零流电位法测丝肽素和活性深蓝的作用

1、 PAGE18 / NUMPAGES24 毕业设计（论文）题目：零流电位法研究丝素肽与活性深蓝M-2GE 的相互作用 学院：环境与化学工程学院专业班级：应用化学08级（1）班指导教师：马明明职称：教授学生某：赵飞学号： 40804010107摘 要本文采用零流电位法研究了活性深蓝M-2GE与丝素肽相互作用，计算出两者的结合比、结合常数和结合速率常数。通过不同浓度活性深蓝M-2GE中铅笔电极的变化，按照方程计算出出结合比=1.121，结合常数=1.12106，按照结合速率方程，得到结合速率常数=4.05。关键词：丝素肽，活性深蓝M-2GE，零流电位ABSTRACT This paper main

2、ly studies the bination of activated blue dye M-2GE silk peptide after at a carbon paste electrode behavior change, according to the change of M-2GE concentration, thereby determining the change of the electrode potential. Through the first electrode adsorption silk peptide time optimization, determ

3、ined the reaction time. Then the concentration of M-2GE was optimized, determine the reaction concentration range, and then by cyclic voltammetry, with different concentrations of M-GE under both reaction potential test, find out the silk peptide in different concentration of M-2GE potential and con

4、centration of the linear relationship, and then calculate the adsorption ratio and adsorption constant.KEY WORDS:cyclic voltammetry, silk peptide, reactive blue M-2GE, Zero current potential.目 录 TOC o 1-3 h u 第1章绪论21.1 丝素肽简介21.2活性深蓝M-2GE简介21.3 循环伏安法21.3.1 循环伏安法的概念31.3.2循环伏安法的基本原理31.3.3循环伏安法的应用31.3.4

5、 循环伏安法的用途4第2章实验部分52.1实验材料52.1.1 实验试剂52.1.2 仪器设备52.2 试剂的配制52.2.1丝素肽溶液的配制52.2.2 B-R缓冲溶液的配制62.2.3活性深蓝M-2GE溶液的配制62.2.4 体系溶液的配制62.3 实验方法62.3.1 丝素肽吸附时间的选择62.3.2 M-2GE-丝素肽体系反应时间的选定62.3.3 研究M-2GE浓度与电位的关系7第3章实验结果及讨论83.1 最佳丝素肽吸附时间选择结果83.2 丝素肽与染料活性深蓝M-2GE相互作用83.3研究M-2GE浓度与电位的关系103.4活性深蓝M-2GE与丝素肽相互作用动力学研究12参考文献

6、16致谢18诚信声明19前 言生物大分子如蛋白质和染料等与小分子物质(包括药物分子、染料分子和金属离子及其配合物等)相互作用，是超分子化学和生命科学等领域研究的热门课题，在化学、生命科学及医学领域激起了科学家广泛的兴趣。活性深蓝M-2GE用于棉和胶粘纤维的染色，尤其适用于竭染法，也可用于麻和丝绸的染色,高温稳定性优良，耐酸稳定性好。偶氮类染料是金属离子的灵敏显色剂，其应用于蛋白质的检测较少，研究其与蛋白质的作用成为热点。偶氮类染料大多水溶性好，具有鲜明的颜色，由于其与蛋白质结合力强，结合后伏安特性发生显著变化，灵敏度高，易于检测及抗干扰能力强而备受关注。到目前为止，研究者提出了多种小分子染料和

7、蛋白质的主要结合模型，它们分别适用于不同的情况。Scatchardl4模型假设对于每一种配体，蛋白质上每个结合部位都是一致的，并且相互之间不存在相互作用。Taira5提出了专一性和非专一性模型(S-NS模型)，专一性结合的特点是高亲和性和较小的最大结合数，非专一性结合的特点是低亲和性和不存在最大结合数，两种作用之间不存在协同作用。近年来染料作为探针在蛋白质的测定中日益受到关注6。阳等人采用分光光度法对酸性铬蓝K、荧光黄、偶氮磺III、溴偶氮磺III、3二(羧甲基)氨甲基11，2一二羟基蒽醌、溴酚蓝与蛋白质的相互作用进行了研究。7-11高峰12等研究了灿烂甲酚蓝在阴离子表面活性剂存在下二聚体的荧

