分离方法-第7章-色层分离法课件

1、第六章 色层分离法6.1 概 述6.2 柱层析6.3 纸层析6.4 薄层层析色层分离法又称层析法或色谱分离法，它的最大特点是分离效率高，能把各种性质及相近的物质彼此分离。现代的色谱分离技术就是在此基础上发展而来的。色层分离最早是由波兰植物学家M茨维特系统的提出来的。他在叶绿素的石油醚溶液流经装有碳酸钙的管柱时，发现碳酸钙对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，于是在管柱中出现了不同颜色的色谱带，因此称这种分离方法为色层分离法或色谱分离法。6.1 概 述层析法的发展史年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906 Tswett 用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念 1931 Kuhn, Lede

2、rer 用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素。使色谱法开始为人们所重视。1938Taylor Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素。 1941 Martin, Synge 提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）。1952Martin,James 从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法。 1956Van Deemter提出色谱速率理论，并应用于气相色谱。1957基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世。 1958Golay发明毛细管柱气相色谱。1965Giddings 发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础。 1975 Small发明了以

3、离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法。1981 Jorgenson创立了毛细管电泳法。6.1 概 述目前层析法已广泛应用于许多领域，成为十分重要的分离分析手段。层析分离由两相组成：一个是固定相固定不动的一相一个是流动相即携带样品流过固定相的流动体。“层析的本质是使一种液体均匀地渗过一个相当细碎的物质的柱体，这些物质通过某种过程有选择地阻留了液体内的某些组分。” 马丁（A. J. P. Martin）（英）层析分离图示 二、构成层析法的条件 色层法应具备的因素或条件是： 1. 具有两相 2. 混合物中各组分的物理化学性质有差异 3. 多次冲洗或展开三、层析法的

4、分类根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类凝胶过滤法分配层析法离子交换色层分离法吸附层析法疏水作用色层分离法金属螯合色层分离法共价作用色层分离法 根据操作技术的分类低压层析技术中压层析技术高压层析技术电泳法操作压力在0.5MPa-5MPa之间操作压力在5Mpa-40MPa之间操作压力小于0.5MPa靠溶质分子在电场中的移动速度 不同而分离 根据固定相的形状不同的分类： 柱层析法纸层析法薄层层析法 根据流动相的物态不同的分类 气相层析法液相层析法气-液层析法气-固层析法液-液层析法液-固层析法 操作方式（展开方式）不同的分类：迎头法顶替法洗脱分析法气相色谱仪的流程I -载气系统; II -

5、进样系统; III-色谱柱和柱箱; IV-检测系统; V -记录系统液相色谱仪的流程各种层析法的机理及优缺点 类型机理优点缺点适用范围吸附层析化学、物理吸附操作简便易受离子干扰各种生物大分子的分离、脱色和去热源凝胶过滤分子筛的排阻效应分辨力高，不会引起变性各种凝胶介质昂贵，处理量有限制分子量有明显差别的可溶性生物大分子分配色谱溶质在固定相和流动相中分配系数的差异分辨力高，重复性较好，能分离微量物质影响因子多，上样量太小用于各种生物大分子的分析鉴定亲和色谱亲和色谱生物大分子与配体之间有特殊亲和力分辨力很高 一种配体只能用于一种生物大分子，局限性大各种生物大分子聚焦色谱等电点和离子交换作用分辨力高

6、进口试剂昂贵蛋白质和酶6.2 柱层析一、吸附柱层析二、分配柱层析柱层析分离法图示柱层析分离的基本原理柱层析分离的基本原理示意图t1t0t1t2t0t0t3t1t2t0分子量： 6.2 柱层析一、吸附柱层析 1. 原理 吸附柱层析是利用吸附剂对混合试样各组分的吸附力不同而使各组分分离。 吸附剂一般是多孔性的微粒状物质，在其表面具有许多吸附中心（或称吸附位置），吸附中心的数量多少以及吸附能力强弱直接影响其吸附性能。四、层析法的基本概念（1）分配系数 溶质在固定相与流动相浓度比值。（2）解离常数 有效结合位子浓度与溶质在液相的浓度乘积与 溶质在固相中的浓度比值。（3）分离因数 某一瞬间被吸附溶质量占

