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文档简介

1、1.1 DNA 重组技术的操作工具一、操作工具(一)限制酶 来源:原核生物 特点:识别双链 DNA分子的某种特定核苷酸序列,并使每一条链中特定的两个核苷酸之间 的磷酸二酯键断裂。结果:产生粘性末端和平末端(二) DNA连接酶 分类:大肠杆菌 DNA连接酶和 T4DNA连接酶 作用于磷酸二酯键(三)运载体 种类:质粒、动植物病毒、噬菌体衍生物运载体要具备的条件:一个或多个限制酶切割位点自我复制能力有标记基因1.2 基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取:1目的基因:符合人们需要的,编码蛋白质的 结构基因 _。2获取目的基因的方法(1)从基因文库中获取目的基因 基因组文库 基因文库cDNA 文库

2、(2)利用 PCR 技术扩增目的基因。PCR:是一项在生物体外复制特定 DNA 片段的核酸合成技术。前提条件:已知目的基因的核苷酸序列。原理: _DNA 复制 _ (3)人工合成法:基因较小,核苷酸序列已知,可以人工合成。二、基因表达载体的构建(1)表达载体的组成:目的基因+启动子+ 终止子+标记基因等。(2)启动子:位于基因的首端,它是RNA聚合酶的结合的部位,驱动基因转录产生mRNA 。(3)终止子:位于基因的尾端,终止转录。(5)标记基因:鉴别受体细胞是否含有目的基因。(6)不同的受体细胞及目的基因导入受体细胞的方法不同,基因表达载体的构建上也会有所差别。三、将目的基因导入受体细胞方法:

3、 1将目的基因导入植物细胞(1)农杆菌转化法 (2)_基因枪法 _ (3)_花粉管通道法 _ 2将目的基因导入动物细胞方法:显微注射 技术。3将目的基因导人微生物细胞方法:用 Ca2+处理细胞。四、目的基因的检测与鉴定(1)检测转基因生物的染色体的 DNA上是否插入了目的基因方法: _DNA分子杂交 _ (2)检测目的基因是否转录出了 mRNA 方法 : _DNA 分子杂交 _ (3)检测目的基因是否翻译成蛋白质的方法: _抗原 - 抗体杂交 _ 1.4 蛋白质工程的崛起1. 基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。2. 蛋白质合成的过程:从预期的蛋白质功能出发,设计预期蛋白质结构,推测

4、应有的氨基酸序列,找到相对应的脱氧核苷酸序列。3. 蛋白质工程可以制造自然界中本没有的蛋白质。2.1 植物细胞工程一. 植物组织培养1 概念:在(无菌)和(人工)控制条件下,将离体的器官、(组织)、(细胞),培养在人工配制的( 培养基)上,给予适宜的培养条件,诱导其产生 ( 愈伤组织)、从芽, 最终形成完整的植株。2 过程(注:表示过程名称;表示培养基名称。)()()外植体 ( ) 幼苗()()过程中主要是细胞的 ( 分裂 );过程中既有 ( 分裂 ),又有(分化)。3原理:(细胞全能性)4培养基(1)形态:( 固体)培养基(2)成分: 1)有机营养成分 2 ) 无机营养成分 3 )激素 4

5、)琼脂(3)培养基中的有机营养物质通常是(蔗糖)。(4)培养基中的无机营养物质包括(水)、( 无机盐)。5植物组织培养中涉及到的激素种类及作用。( 生长素),作用是诱导细胞分裂和(根 )的分化;(细胞分裂素),促进细胞分裂和(芽 )的分化。),使从芽或小植株快速长高。(赤霉素),刺激培养细胞的(伸长6判断题(相关概念的理解)(1)细胞再分化,是指已经分化的细胞失去其特有的结构和功能的过程。(F )( T )(2)在理论上植物的任何一个细胞都具有发育成完整植株的潜力。(T )(3)生物的组织器官的不同,从根本上说是因为细胞中表达出的蛋白质的种类不同。(4)植物细胞培养的结果只能是发育成完整的植株

6、。(F) 二、植物体细胞杂交1概念:将(不同)种的植物体细胞,在一定条件下融合成(杂种细胞),并将其培育成新的植物体的过程。2原理:(细胞全能性)3过程:(1)去除(细胞壁),获得有活力的(原生质体)。方法:(酶解法),需要的酶(纤维素酶)、( 果胶酶)。(2)诱导(原生质体)融合。人工诱导方法: (物理法)、(化学法),常用的化学试剂是( PEG )。融合类型有( 3 )种。(3)(细胞壁再生)。该过程进行时细胞中哪种细胞器比较活跃(高尔基体)。(4)杂种细胞的组织培养。 (过程同植物组织培养。 )三、实际应用1. 植物组织培养技术的优点:1) 快速繁殖 2)保持物种的优良特性2. 在进行作