8、光性能，以此建立了蛋白质的分析方法。王海人13等人用荧光素建立了BSA的分析方法，结果令人满意。罗宗铭14,15等研究了铬天青S、溴甲酚绿、溴邻苯三酚红、甲基百里酚蓝、酸性品红等与蛋白质的相互作用，建立了测定蛋白质的方法。本文主要研究了文主要研究了活性深蓝M-2GE结合丝素肽后在铅笔芯电极上的伏安行为变化，根据M-2GE浓度的变化，从而测定电极电位的变化，进一步计算出两者的结合比和结合常数。第一章 绪 论1.1丝素肽简介丝肽是蚕丝蛋白的酶水解产物，为可溶性天然纯丝蛋白，含人体必需氨基酸，可被人体所吸收，淡黄色清澈液体或粉剂，分子量3002 000，pH值57。与水、40%乙醇、PVA、PVP、

9、阴离子、阳离子、非离子以及两性表面活性剂均有很好的相溶性。作用与用途: 丝肽分子结构上有许多亲水性基团(如-OH、-COOH、-NH2、NH等)处于分子立体结构的表面，这一结构表明丝肽即天然调湿因子，具很好的保湿作用。有试验表明：在温度27，相对湿度86%RH，吸湿时间12小时条件下，浓度 2.5%的丝肽溶液的吸湿率相当于浓度48%的甘油的吸湿率。即在化妆品加入少量的丝肽溶液即可获得良好的保湿和吸湿性。另有试验表明：丝肽渗透力极强，涂于皮肤10秒钟左右，小分子丝肽就能渗入皮肤角质层，发挥保湿作用，其透过角质层即与皮肤上皮细胞结合，并被细胞作用营养物质吸收，参与和促进细胞代谢，使皮肤光泽、滋润、

10、柔软、富有弹性。分离提取过程：称取备用的蚕茧或蚕丝，计量，将其放人搪瓷反应器中，加入适量去离子水，加热、加碱，并不断调节pH 值，使蚕丝充分水解，然后冷至常温，调其玻美度、脱色、除杂、抽滤、贮存备用。1.2活性深蓝M-2GE简介活性深蓝M-2GE为暗蓝色粉末，分子式C34H22IN10Na5O19S6，分子量1308.81，易溶于水，50时在水中溶解度为80克/升。一般用于棉和胶粘纤维的染色，尤其适用于竭染法，也可用于麻和丝绸的染色。高温稳定性优良，耐酸稳定性好。制备或来源：由对氨基苯磺酸经重氮化，与H酸偶合，然后与2，4-二氨基苯磺酸与三聚和间位酯缩合产物的重氮化物偶合而得。1.3 循环伏安

11、法1.3.1 循环伏安法的概念作为一种电位扫描技术，循环伏安法16的应用越来越广泛。由于其电化学谱可以直观方便的测得，方便于研究各种机理的动力学参数，所以当人们首次研究一个体系的时候，循环伏安法是较为有效的一种研究手段。循环伏安法是线性扫描的一种，即在停止电位扫描前，用已知扫描速率v，扫描电极电位，并限制其在起始电位E1和终止电位E2之间。循环伏安实验在三电极电解池里进行，本实验中以碳糊电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极组成三电极体系。当外加电压作用于工作电极上，在正向扫描过程中出现一个氧化反应峰，在反向扫描过程中出现还原反应峰，电压完成一次循环扫描，将记录下电流与电压E

12、的对应关系，即为循环伏安曲线(cv曲线)。当使用循环伏安法研究一个体系时，为了对这个体系进行摸索，通常由定性实验开始，然后进行半定量和定量研究，并进而计算出动力学参数。在一个典型的定性研究中，通常在一个较宽的扫描X围内记录相应的伏安曲线。一般将会出现几个峰，借助观察电极电位变化时这些峰的出现和消失情况，记录第一次循环和后继循环之间的差别，就有可能测定出由这些峰表示的有关反应过程。同时，扫描速率和峰值的关系可以鉴别吸附、扩散和偶合均相反应等作用。1.3.2 循环伏安法的基本原理如以等腰三角形的脉冲电压加在工作电极上，得到的电流电压曲线包括两个分支，如果前半部分电位向阴极方向扫描，电活性物质在电极