7、总量的分数。（4）阻滞因子 分配层析溶质移动速度（距离）与流动相移动 速度（距离）比值。（5）洗脱（容积）溶出体积 在柱色层分离中，使溶质从柱中流 出时所通过的流动相体积。（6）分辨率 两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比（7）理论塔板 流动相与固定相平均浓度达传质 平衡时的一段柱高。（8）溶量因子 固定相中溶质总量与流动相中溶质总量之比。分配系数在一定的温度下，溶质在两液相之间的平衡关系服从分配定律： Kd = C1/C2 K d为分配系数 C1，C2为两液相中的溶质浓度。应用条件：温度一定 低浓度解离常数 和 分离因数）mt-结合溶质分子的有效位子总浓度m-空余的有效结合位子浓度q-溶质在固

8、相的浓度c-溶质在液相的浓度解离常数分离因数恒定缓冲液条件下，色层分离的拖尾现象 Rf = 阻滞因数(比移值)Am流动相的平均截面积As-固定相的平均截面积流动相的移动距离 V/Am洗脱容积Ve：在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动相的体积。理论塔板fr第r块塔板上溶质的质量分数为：r n E/(E+1)时 r max n E/(E+1) 最大浓度塔板r max n E/(E+1) E=N越大，加入的溶剂越多，展开的时间越长色带下移高峰浓度减少、色带扩大。一、吸附柱层析当溶质A随着流动相缓缓流过层析柱时，溶质A在两相中不断的进行吸附、脱附、再吸附、再脱附过程。其中，吸附力较强的组分，

9、移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。 6.2 柱层析一、吸附柱层析吸附剂表面具有吸附能力不同的吸附中心，溶质在其上的分配系数是不同的。吸附能力强的吸附中心，溶质在其上的分配系数KD较大，溶质分子将首先占据它们，其次再占据较弱的、弱的和最弱的吸附中心。随着溶质在吸附中心上的浓度增加，强吸附中心逐渐被饱和，其分配系数也渐变小。一、吸附柱层析试样中各种组分的分配系数往往有差异，分配系数较大的组分，在柱中被吸附得较牢，在固定相中保留的时间较长，不易被洗脱下来；而分配系数较小的组分被吸附得较不牢，在固定相中保留的时间较短，最先被洗脱下来。一、吸附柱层析2、吸附等温线 (1) 吸

10、附：是指物质在吸附剂表面上集中浓缩的现象。 (2) 吸附等温线：某种组分在吸附剂表面的吸附规律。包括：线形和非线性。I）线性吸附等温线Cm：溶质A在流动相中的浓度Cs：溶质A在固定相中的浓度当溶质A在随流动相缓慢流过层析柱的固定相时，在两相中不断吸附，脱附达到平衡 Cm Cs （吸附平衡） KD= Cs/Cm Cs 固定相Cm 流动相若测定流出液中A的浓度，绘制CV的曲线，则得到洗脱曲线（又叫洗提曲线）。为一对称的层析图谱 。CVII）非线性吸附等温线 Langmuir等温线 反Langmuir等温线由于吸附剂表面上具有吸附能力强弱不同的吸附中心，溶质在其上分配系数KD不同。吸附力强的溶液，溶

11、质在其上分配系数大，反之则相反。因此随着强吸附中心被饱和KD 逐渐变小，曲线向下变曲，洗脱时弱的和较弱的先洗脱下来，吸附强的后洗下流出，出现拖尾峰 Cs 固定相Cm 流动相Cs 固定相Cm 流动相试样中各组分分配系数有差异。利用各组分在固定相上吸附能力的差异，即保留特性的差异把它们分开。保留特性 保留时间 保留体积 3. 吸附剂的选择 吸附剂应具有合适的吸附力。 颗粒均匀、大小适宜。 吸附与解吸可逆。 不含杂质。 不溶于所使用的溶剂（即洗脱剂），与欲分离的物质不发生化学反应。 常用吸附柱介质的分类无机物吸附介质包括：氧化铝、硅胶、活性炭、膨润土、磷酸钙(凝胶型和晶型)、氧化钛和氢氧化锌凝胶等。

12、聚合物吸附介质有：琼脂糖、葡聚糖、纤维素和聚丙烯酰胺等（1）Al2O3（中性、酸性、碱性）I）分类中性：适用于醛，酮，醌，酯，内酯及苷的分离酸性：酸性化合物如酸性色素，氨基酸等碱性：生物碱，醇及其它中性和碱性物质一般地，能用酸性或碱性Al2O3分离的也能用中性Al2O3分离II）活性 活度级I级增强 吸附能力 I 减弱 在不同的温度下活化氧化铝： 加热至 100150 活化有一定活性 150 III级 300400 IVVI 600 脱水开始烧结每一批Al2O3表面积和表面孔结构不一致，活性不同一般，分离极性较强的组分用活性弱的吸附剂；分离弱极性的组分用活性强的吸附剂。（2）硅胶弹性多聚硅酸脱

