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1、 引物设计的一般原则 郭大伟引物设计的一般原则1.引物长度 7.发卡结构2.GC% 8.二聚体3.Tm值 9.错配4.3端碱基要求 10.交叉二聚体5.5端碱基要求 11.产物长度6.G 值 12.评分引物长度引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不应大于38。引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较

2、高的模板序列或者使用于产生一些突变位点GC%引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。Tm值Tm DNA溶解温度，即DNA的双链失去一半时的温度。Tm 值计算的经验公式Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 退火温度一般低于Tm，退火温度越高，特异性越高，但杂交率越低。PCR退火温度一般是55，变性温度94， Tm一般在58-70之间比较合适。两个引物之间的Tm值应尽可能接近，不应超过43端碱基要求引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显

3、高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加 3端碱基要求5端碱基要求 5端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。G 值G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G 值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G 值相对较高的引物。引物的3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合）G高于4.5时易引发产生引物二聚体和发夹结构发卡结构Hairpin 一条引物自身碱基之间发生配对二聚体Dimer 同一条引物的两条连之间发生碱基互补配对错配Fals priming 引物与模板的发生配对的位置不止一个。尽管只有某一处可以与引物完全配对吻合，但是其它位置也可与引物之间发生不完全配对，影响延伸。交叉二聚体Cross dimer 两条引物之间发生碱基配对产物长度Prod

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