7、物脱毒是,常常选用的植物的(分生区),如茎尖。3. 所谓人工种子就是以植物组织培养的得到的(胚状体)、( 不定芽)、顶芽和腋芽等材料,经过人工(薄膜)包装得到的种子。4. 单倍体育种的优点: (缩短育种年限)。5. 单倍体育种的过程:植物花粉进行(花药离体培养)长成幼苗,然后用(秋水仙素)处理使染色体加倍,这样便可得到稳定遗传的优良品种。6. 通过植物细胞发酵,可以获得很多种细胞产物,例如(蛋白质)、 ( 香料 )等。2.2 动物细胞工程一、动物细胞培养 1.概念是指从动物机体中取出相关的组织,分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让细胞生长和增殖。组织的选取 选择(幼龄)动物或(胚胎)细

8、胞用(胰蛋白酶)或(胶原蛋白酶)处理组织,将其分散成单个细胞。培养基 从状态上来看, 属于 ( 液体 ) 培养基; 从营养成分上看,属于(合成)培养基。动物细胞培养液中除了一些已知的营养成分外,还需要添加(血清)、(血浆)等天然成分。增殖的方式是(有丝分裂)。动物细胞培养的条件:1) 无毒、无菌环境 2 ) 营养 3)温度和 ph 4)气体环境2. 过程(1)取动物(组织块)(2)剪碎(3)用(胰蛋白酶)处理分散成单个细胞(消化)(4)制成(细胞悬液)(5)转入培养液中进行(原代)培养。(6)当细胞出现(接触抑制),重新消化处理进行(传代 )培养。3. ( 10 )代以内的细胞,维持正常的二倍

9、体核型;( 10-50 )代的细胞,细胞核型可能会发生改变。( 50 代以后)的细胞,少部分细胞获得不死性。目前使用的细胞是(冷冻)保存的(10 代)以内的细胞。4. 动物细胞培养中, CO2的作用是( 维持培养液 PH );定期更换培养液的目的是(排除代谢废物);添加抗生素的目的是(避免染菌)。5. 判断(1)动物细胞培养可以培养出单个个体。( F )(2)动物细胞培养只能得到更多的细胞。( F )二、动物细胞核移植1. 概念将动物的一个细胞的(核),移入一个已经(去除)细胞核的(卵母细胞)中,使其重组并发育成一个新的(胚胎),最终发育成功一个个体。2. 过程(1)取体细胞,进行(动物细胞培

10、养)。(2)取(卵母细胞),在体外培养到(减二中期)时期,然后去核(3)诱导体细胞与去核(卵母细胞)融合,构建重组(胚胎)。诱导方法有(物理法)(化学法)(灭活病毒)。(4)用物理、化学方法激活受体细胞完成分裂和发育。(5)胚胎(移植)(6)诞生克隆动物。三、动物细胞融合1. 概念 将两个或多个细胞,结合成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传特性的单核细胞,称为(杂交细胞)。2. 动物细胞融合常用的诱导方法(物理法)(化学法)(灭活病毒)。四、单克隆抗体1. 概念由单个 B 淋巴细胞经过无性繁殖(克隆),形成基因型相同的细胞群,这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称

11、为单克隆抗体。2. 特点:特异性强、灵敏度高3. 过程:(1)免疫小鼠注射特定的抗原;(2)获取 B 淋巴细胞;(3)从患骨髓瘤的小鼠体内获取骨髓瘤细胞;(4)诱导骨髓瘤细胞和 B 淋巴细胞融合;(4)选择培养基筛选出杂交瘤细胞;(5)筛选出能产生专一抗体的杂交瘤细胞;(6)注射到小鼠腹腔内或体外培养;(7)从小鼠腹水中或培养液中提取抗体。4. 杂交瘤细胞的特点:既能迅速大量繁殖,又能产生专一的抗体。3.1 体内受精和早期胚胎发育一、精子的发生1. 场所: _睾丸的曲细精管 _ 2. 时期:从 _初情期 _开始,直到 _生殖机能衰退 _结束。3. 发生的三个阶段:精原细胞_有丝分裂 _ 第一阶