13、水制的 硅氧烷不具吸附性表面孔穴较小的硅酸吸附能较强用途：微酸性，吸附能力较Al2O3 弱，可分离酸性和中性物质，如有机酸，氨基酸，萜类，甾（胆固醇及激素属于甾类化合物）类弹性多聚硅酸脱水 OHOH SiOSi SiOH SiSi 硅氧烷 游离型硅酸醛 束缚型 活泼型 硅酸醛 硅酸醛 a b c d（3）聚酰胺乙内酰胺聚合：聚己内酰胺，锦纶可与酚类，酸类，醌类，硝类化合物形成氢键而分离。形成氢键基团的吸附能力大对、间位形成氢键邻位（空间位阻）芳香族由于共轭吸附能力大由海洋生物琼脂提取得到的主要成分 中性不带电水溶性线状多糖高亲水性，含大量羟基能制成多孔性凝胶，分离大分子制备： 去除带电琼胶成分

14、 将溶化的琼脂糖采用悬浮,乳化或喷珠的方法制 得珠状介质。 采用交联剂增加介质的机械强度（4）琼脂糖（5）葡聚糖 -1,6 相连的葡萄糖聚合物，由环氧氯丙烷交联得到珠粒性质：（1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多）（2）化学稳定性及热稳定性好（3）孔度与机械强度与交联度有关（4）用于凝胶过滤分子筛应用：水溶液中分离蛋白质等（6）纤维素-1,4 相连的D-葡萄糖（偶而有1，6 键合）线性天然高聚物（1）亲水（2）微晶与无定型两部分组成，缺乏孔度大孔珠状纤维素（1）高孔度（2）高机械强度（3 ) 亲水性强 应用：离子交换分离蛋白质介质性质： （1）丙烯酰胺与交联剂N, N-甲叉双丙烯酰 胺共聚（2）烷烃

15、骨架与酰胺侧链（3）控制交联剂比例可控制网格孔度（4）亲水好，但不如多糖介质 (5) 机械强度差应用：（1）凝胶过滤 （2） 电泳介质（7）聚丙烯酰胺4、流动相及其选择(1)洗脱过程实质：流动相分子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。强极性组分选强极性的流动性洗脱，反之相反。 (2)功能团极性： 有机分子基本母核相同时，取代基极性增强，整个分子极性增强；极性基团增多，整个分子极性增强。分子中双键多，吸附力强；共轭双键多，吸附力强。分子形成内氢键，吸附力弱于不能形成内氢键的化合物。 烷烃（CH3 ，CH2 ）烯烃（CH= CH）醚类（OCH3，OCH2）硝基化合物（NO2）二甲胺

16、酯类（COOR）酮类（ C=O）醛类（CHO） 硫醇（SH）胺类（NH2） 酰胺 醇类（OH）酚类（ArOH）羧酸类（COOH）（3）常用流动相极性： 石油醚环己烷二硫化碳CCl4三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯乙酸甲酯丙酮正丙醇乙醇甲醇吡啶酸在某些情况下可用混合流动相聚酰胺柱层析可采用水溶液：乙醇水溶液，丙酮水溶液等溶解试样用的溶剂极性应与流动相相近 5. 洗脱方法及流出曲线 有色物质分离的洗脱方法 推出法：有色物质分离后，将吸附剂从柱中推出，用刀按层切开，分层洗脱再定量。 无色物质分离的洗脱方法及流出曲线 无色物质分层后，可采用流出曲线加以判断。 流出曲线：以物质浓度为纵座标，以收集

17、的洗脱液体积为横座标，得出的曲线。 洗脱方式： 柱层析中按洗脱剂的不同可分为以下三种： 设样品中含有A、B两组分，前者吸附力弱，即样品与固定相吸附力A0.05.(3). pH:影响它们的存在状态(4). 滤纸:质地均一、厚薄适当、具有一定机械强度、不含杂质3. 影响Rf的因素(5). 温度:在层析缸中用红外灯照射。温度会影响溶质的分配系数及流动相的扩散速度。层析操作应在恒温下进行，温度不超过 0.5oC(6). 展开方式:展开方式不同,Rf也不同。下行法的Rf最大，上行法的Rf较小，环行法的 Rf也不大。3. 影响Rf的因素操作技术(1).载体 (滤纸)滤纸的选择 a. 要求滤纸质地均匀、平整