13、上还原，产生还原波，那么后半部分电位向阳极方向扫描时，还原产物又会重新在电极上氧化，产生氧化波。因此一次三角波扫描，完成一个还原和氧化过程的循环，故该法称为循环伏安法，其电流 电压曲线称为循环伏安图。如果电活性物质可逆性差，则氧化波与还原波的高度就不同，对称性也较差。循环伏安法中电压扫描速度可从每秒钟数毫伏到1伏。工作电极可用悬汞电极，或铂、玻碳、石墨等固体电极，本实验所用电极为碳糊电极。1.3.3 循环伏安法的应用循环伏安法是一种很有用的电化学研究方法，可用于电极反应的性质、机理和电极过程动力学参数的研究。但该法很少用于定量分析。（1）电极可逆性的判断循环伏安法中电压的扫描过程包括阴极与阳极

14、两个方向，因此从所得的循环伏安法图的氧化波和还原波的峰高和对称性中可判断电活性物质在电极表面反应的可逆程度。若反应是可逆的，则曲线上下对称，若反应不可逆，则曲线上下不对称。电极反应机理的判断循环伏安法还可研究电极吸附现象、电化学反应产物、电化学化学耦联反应等,对于有机物、金属有机化合物及生物物质的氧化还原机理研究很有用。1.3.4 循环伏安法的用途（1）判断电极表面微观反应过程（2）判断电极反应的可逆性（3）作为无机制备反应“摸条件”的手段（4）为有机合成“摸条件” （5）前置化学反应（CE）的循环伏安特征（6）后置化学反应（EC）的循环伏安特征（7）催化反应的循环伏安特征第二章 实验部分2.

15、1实验材料2.1.1 实验试剂盐酸纯度：36.46%某市科龙化工试剂厂磷酸纯度：97.99 %某市化学试剂六厂硼酸纯度：61.83 %某化学试剂厂氢氧化钠 分子量：40.00 某市西陇化工厂丝素肽 分子量：3002 000 诺维信试剂某活性深蓝M-2GE 分子量：1308.81 某申新化工试剂厂碳粉 分子量：12.01 某市博迪化工某硅油 分子量：13700 某市红岩化学试剂厂2.1.2 仪器设备电化学分析仪 型号：H 某辰华仪器某甘汞电极 型号：232 某罗素科技某铂电极 型号：CHI129 某江东精密仪器某 电子天平 型号：FA1204B 某精密科学仪器容量瓶：100mL, 200mL,

16、250mL 某玻璃厂移液管：1mL，2mL，5mL,10mL 某玻璃厂烧杯：10mL，100mL 某玻璃厂比色管：20mL 某玻璃厂2.2 试剂的配制2.2.1丝素肽溶液的配制用分析天平称取0.5g丝素肽，溶解后放入200mL容量瓶中定容，丝素肽基础液的浓度为2.5g/L。2.2.2 B-R缓冲溶液的配制称取3.92g磷酸，2.40g乙酸和2.47g 硼酸于1000mL容量瓶中，加蒸馏水定容，得1/25 mol/L混酸1000mL。用分析天平称取8.0gNaOH，在烧杯中溶解后移入1000mL容量瓶中，加蒸馏水定容，得0.2mol/LNaOH溶液1000mL。2.2.3活性深蓝M-2GE溶液的

17、配制用分析天平称取0.0605g活性深蓝M-2GE，在烧杯中溶解后移入1L容量瓶中，加蒸馏水定容，得1e-4mol/L的活性深蓝M-2GE的储备溶液。2.2.4 体系溶液的配制丝素肽溶液：从储备液中取5.2ml丝素肽溶液，加入50ml容量瓶中，然后加蒸馏水至50ml刻度处，摇匀，得到0.25g/L丝素肽溶液。活性深蓝M-2GE：分别移取0.5mL,1mL, 2mL, 3mL, 4mL, 5mL, 6mL, 7mL的活性深蓝M-2GE储备液加入8支50mL容量瓶中，加蒸馏水至50mL刻度线，摇匀，使容量瓶中溶液的浓度分别为1e-6mol/L，2e-6mol/L，4e-6mol/L，6e-6mol

