SODPODCAT酶活测定

1、0.067mol/LpH7.0磷酸缓冲液分子量0.067molPH7.0(1000ml磷酸缓冲液)OOODDDDaHPO.2HO178.05242DaHPO.12HO358.22242KHPO136.0924Da2HPO4.2H2O7.1184g(或D根系活性的测定7.1184g14.4004g3.6292ga2HPO4.12H2O14.4004g)+KH2PO43.6292g定容到1000ml容量瓶中1、实验材料、试剂与仪器设备1.实验试剂乙酸乙酯（分析纯，次硫酸钠（Na2S2O4,分析纯）,粉末,1%TTC溶液，磷酸缓冲液(1/15mol/L，pH7.0)，1mol/L硫酸。2.仪器设备小

2、烧杯3个,研钵1个，移液管：0.5mL1支、10mL1支、5mL3支,刻度试管6支，分光光度计，电子天平，温箱，试管架，药勺，石英砂适量，滤纸。2、实验内容操作步骤2、定量测定（1）TTC标准曲线的制作取0.4DTTC溶液0.2ml放入大试管中，加9.8ml乙酸乙酯，再加少许Na2S2O4粉末摇匀，则立即产生红色的TTF。此溶液浓度为每毫升含有TTF80|Jg。分别取此溶液0.25ml、0.50ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml置10ml刻度试管中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF20pg、40pg、80pg、120pg、160pg的系列标准溶液，以乙酸乙酯作参照，在485nm

3、波长下测定吸光度，绘制标准曲线。（2）称取根尖样品0.5g，放入小烧杯中，加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液（pH7.0）各5ml,使根充分浸没在溶液内，在37叮暗保温12h,此后立即加入1mol/L硫酸2ml,以停止反应。（与此同时做一空白实验，先加硫酸，再加根样品，37下暗保温后不加硫酸，其溶液浓度、操作步骤同上）。（3）把根取出，用滤纸吸干水分，放入研钵中，加乙酸乙酯34mL,充分研磨，以提出TTF。把红色提取液移入刻度试管，并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤23次，皆移入刻度试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml,用分光光度计在波长485nm下比色，以空白试验作参照测出吸光度，查标准曲线，即可求

4、出TTC原量。2.计算结果根系活力mgTTF/(g.h)=WDhD1000式中：四氮唑还原量,|Jg;W根重，g;h时间，h。二叶绿素含量测定：95%乙醇溶液,在665、649、470nm处有最大吸收峰Ca=13.95D665-6.88D649Cb=24.96D649-7.32D665Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/245抗氧化酶活性的定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液（PBS）（pH=7.8）溶液的配制：65.5506gNa2HPO412H2O+2.65285gNaH2PO42H2O,定容到4L。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导，P134）。取低温保存的

5、鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。2.1丙二醛（MDA）的测定：20%三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P124）；0.5%硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA），用20%三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导

6、,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）;0.5ml酶液（对照用0.5ml的0.05mol/LpH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+3mlTBA振荡一一沸水浴上反应30min冷却（至少30min）比色（0D600、OD532、OD450）。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导，P124）2.2超氧化物歧化酶（SOD）的测定：NBT（400ml）混合反应液：392mlPBS（Ph=7.8）,+0.0206gNBT+0.776g甲硫酸铵+8ml核黄素溶液+0.4mlEDTA-Na溶液（100mlPBS缓冲溶液中含0.01204g核黄素）。（另配）100mlPBS溶液加

7、EDTA-Na3.7224gEDTA-Na测试时：取3ml反应液+0.05ml（根）或0.02ml（叶）粗酶液，于光照培养箱中6-10分钟，OD650下测定吸光度。2.3过氧化物酶（POD）的测定：0.05mol/L磷酸缓冲溶液（PBS）（pH=7.0）溶液的配制：10.9251gNa2HPO412H2O+3.042975gNaH2PO42H2O,定容到1000ml。0.3%H2O2溶液的配制：吸2.5ml30%H2O2,用0.05mol/LpH=7.0磷酸缓冲溶液（PBS）定容到250ml。0.2%愈创木酚溶液的配制：称0.5g愈创木酚，用0.05mol/LpH=7.0磷酸缓冲溶液（PBS）定容到250ml。2ml0.3%H2O2溶液+0.95ml0.2%愈创木酚溶液+1ml0.05mol/LpH=7.0磷酸缓冲溶液（PBS）+0.02ml酶液（原来为0.01）酶液（根加0.05ml酶液）（对照用0.05mol/L磷酸缓冲溶液代替酶液）（做三个重复），记录470nm处OD降低速度。将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P121）比色时加酶液，混合后即刻计时。2.4过氧化氢酶（CAT）的测定：0.3%H2O2溶液的配制：吸5ml30%H2O2，用0.05mo