18、无折痕边缘整齐 b. 要求滤纸的纤维松紧适宜 c. 滤纸的杂质含量少6.3 纸色谱层析滤纸的性能与规格型号杯重G /m2厚度(mm)吸水性( 30min内水上升mm)灰分G /m2性能1900.17150 1200.08快速2900.17120 900.08中速3900.1590 600.08慢速41800,34151 1210.08快速51800.32120 910.08中速61800.3090 600.08慢速滤纸的处理 以0.1 0.4 mol/L HCl (或 2 mol/L HAc)浸泡数小时, 除去无机杂质后, 取出用蒸馏水洗净, 再将滤纸放在丙酮-乙醇( 1 : 1 )中浸泡一周

19、时间, 除去有机杂质, 再取出风干备用。操作技术6.3 纸色谱 （2）固定相 纸层析以吸着在纤维素上的水作固定相。反相纸层析用甲酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇等作固定相。若分离芳香油等非极性物，以石蜡油、硅油作固定相。 (3). 试样 A. 试样的溶解 尽量避免用水。一般用乙醇、丙酮、氯仿等，最好采用与展开剂极性相似的溶剂。液体样可直接点样。操作技术点样方法a 先用铅笔在距纸条一端2 3 cm处划一条直线（起始线）并在线上隔一定距离划一“x”号表示点样位置；见下示意图：b 点样工具：微量注射器、毛细滴管（0.5 mm) ；c.点样方法：用点样工具吸取试液轻轻与“x”号接触，使点样的斑点直径为0.2

20、 0.5 cm, 每次点样2 20 m于滤纸上，以冷风吹干；d. 干后，将纸的两边用线缝好，以圆筒形式置于层析缸中展开。点样方法C. 展开 展开剂的选择欲分离物在两相中的溶解度；展开剂的极性展开剂与欲分离物间应无化学反应欲分离物在展开剂中的分配系数最好不受温度的影响欲分离物在两相间的分配平衡瞬间达到b. 常用的展开剂水、饱和的正丁醇、正戊醇、酚、四氯化碳、氯仿、苯、丁酮、丙酮、有机酸、有机碱，有时也加入一定比例的无机酸、无机碱、甲醇、乙醇等。c.展层方法展层前，层析缸与已点样滤纸必须预先经水蒸汽、溶剂蒸气饱和。方法：将溶剂和水置于分液漏斗中充分振荡，分层后，将水层放入小烧杯内，置于层析缸中平衡

21、一段时间，使滤纸吸饱蒸汽，然后移去小烧杯，将溶剂倒入溶剂槽中，立即将点好样的滤纸的一端浸入溶剂槽内展层。上行展开法将点有试样的滤纸条的下端浸入溶剂（但不能浸没点样处）上端固定在层析缸的上部，保持垂直，将缸密闭，使溶剂沿下端上升而展层。待溶液上升到距离纸上端3 4 cm 时，将滤纸取出，用铅笔在溶剂前沿处画线作记号（见右图）对于 Rf 十分接近的物质可采取连续挥发的色谱法。纸条的上端暴露在层析缸外，以便令上升的溶剂挥发；只要保持纸条下端与溶剂面接触，溶剂便能不断地上升而挥发，展层过程就自动连续地进行；若溶剂沸点100oC，则可在纸条暴露部分用红外灯烘烤，促使溶剂挥发； 该法不能测量前沿，但可达分

22、离的目的。玻片玻璃棒原点玻皿剪成锯齿状，便于溶剂滴下b. 下行展开法 溶剂自纸的上端向下降（借助于重力的作用），具有分离速度快及连续挥发色谱的优点。C . 环行法 又叫径向色谱法。这是一种既快又方便的方法。取一张圆形滤纸在直径的两边各画两根平行线，用剪刀沿这两根线剪至圆心处，在纸的中央滴上试液，干后，将滤纸夹在两个大小相同培养皿之间，使剪开的纸条的尾端浸入流动相。d. 双向展开法有时用一种溶剂不能将样品中组份分开时，可以试用双向展开法。该法是用正方形或长方形滤纸，在纸的一角上点样，先用一种展开剂朝一个方向展开，展开完毕，待溶剂挥发后，再用另一种展开剂朝与原来垂直的方向进行第二次展层。若前后二次