18、/L，8e-6mol/L，10e-6mol/L，12e-6mol/L，14e-6mol/L。BR缓冲溶液的配制：移取100mL混酸储备液和45mL氢氧化钠储备液加入200mL容量瓶中，摇匀。2.3 实验方法2.3.1 丝素肽吸附时间的选择将裸铅笔芯电极浸泡在含丝素肽0.26g/L的BR缓冲液中，经过不同时间后，记录下Ezcp。不同浸泡时间的电极与M-2GE溶液进行反应，通过对分析对比选出浸泡时间比较理想的一组。2.3.2 M-2GE-丝素肽体系反应时间的选定将丝素肽/铅笔芯电极浸入含有一定浓度的M-2GE的BR(pH6.37)缓冲液中，以一定时间间隔扫描电位,等到电位稳定后记录时间，选取该时间

19、为M-2GE-丝素肽体系的最佳反应时间。2.3.3 研究M-2GE浓度与电位的关系将丝素肽/铅笔芯电极分别浸入不同浓度的活性深蓝M-2GE（1.010-6 1.210-5mol/L）溶液中，以上面选取的最佳反应时间为基础，进行零流电位的测量，通过测量出来的数据求得线性方程，并计算结合比和结合常数。2.3.4 活性深蓝M-2GE与丝素肽相互作用动力学研究任取M-2GE反应X围内的一组浓度，与丝素肽/铅笔芯电极进行反应，每隔一段时间对电位进行记录，对记录的数据进行处理得出线性关系图，并计算线性关系，从而求得结合速率。第三章 实验结果及讨论3.1 最佳丝素肽吸附时间选择结果将裸铅笔芯电极浸泡在含丝素

20、肽0.26g/L的BR缓冲液中，经过不同时间后，记录下Ezcp，作Ezcp-t（时间）曲线如图1所示，由图知，在前45分钟，Ezcp值增大很快，丝素肽附着前期，电位变化很灵敏，180min后，零流电位为0.1422V稳定不变；选取8只浸泡不同时间（7min，15nim，25min，35min，1h，3h，15h，24h）的电极；实验发现，浸泡时间（7min，15min，25min）较短时，膜太薄或太短，电极只在很小染料M-2GE浓度X围有电位响应，浸泡1h，3h，15h，24h时，丝素肽附着较长，但电极对不同浓度的M-2GE电位响应间距很小，综上所述，丝素肽附着时间定为35min。图1.丝素肽

21、吸附时间/电位图3.2 丝素肽与染料活性深蓝M-2GE相互作用 将丝素肽/铅笔芯电极浸入含有4.010-6mol/LM-2GE的BR(pH6.37)缓冲液中，以一定时间间隔扫描电位，记录CV曲线和电位迭加图如图2所示，图2.电位迭加图通过上图可以看到铅笔芯电极在吸附丝素肽后，和铅笔-丝素肽电极放入M-2GE溶液中后有明显的电位变化，说明反应的存在。从结果来看，在0240s内，随着浸泡时间的延长，零流电位Ezcp逐渐从0.1405V负移到0.1226V。零流电位Ezcp和浸入时间t呈线性关系（如图3），线性方程为Ezcp/V=0.1461-1.5110-4t/s(r=0.9937,n=7)。在1

22、60s后，零流电位Ezcp不会随浸泡时间的延长而移动，定为0.1226V，说明丝素肽与深蓝M-2GE反应完全。图3.丝素肽与活性深蓝M-2GE时间/电位图3.3研究M-2GE浓度与电位的关系将丝素肽/铅笔芯电极分别浸入不同浓度的活性深蓝M-2GE（1.010-6 1.210-5mol/L）溶液中，160s后在丝素肽/铅笔芯电极上施加线性电位Ezpp，记录到的I-Eapp曲线如图4所示，可知，随着M-2GE浓度的增加，从曲线看出，零流电位Ezcp逐渐从-0.0231V正移到0.0099V。由于随M-2GE浓度的逐渐增加，在相同时间内更多的M-2GE与铅笔芯电极上丝素肽分子结合，引起界面电位变化越

23、大，零流电位Ezcp移动也变大。图4.丝素肽-M-2GE电位迭加图a浓度为1.010-6mol/L，b浓度为2.010-6mol/L，c浓度为4.010-6mol/L，d浓度为,6.010-6mol/L，e浓度为8.010-6mol/L，f浓度为1.010-5mol/L。图5.logM-2GE与电位图因丝素肽/铅笔芯电极是浸泡M-2GE溶液240s后，再施加线性电位扫描，可知，丝素肽先与M-2GE结合（式1）： （1） 当施加线性扫描电位后，而膜上逆反应（式2）： （2）所以加上电位后，界面电位用能斯特方程来表示（式3）： （3） 式（3）中，K为包括sp/铅笔芯电极的标准电极电位等参数的常数

