细胞生物学系列常见问题及解决方法

1、细胞生物学系列常见问题及解决方法一、Vazyme TUNEL系列、高背景 (如未凋亡细胞的强绿色荧光背景)、标记时间可能过长，可减少孵育时间。、适当减少TdT酶及dUTP的用量。、在操作过程中保持细胞湿润；标记反应完成，载玻片在用PBS洗一遍之后，可再用含0.1% Triton X-100和5mg/ml BSA的PBS洗三次，每次5分钟。、荧光信号弱或无信号、细胞建议用Triton-100通透，切片用蛋白酶K处理，切片厚度小于10-15m时，通透1030min即可，如果过厚则延长通透时间。、延长标记时间至2h，并适当增加TdT酶及dUTP的含量。、阳性对照：设立凋亡模型。、组织切片从载玻片上脱

2、落a)、组织切片粘附之前的包被不充分。在展片之前，用3-氨丙基三乙氧基硅烷包被显微镜载玻片比多聚赖氨酸效果更好。、荧光显微镜或流式细胞仪分析只剩下很少的细胞、在操作过程中丢失大量细胞：提高起始的细胞量。、在制备贴到显微镜载玻片的细胞悬液时，离心过程中用含1%BSA的PBS洗细胞。二、Vazyme的Annexin V系列1)、Annexin V-FITC染色失败或者阳性率偏低a)、要确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡：可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。b)、贴壁细胞消化不当：AnnexinV跟PS的结合需要Ca2+离子，但大多数胰酶中含Ca2+的络合剂EDTA，从而影响染色，

3、建议使用无EDTA的胰酶。c)、细胞用冷PBS洗涤离心后，应尽量去掉残余液体：残留PBS中的磷酸根，会与游离的Ca2+形成磷酸钙沉淀。d)、Binding Buffer是否被污染：瓶盖要紧闭，空气中的CO2进入后与游离的Ca2+形成CaCO3沉淀，导致实验的失败。e)、若为贴壁细胞，药物诱导后漂浮的细胞也要收集，这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞，丢弃会造成阳性结果偏低。2)、假阳性a)、细胞本身活力差：建议用台盼蓝染色计算细胞的活力，台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若活力低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少要传代3次以后才能进行实验。b)、细胞操作不当：尤其是贴壁细胞消化过程中反复剧烈吹打导

4、致破坏细胞膜，使得假阳性偏高。c)、诱导时间过长：一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡，因此通常不需要处理大于48小时以上；诱导时间过长会使营养物质耗尽，导致细胞状态差，假阳性结果偏高。三、Cell Cycle Assay Kit1)、G0/G1突然发生变化或漂移a)、流式细胞仪管路中有气泡或被阻塞：建议检查管路是否通畅或是否有气泡b)、PI浓度不够：建议增加PI的浓度c)、与PI孵育的时间不够长：建议增加孵育的时间2)、峰宽a)、流式细胞仪的流速太快，建议调整流式细胞仪的流速b)、样品中有气泡，检查样品中是否有气泡c)、样品中有坏死细胞，建议更换样品3)、无样品峰a)、可能样品中无细胞核

5、，坏死细胞过多，建议显微镜观察样品或更换样品b)、细胞碎片过多四、ExFect1)、转染效率偏低a)、ExFect与DNA的比例不优化：通过预实验测试ExFect与DNA的最佳比例(在25 l/g DNA范围内尝试)。在后续的实验中选择转染效率高、细胞毒性低的比例进行转染。b)、转染前为细胞更换了无血清培养基：ExFect/DNA复合物的包装反应需在无血清条件下进行，但使用包装好的复合物进行转染时，细胞培养基中应含有血清。多数情况下，在完全培养基中进行转染，并且转染后不更换培养基有助于获得更高的转染效率和更低的细胞毒性。c)、转染时细胞密度不合适：多数情况下，当细胞密度达到60%80%时转染可

6、以取得较高的转染效率。然而细胞类型不同，最适的转染密度也不尽相同。可以通过预实验寻找较优化的转染密度，并在后续实验中保持这个密度。d)、DNA质量偏低(降解或包含内毒素)：为实现高效率、低毒性的转染，应使用高质量的DNA(高纯度、无菌、无内毒素)。e)、转染试剂/DNA复合物包装体系中包含血清：当复合物包装反应中存在血清时，转染试剂/DNA复合物无法正常形成。f)、存在转染抑制因素：当包装反应和转染过程中存在多聚阴离子聚合物时(例如：硫酸葡聚糖、肝素等)转染将无法正常进行。因此应使用不含这些成分的培养基。g)、细胞状态偏差：传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变。因此，为了提高

7、转染效率和稳定性、降低细胞毒性，应尽量使用适度传代的细胞系，并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。2)、细胞毒性偏高a)、转染前为细胞更换了无血清培养基：ExFect/DNA复合物的包装反应需在无血清条件下进行，但使用包装好的复合物进行转染时，细胞培养基中应含有血清。多数情况下，在完全培养基中进行转染，并且转染后不更换培养基有助于获得更高的转染效率和更低的细胞毒性。b)、转染时细胞密度不合适：多数情况下，当细胞密度达到60%80%时转染可以取得较高的转染效率。然而细胞类型不同，最适的转染密度也不尽相同。可以通过预实验寻找较优化的转染密度，并在后续试验中保持这个密度。c)、ExFect/DNA复合物过量：转染试剂过量会导致较高的细胞毒性。尝试减少DNA或者ExFect的使用量。d)、ExFect/DNA复合物加入培养基时分布不均匀：局部转染试剂/DNA复合物浓度过高是导致细胞毒性偏高最常见的原因之一。当复合物添加到培养基之后，应