23、展开剂选择适当，可使各种组份完全分离。例如，氨基酸的分离可用此法。双向展开法也可以二次使用同一种展开剂展层。D. 显色展层后，将滤纸从层析缸中取出，用铅笔在溶剂前沿作记号a. 有色物：直接观察各个色斑无色物：物理法显色：用紫外灯照，观察有无吸收或发出各种不同颜色的荧光斑点，并用铅笔画下斑点的位置及大小。. 分析定性分析：实验条件，各物质有各自的Rf。为了查明未知物的组成，最好是在同样条件下与已知的纯物质做对照实验。化学法显色：利用各种物质的特性反应，喷洒适当的显色剂，若被分离的物质含有羧酸，可喷酸碱指示剂溴甲酚绿，当斑点呈黄色，说明羧酸确实存在；若被分离的物质含有氨基酸，则可喷茚三酮，多数氨基

24、酸呈紫色，个别氨基酸呈黄色。其它化合物所用显色剂可从手册里查阅。xyRf 的计算:Rf = x / yx1x2yRf 的计算:Rf 1= x1 / yRf2 = x2 / y这样每一个斑点用两个Rf 来描述定量分析剪洗法：将斑点剪下，用适当的溶剂洗脱，然后用各种仪器方法（如红外、紫外、原子吸收、发射光谱），也可将斑点剪下灰化，再用适当的溶剂溶解，测之。比较法：经纸色谱将各种组份分开后，可在相同条件下，制得标准系列图谱，与待测斑点颜色、面积进行比较，确定其可能的含量。反射散射光谱法： 物质受光照射时，通常发生两种不同的反射现象（即镜面反射与散射）。镜面反射同镜子反射一样，光线不被物质吸收，反射角

25、等于入射角；散射则必须满足Kubelka-Munk 方程式：其中，R = IR / I0，I0、IR分别为入射光与散射光强度，S 为反射系数， K为线性吸收系数， 为被测物的摩尔吸光系数，C为被测物的物质的量浓度，K = /S。仪器上显示的反射散射吸收值为AR = lg I0 / IR = lg 1 / R 由上可建立方程组： （2）式代入（1）式，得：（3）式即为反射散射吸收光谱测量值F与C的定量关系；若以F为纵坐标、C为横坐标，则可得一截踞为2的直线，斜率为K。图1. 反射散射附件的光路示意图M: 反射镜; S: 样品: PC: 光电管 1234sMPCM1长颈漏斗， 2滤纸，3垫板， 4

26、抽滤瓶 F. 应用例氨基酸的分离（固定相为水）流动相分离情况 正丁醇：2 mol/L HAc = 1 : 1酪氨酸、二碘酪氨酸用水饱和的苄醇亮氨酸、异亮氨酸叔丁醇：甲乙酮：甲酸：水16 : 16 : 0.1 : 3.9亮氨酸、异亮氨酸流动相分离情况丁醇：醋酸：水32 : 2 :22甲状腺素、二碘酪氨酸流动相：丁醇：HAc :H2O = 4 : 1 :5流动相：M甲酚酚：pH = 9.33硼酸缓冲液 = 1 : 1亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、苏氨酸、门冬氨酸、谷氨酰酸、门冬酰氨、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、胱氨酸等例2. 糖的分离(固定相为水

27、)流动相分离情况醋酸乙脂:吡啶:水= 2 : 1 : 1木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖丁醇:吡啶:水= 45 : 25 : 40乳糖、半乳糖、葡萄糖丁醇:乙醇:水: NH3 = 40 : 10 : 49 : 1尿中葡萄糖丁醇:乙醇:水= 10 : 1 : 2蜜二糖、果糖、葡萄糖、流动相分离情况流动相：酚流动相：丁醇:醋酸:水= 1 : 1 : 1鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、半乳糖醛酸丁醇:乙醇:水= 4 : 1 : 5低聚糖75% 2丙醇：醋酸9 : 1直链淀粉丁醇:吡啶:水：苯= 50 : 30 : 3 : 45棉子糖例脂肪酸的分离（固定相为水）流动相分离情况

28、95%乙醇：浓氨水100 : 1同系的直链脂肪酸正己醇： 1.5 mol/L 氨水1 : 1烷氧基酸流动相1:乙醇：浓氨水 : H2O = 80 : 5 : 15流动相2：乙二醇乙醚：桉树脑：88%甲酸 = 5 : 5 : 2草酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、羟基醋酸、顺丁烯二酸、丙二酸、乳酸、琥珀酸、乌头酸、己二酸、延胡索酸、葵二酸流动相分离情况丁醇：醋酸：水 4 : 1 : 5甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺、苯苄胺甲醇：戊醇：苯：水4 : 2 : 2 : 2萘胺、间苯二胺、对苯二胺、苯胺丁醇：1.5 mol/L 氨水1 : 1C7以下的脂肪酸例4. 胺类的分离（固定相为水）例5. 醇、酚的分离（