24、；sp-(M-2GE)x为丝素肽与M-2GE反应后结合物的浓度，sp为游离丝素肽浓度，n是电极反应的得失电子数。 丝素肽(sp)与M-2GE结合成sp-(M-2GE)x （4）式中，x为结合比，结合常数。 （5）式中，-界面电位，-参比电极，Ezcp-零流电位。将式（3）和式（4）代入式（5）中，可得 （6）其中，等于丝素肽/铅笔芯电极在BR（pH6.37）缓冲液中的Ezcp=-0.0026V。在活性深蓝M-2GE浓度为1.010-6 1.210-5mol/LX围内，零流电位Ezcp与logM-2GE呈线性关系，如上图5，线性方程为：Ezcp=0.1752+0.0331 logM-2GE（R=

25、0.997，n=6）。将线性方程与式（6）比较可知，=0.0331，=0.1752，其中K为室温295K，n=1（查文献25得）计算得结合比=1.121，结合常数=1.12106 。3.4活性深蓝M-2GE与丝素肽相互作用动力学研究当活性深蓝M-2GE与丝素肽生成，式如下假设活性深蓝M-2GE与丝素肽作用过程为一级反应，其反应速率可表示： 式（7）式（7）中，为在t时刻与丝素肽反应的活性深蓝M-2GE的分子数，为可以与丝素肽反应的活性深蓝M-2GE分子总数，为溶液中活性深蓝M-2GE的初始浓度，为正向反应速率常数，可认为M-2GE与丝素肽作用的完全程度，用表示，（7）式可变为 （8）积分可得，

26、反应完全程度与任意反应时间的关系 （9）因为，在0160s内，零流电位Ezcp与反应时间t呈线性关系，线性方程为：Ezcp/V=0.1461-1.5110-4t/s(r=0.9937,n=7)。没有反应即t=0时，零流电位。完全反应t=160s时，零流电位。反应过程中任意时刻的反应完全程度可用简单的内插法进行计算，即： （10）式（10）代入式（9）得 （11）以为纵坐标，为横坐标，作图6如下，线性方程为 （R=0.992，n=5），所以，=0.0162，其中=4.0mol/L,得=4.05，所以丝素肽与活性深蓝M-2GE结合反应的结合速率常数=4.05。图6.动力学方程图第四章 结论本实验说

27、明丝素肽与活性深蓝M-2GE之间是有反应存在的。2.本实验说明丝素肽在铅笔芯电极上的最佳吸附时间为35min。3.本实验说明丝素肽与活性深蓝M-2GE反应达到稳定的时间是160s。4.本实验说明计算得结合比=1.121，结合常数=1.121065.本实验说明丝素肽与活性深蓝M-2GE结合反应的结合速率常数=4.05。参考文献1郭霞贝加因-恩替卡韦和三苯氧胺与蛋白质DNA相互作用的电化学研究,西北大学，20092 RBianchini，CPinzino，MZandomeneghiInteraction ofa reactive dye with serum albumins and with a

28、minoacids：the dyes as a chiral labelJDyes and pigments2002，55：59683 KZhu，SYTongA study 011 the reaction of Acidic Chrome Blue with proteinJActa chimicasinica,l 996，54：6206244 KZhu，SYTongA study 0n the reaction between Fluorescein and proteinJChemical J of Chinese university，1 996，1 7(4)：5395425 KZhu

29、，SYTongA study on the reaction of sulfonazo IIIBromo sulfonazo 111 with bovine serum albuminJChin J AnalChem，1996，24(1 1)：126312686 江壤华，庄稼，董发勤，耿伟，李克安，童某3一二(羧甲基)氨甲基1，2一二羟基总醌与蛋白质作用的研究J化学学报，2000，58(1)：82857 YJWei，KALi，SYTongThe interaction of Bromophenol Blue with proteins in acidic solutionJTalanta 19

30、96，43：1108 MGao，CQZhu，LYWang，LWangThe interaction of brilliant Cresyl blue with surfacant and its application in the determination of proteinJChin J AnalChem，2002，30(3)：3243269 K.A. Howell, E.P. Achterberg, C.B. Braungardt, A.D. Tappin, P.J.Worsfold, D.R. Turner, Voltammetric in situ measurements of

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