、基诊断方法及实例 直接检测致病基因本身的异常。通常运用基因本身或临近DNA序列作为探针，进展Southern 杂交，或经过PCR 扩增产物，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。主要适用于知基因异常疾病的诊断。直接

8、基因诊断及实例.直接基因诊断 突变型遗传病的直接基因诊断e.g. 镰形细胞贫血的Gene诊断 .1Southern blot 珠蛋白链基因第6位密码子发生突变 GAGGTG 谷Aa缬Aae.g. 镰形细胞贫血的Gene诊断.知限制酶Mst 1识别序列 CCTNAGG CCTGAGG CCTGTGG突变后不能识别，酶切位点消逝，限制酶切片段长度发生变化。.2) ASO探针诊断 知突变Gene部位和性质，合成寡核苷酸探针，32P标志，进展斑点杂交。 Normal Gene Probe与正常 Probe 杂交稳定 Mutation S Gene Probe与异常 S杂交 稳定 .等位基因特异性寡核苷

9、酸探针ASOAllele-specific-oligonucleotide .斑点杂交结果： / /S S/S 正常探针 突变探针突变型遗传病的直接基因诊断.突变型遗传病的直接基因诊断.BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe 1 地中海贫血的基因诊断基因不同程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。直接基因诊断 缺失型遗传病的直接基因诊断.Southern blot 检测结果： / /- /- - - /- - - - / - - 正常 缺1 缺2 缺3 缺414kb10kb缺失型遗传病的直接基因诊断.2地贫的Gene诊断珠蛋白基因两侧有pst1酶切位点， pst1酶切正常可得

10、到4.4kb片段珠蛋白基因缺失0.7kb片段， pst1酶切那么得到3.7 kb片段为0 缺失型遗传病的直接基因诊断.以Gene为探针，Southern blot 方法检测 /A /0 0/0 4.4kb3.7kb缺失型遗传病的直接基因诊断.3 DMD的基因诊断DMD属XRDMD基因是最大的基因，有79个外显子DMD基因突变主要以缺失为主，可涉及基因的不同部位E1 E2 E3缺失型遗传病的直接基因诊断.病例外显子 1 2 3 4 5 6 7 8Pm34350136476052bp535113缺失型遗传病的直接基因诊断.二间接基因诊断方法及实例 当致病基因虽然知，但其异常性质未知时，或疾病Gen

11、e本身尚未知时，主要经过Gene和DNA多态的连锁分析间接地作出诊断。. 连锁分析基于遗传标志与Gene在染色体上连锁， 经过对受检者及其家系进展连锁分析，分析子代获得某种遗传标志与疾病的关系，间接推断受检子代能否获得带有致病基因的染色体，间接地判别并做出诊断。 遗传标志是基因组中的DNA 多态 如：RFLP，VNTR 等。间接基因诊断.遗传标志相关基因表型分析间接基因诊断.1 Southern blot-RFLP诊断(PKU) PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb 两种等位片段，以PAHcDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。间接基因诊断.患者为19k

12、b片段的纯合子,阐明患者缺陷的PAH基因与19kb片段连锁其父、母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁，其23kb片段与正常PAH基因连锁。II2为23kb 和19kb片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。间接基因诊断.2 成年型多囊肾病的诊断例：成年型多囊肾病APKD，AD ，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。APKDGene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证明APKD Gene与珠蛋白基因3端附近的一段小卫星DNA序列3HVR严密连锁，因此，可以经过连锁分析进展诊断。间接基因诊断.

13、以3HVR为探针，与PvuII酶切后的家系有关成员的基因组DNA进展Southern Blot 基因组DNAPvuII酶切DNA片段变性转膜探针变性杂交结果分析间接基因诊断. 1 2 1 2 3 4 5 5.7kb 3.4kb 2.3kb 间接基因诊断.结果分析 患者I1、II1和II2有3.4kb片段，阐明致病基因与3.4kb片段连锁，并按孟德尔方式遗传。II5不含3.4kb片段，产前诊断正常。间接基因诊断.3 甲型血友病诊断PCRRFLP 甲型血友病的基因诊断：知甲型血友病XR，获得家系成员基因组DNA 。 PCR 142 bp BcLI 142bp 99 bp 43bp 电泳 结果分析p

14、1p2142bp99bp43bpBcl IBcl I -Bcl I +间接基因诊断.间接基因诊断. 142bp99bp1 2123III 1间接基因诊断.结果分析1先症者II 1具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。2II2有142bp/99bp，为杂合子。142bp来自父亲，为正常片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。31为99bp片段 假设是 男性 为患者99bp片段来自母亲；女性为携带者来自父母双方间接基因诊断.单体型分析有时用一种酶和一个探针不能提供可供分析的信息，需采用一种以上的酶结合几个基因探针杂交分析。根据同一条染色体上限制性位点的丧失或获得而出现的一组多态位点所构成的不同

15、片段长度的组合类型进展分析，该分析方法称单体型分析Haplotyping)间接基因诊断. 举例：PKU家系Hind 酶切： 患儿4.2/4.0kb杂合体 父母4.2/4.0kb杂合体 均为杂合体，无法分析。再用sph酶切：患儿 纯合7.0kb 父亲 纯合7.0kb 母亲 9.7kb和7.0kb杂合体间接基因诊断.结 果 1 2 1 2 3 4.2kb 4.0kb 11kb 9.7kb 7.0kb IIIHind Sph 间接基因诊断.分析： 患儿1从母亲和父亲各获得一个7.0kb突变型从Hind 酶切结果看出： 正常同胞3为纯合4.0kb ，也是sph 7.0kb纯合体，故母亲H 4.0kb S 7.0kb 构成单体型，母亲7.0kb为突变型，因此，母亲H 4.0kb S 7.0kb为突变单体型。间接基因诊断.患儿1为H