29、固定相为水）流动相分离情况丁醇：5%NaHCO3 1 : 1甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、异戊醇、辛醇己烷饱和甲醇乙醇、异丙醇、丙醇、异丁醇、正丁醇丁醇：乙醇：水 4 : 1.1 : 1.9乙二醇、丙三醇、甘露糖醇、山梨醇、肌醇流动相分离情况丁醇：醋酸：水 4 : 1 : 5苯甲酸、儿茶酚、肉桂酸、邻香豆酸、没食子酸、间羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、5-甲基苯二酚、间苯三酚、2,4,6三羟基苯甲酸、2,4二羟基苯甲酸、1,2,3苯三酚、对苯二酚、间苯二酚、羟基苯甲酸、邻羟基苯甲酸、香草酸例 核酸降解物（核苷酸、嘌呤、嘧啶碱基）的分离（固定相为水）流动相分离情况饱和(NH4)2SO4：水：2丙醇 79

30、 : 10 : 2鸟嘌呤、腺嘌呤、胞苷正丁醇：水：乙二醇：醋酸5 : 1 : 5 : 2AMP、 ADP、 ATP正丁醇：二苷酸：0.1 mol/L HCl4 : 1 : 1黄嘌呤、鸟嘌呤正丁醇：二苷酸：水4 : 1 : 1腺嘌呤、次黄嘌呤例. 其它类的分离（固定相为水）流动相分离情况正丁醇：浓氨水：水4 : 1 : 5磺胺嘧啶、磺胺噻睉、Sulfamerzine、p,p-sulfonyldianiline正丁醇：醋酸：水 4 : 1 : 5对胺基苯甲酸、维生素C、N甲基菸酰胺、菸碱酰胺、菸酸、潘妥宁、泛酸、VB6、VB1VB甲苯：石油醚：乙醇：水200 : 100 : 30 : 70雌酮、雌

31、二酮、雌三酮、马烯雌酮、脱氢皮质甾酮酸、孕甾酮、顺式睾丸甾酮流动相分离情况丁醇：浓盐酸98 : 2阿托品、莨菪胺、后马托品、莨菪碱、d古苛碱、d假古苛碱、托把柯卡因、金雀花碱、高金雀花碱、吗啡、可待因、蒂巴因、海洛因、那可叮、可它宁、北美黄莲碱、马钱子碱、二甲马钱子碱、奎咛、辛可宁、辛可宁啶、毛果碱、异毛果碱、毛果心碱、菸碱、吡啶、胆碱、乙酰胆碱、波尔啶碱、槟榔碱例8无机应用（固定相为水）流动相分离情况12 mol/LHCl：甲醇：丁醇：甲基异丁酮55 : 35 : 5 : 5K+、Rb + 、Cs +乙醇：水80 : 20Li + 、Na + 、K +10% HCl的水饱和丁醇Zn 2+Ga

32、 3+In 3+ Al 3+苯酚：甲醇：HCl 5 : 3 : 2Al 3+ Ga 3+ In 3+ Tl 3+流动相分离情况丁醇：HAc：乙酸乙脂：水10 : 2 : 1 : 7从Fe、Al、Ti中分离出Ga乙酸乙脂：水：HNO385 : 10 : 5从稀土、Zr、Ti、Th中分离出Sc乙醚：浓HNO3 87.5 : 12.5HfZr4 mol/L HCl 饱和丁醇UO2Th例9生物学应用FeCuCoNiNiNiNiTiMo黑毛红毛黄毛白毛 兔毛的色谱图以兔毛作实验，分离结果如右图。取不同颜色兔毛(300 500 mg), 干法灰化, 溶于稀HCl 中,用丙酮 : 丁醇 : HCl = 10

33、 : 4 : 2, 展开后,显色用纸色谱法分离A、B两种物质，在某条件下两物质的比移值Rf分别为0.36、0.40。设A、B两物质斑点的直径分别为0.2 cm,0.4 cm,当展开剂的前沿达到10 cm时，A、B能否完全分离?解：设A、B两物质色谱斑点的中心距原点分别为x1,x 2 cm,则 x1/10 = 0.36 x2/10 = 0.40 x2-x1 = (0.40-0.36)10 = 0.4(cm)欲分离两物质，两斑点中心距离至少为(0.20+0.40)/2 = 0.30cm,而实际两斑点中心距离为0.4 cm ,故在此条件下A B两物质可得到完全分离。用纸色谱法分离A、B两种物质，在一