12、段多个精原细胞染色体复制第二阶段初级精母细胞_ M_ 次级精母细胞_ M精子细胞第三阶段_变形 _ 精子4. 精子细胞的变形过程 细胞核 精子头的主要部分 高尔基体 顶体中心体 精子的尾 线粒体 线粒体鞘 细胞内的其它物质 原生质滴二、卵子的发生1. 场所: _输卵管 _、_卵巢 _ 2. 时期:从 _胚胎出现性别分化 _到生理机能衰退(绝经) 。3. 排卵:指 _卵子 _从_卵泡 _排出。4. 卵泡形成是在 _时期完成的。5发生的三个阶段:卵原细胞有丝分裂 多个卵原细胞 胎儿时期初级卵母细胞 卵泡M 被_细胞包围,形成 _卵泡 _。次级卵母细胞 第一极体M 一般不进行 M _受精过程 _ 完

13、成_合子 _ 受精_ 第 二 极 体_ 退化消失三、受精1. 场所 :_ 输卵管 _ 2. 定义:受精是 _精子 _和_卵子 _,结合形成 _合子 _的过程。3. 受精的实质是:_精核与卵核结合 _ 4. 受精的标志: _在卵黄膜与透明带之间出现两个极体 _ 5. 受精准备包括:_精子获能 _和_卵子的准备 _。6. 当卵子发育到 _减数第二次分裂中期_期时,才具备受精的能力。7. 阻止多精入卵的两道屏障是_透明带反应 _、_卵黄膜封闭作用_ 8. 卵细胞的结构 (1)放射冠透明带(3)卵黄膜细胞核(5)_细胞质 _ 9. 受精过程:(1)精卵相遇,发生 _顶体反应 _,释放 _顶体酶 _,精

14、子穿越 _放射冠 _ 接触 _透明带 _ (2)顶体释放 _顶体酶 _,穿越 _透明带 _,接触 _卵黄膜 _,发生 _透明带反应(3)精子被微绒毛抱合,精子外膜和卵黄膜融合,精子入卵,发生(4)雌雄原核形成。(5)雌雄原核 _融合,这是受精完成的标志。_卵黄膜封闭作用。10. 胚胎发育的过程:受精卵、 _卵裂期 _、_桑椹胚 _、_囊胚 _、_原肠胚 _、幼儿。11胚胎发育的 _囊胚 _时期开始出现细胞分化。3.2 体外受精和早期胚胎培养一、体外受精 1. 卵母细胞的采集和培养(1)用 _促性腺激素 _处理,使其 _超数排卵 _。从输卵管中冲出卵子。(2)从屠宰母畜的卵巢中采集 _卵母细胞

15、_。(3)从_活体动物 _取出卵母细胞, 常用的工具是 _内窥镜 _、_腹腔镜 _、_超声波探测仪 _。(4)(1)方法获得卵母细胞与(2)(3)方法的区别。2. 精子的采集和获能(1)收集精子的方法有 _假阴道法 _、_手握法 _、 _电刺激法 _ (2)精子获能的方法:_培养法 _:获取的精子,放入人工配制的_获能 _溶液中。_化学诱导法 _:用一定浓度的 _肝素 _或_钙离子载体 _处理。三、受精 获能的精子和卵子可以在 _获能溶液 _、 _受精溶液中完成受精。四、胚胎的早期培养 1. 受精卵要移入 _胚胎培养液 _中继续培养。2. 哺乳动物胚胎的培养液成分包括:_有机盐 _、 _无机盐

16、 _、 _营养成分 _、_血清 _。3.3 胚胎工程的应用与前景一、胚胎移植1. 概念 指将雌性动物的早期胚胎,或者通过 (体外受精) 及其他方式得到的胚胎,移植到(同种的)、(生理状态相同)的其他雌性动物体内,使之继续发育为新个体的技术。2. 优势:可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力。3. 生理学基础(1)通过(同期发情处理)可以使供受体动物处于(相同的生理状态)。(2)哺乳动物早期胚胎形成后,在一定时间内不会与母体子宫建立联系,为胚胎的收集提供了可能。(3)受体对移入子宫的外来胚胎,不发生免疫排斥反应,这为胚胎在受体内的存活提供了可能。(4)移入受体的胚胎的遗传特性,在孕育过程中不受任何影响。4. 基本程序(1)对供受体动物的选择和处理供体:选择(遗传性能)和(生产性能)优秀的个体。受体:选择有(健康体质)和正常(繁殖能力)。处理:用激素对供受体母牛进行(同期发情处理)(2)供体用(促性腺激素)处理,使之(超数排卵)(3)配种或人工受精(4)胚胎的收集(冲卵)(5)胚胎检查(桑椹胚或囊胚)(6)胚胎移植(手术法和非手术法)或冷冻保存(7)妊娠检查

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