34、定条件下A、B两物质的比移值分别为0.35,0.45，设A、B两物质色谱斑点的直径分别为0.50cm和0.80cm,要求展开剂前沿至少达到多少厘米时，A和B才能完全分离?设x1, x2分别为AB两物质斑点距原点的距离：则 x1/y=0.35 x2/y =0.45 x2-x1=0.40+0.25=0.65又 x2-x1=(0.45-0.35)y =0.65 y =6.5(cm)纸色谱法分离混合离子,若混合离子极性大小顺序为ABC,用弱极性有机溶剂展开后其Rf值大小顺序为_。C, B, A 6.4 薄层色谱法原理和特点原理: 当展开剂从薄板上固定相的空隙中通过时, 由于各组分的K的不同和足够多次的

35、分配.特点:装置简、操作方便展开时间短样品负荷量大、斑点扩散少缺点：Rf值的重复性差克服办法：标样和试样在同一块板上展开同一张色谱图可用不同的试剂显斑，也可用浓硫酸等强氧化剂或在400 500 加热碳化检出。吸附剂（固定相）决定吸附性能的因素：吸附剂的化学组成、活性、表面积要求：合适的吸附力与展开剂、被吸附物质均不起化学反应粒度细小而且均匀（范氏方程，减少涡流扩散项）(1). 氧化铝氧化铝呈微弱碱性，酸性较强的化合物在氧化铝上吸附的很牢（所以，酸性物质分离不好），故通常用于分离碳氢化合物、生物碱类和对碱性物质比较稳定的中性物质、碱性物质。一般要求薄板用的活性为 级氧化铝的活性与含水量密切相关（

36、含一定量的水份时，吸附剂表面的吸附中心回被水分子占据）活性 含水量（） 故加热驱除水活化；加入一定量的水失活 100 150oC, 除去Al2O3中与羟基结合的部分水份，使Al2O3有一定的活性150 300oC， Al2O3活性达 级300 400oC，Al2O3活性达 级 600oC， Al2O3进一步脱水并开始烧结 由于脱水过程受到许多因素的影响，因此，每批生产的Al2O3 ，其表面积和表面孔穴结构并不一致，活性也不相同。 Al2O3活性的测定：取20 L染料溶液（偶氮苯30 mg、对甲氧基偶氮苯、苏丹黄、苏丹红、和对氨基偶氮苯各20 mg ，溶解于50 mL CCl4中），加到薄板上，

37、用CCl4展层，根据下表确定活性。活性 Rf,偶氮苯 0.59 0.74 0.85 0.95Rf,对-甲氧基偶氮苯 0.16 0.49 0.69 0.89Rf,苏丹黄 0.01 0.25 0.57 0.78Rf,苏丹红 0.00 0.10 0.33 0.56Rf,偶氮苯 0.00 0.03 0.08 0.19市售的供薄层色谱用的Al2O3有:Al2O3 H氧化铝中无粘合剂Al2O3 G氧化铝中含煅石膏（一般5煅石膏） 煅石膏CaSO4，作为粘合剂Al2O3 HF254氧化铝中不含煅石膏，仅含荧光指示剂 （在254 nm下呈黄绿色荧光）Al2O3 GF254氧化铝中既含煅石膏又含荧光指示剂 （在

38、254 nm下呈黄绿色荧光）上述商品可以直接调料涂敷（1份料，2份水调合）（）硅胶（吸附性较Al2O3弱）硅胶是微酸性吸附剂，且适用于酸性、中性物质的分离（如有机酸、氨基酸、萜类、甾体）碱性物质则能与硅胶作用（当用中性溶剂展层，碱性物质有时停留在原点不动，或者得到拖尾的斑点，而不能很好的分离）活性 含水量（） 0 5 15 25 35注:硅胶薄层的活化温度不能高于200oC硅胶的结构为:硅胶活性的测定：称取二甲黄、苏丹红、靛酚蓝各40mg溶于100 mL 苯中，将此混合液滴加于薄层上，用石油醚展开10 cm，混合物应不动；如用苯展开，则应分成三个斑点，其Rf值分别为：二甲黄0.58，苏丹红0.

39、19，靛酚蓝0.08（展层时间30 45 min），则认为此硅胶合格。经本法测定的活性与Al2O3活性 级相当。薄层用商品硅胶有：硅胶H（不含粘结剂）、硅胶G（含粘结剂煅石膏）、硅胶HF254（含荧光物质的硅胶）硅胶GF254（含有煅石膏和荧光剂）此外，硅藻土、硅酸盐、杂多酸盐、聚酰胺、纤维素也可用作吸附剂。(3). 选择吸附剂的规律：极极性物质被极性表面的吸附剂吸附；亲亲水性的吸附剂适用于在非水溶液中吸附物质疏疏水性的吸附剂适用于在水溶液中吸附物质展开剂（流动相） 展开剂的洗脱作用实质是展开剂分子与欲分离组分竟争占据表面吸附中心的过程。 强极性展开剂分子占据吸附中心的能力强，所以，有强的洗脱

40、作用，非极性展开剂分子占据吸附中心的能力弱，所以，有弱的洗脱作用。（1）常用展开剂的极性： 石油醚环己烷二硫化碳四氯化碳三氯乙烯苯甲苯二氯甲烷氯仿乙醚乙酸乙酯丙酮乙醇甲醇吡啶酸（2）欲分离组分的极性饱和碳氢化合物系非极性化合物，不被吸附或吸附不牢。在其结构中引进某些功能团则极性增加。取代基团极性越强，整个分子极性越强。常见功能团按其极性增加的顺序是： 烷烃烯烃醚类硝基化合物二甲胺酯类酮类醛类硫醇胺类酰胺醇类酚类羧酸类 当有机分子的基本母核相同时，极性基团越多，整个分子的极性越大分子的双键越多，吸附能力越强；共轭双键越多，吸附能力越强分子中取代基团的空间排列对吸附性也有影响，如同一母核中羟基处于

41、能形成内氢键位置时，其吸附能力弱于不能形成内氢键的化合物（3）展开剂的选择4. 操作技术（1）制板玻璃板 a .平整、去油、去污（可用浓H2SO4-K2CrO7洗液浸洗，或丙酮擦洗，自来水洗净后，烘干）b. 玻璃板的尺寸根据自己的需要自由选择，小的可用2.57.5cm的载玻片, 大的可用20 20cm的玻片。涂布液 取一定量的吸附剂放入研钵中，加入需要的水或适当的溶剂，研磨时间以调成稀糊状为度，当浓度均一后，即成胶状物，色泽洁白为最佳，立即倾入玻璃板上，用下述方法涂布。涂布方法 玻棒涂布 玻片刮涂 倾斜涂布（利用流平性）：简单，但均匀性差 涂布器活化 薄板首先风干，否则湿板一下加热到高温，烘出

42、的薄板很酥松，使用效果不好。 氧化铝G板在150 160oC, 烘4小时(级左右) 硅胶G板在110oC烘1小时 薄板经活化后，一定要储藏在密闭的干燥器或烘箱中备用。(2)点样适当的点样量，集中的斑点是得到一个好的色谱的必要条件。如何才适当？不同的分离要求、不同的薄板（有厚有薄）、不同的吸附剂（性能不一），需要不同的点样量。从下图可见：点样量少了，不易检出；点样量多了，易拖尾或扩散，影响分离效果。0.12503000.50.30.1Rfg纯物质的鉴定，若又有高灵敏度的显色剂，点样量只需g或ng；若进行天然物或中间产物的分离时，点样量需50 g几百微克；若进行制备色谱，进样量可达1mg。点样时可

43、用内径约1mm，管口平整的毛细管或微量吸管吸取试液后，轻轻接触板面，分数次滴加样品。注意点：a.溶解试样的溶剂最好是挥发性的b.点样宜分几次点加,即点一次后, 用吹风机的冷风吹干, 再点, 再吹干, ., 反复,直到点完所要求的量c. 点样量的体积尽可能小些(2 10L左右)d. 点样最好是在密闭的室中或比较干燥的环境下完成, 避免薄板吸水降低活性.15cm2.5cm1.5cm溶剂前沿（）展层薄层的展开需在密闭的器皿中进行，密闭容器应用展开溶剂予先饱和。展开方式和纸层析相同。但不加粘合剂的薄板只能作近水平式（与平面成20 10oC角）的上行或下行的展层而不能垂直展层。把点好样品的薄板浸入0.5cm深的适宜展开剂中，当展开剂移动至离起点约10