药物毒理学：第二十章 全身用药的毒性研究

1、第二十章 全身用药的毒性研究全身用药的毒性研究急性毒性研究长期毒性研究第一节 急性毒性试验一、急性毒性和急性毒性试验概念及目的二、急性毒性试验内容三、急性毒性分级一、概念和目的急性毒性(acute toxicity)是指机体(人或试验动物)一次接触或24小时内多次接触化学物后在短期(最长到14天)内所发生的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。 一、概念和目的动物急性毒性试验(acute toxicity test)是指研究动物一次接触或24小时内多次接触受试物后在短期内所发生的毒性反应。目 的 1、了解新药急性毒性的强弱 LD50 ED50 治疗指（ LD50/ED50

2、） 相对毒性 安全系数（ LD5/ ED95）7 效应强度 药物浓度 100% 50% 0 最小有效浓度（阈浓度） 半数有效量 (EC50或ED50) 引起50%阳性反应 50%最大效应的量 8 半数中毒量（TD50或TC50） 产生毒性反应剂量的50% 半数致死量（LD50或LC50） 引起死亡剂量的50%9 Some Acute Oral LD50 Values CategoryDoseSpecies Chemical(mg/kg body weight) Practically nontoxic 15 000 Slightly toxic10 000Mouse 乙醇 5 000 Mode

3、rately toxic 4 900Rat 氯化钠 750Rat 阿托品 500 Highly toxic 250Rat 胺甲萘(杀虫药) 50 Extremely toxic 13Rat 对硫磷(杀虫药) 5 Supertoxic 3Rat 华法林 0.4Duck 黄曲霉素B110 安全范围 (Safety range): ED95和TD5之间的范围。 安全系数 LD5和ED95之间的比值 2、为长期毒性试验和特殊毒性试验剂量设置提供依据 致突变作用评价为核试验的最高剂量 为1/2半数致死量。 生殖毒性试验中，雌性动物最高量为 急毒中的最大耐受量。 长期毒性试验中为急性毒性的最大耐 受量。

4、3、获取新药毒性反应信息 毒性反应症状、靶器官、致死原因等 一般情况 毒性大小 有明显种属差异 特殊情况 无明显种属差异 对一期临床的指导意义 4、为新药药学研究提供参考 急性毒性试验 毒性反应类型 定性 出现和消失时间 可能的靶器官和死亡原因 致死量 定量 最大给药量 半数致死量急性毒性试验常用的毒性参数：LD50 or LC50 半数致死剂量或浓度ALD or ALC 近似致死剂量或浓度MLD or MLC 最小致死剂量或浓度 MTD or LC0 最大耐受量ED0 or EC0 最大无作用剂量试验基本内容一、半数致死量（LD50)的测定 传统方法 （一）试验动物原则：急性毒性试验要求选择

5、对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的试验动物。动物易于获得品系纯化价格较低和易于饲养等条件。 1试验动物的种属和品系最好用两种种属的动物啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非啮齿类：狗或猴。急性皮肤毒性试验可选用成年大鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔。而急性吸入毒性试验和经口急性毒性试验则优先考虑大鼠。试验动物的年龄和体重：急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕的动物。例如：大鼠180240g、小鼠1825g、家兔22.5kg、豚鼠200250g、狗1015kg。同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20。 3.试验动物的性别：

6、急性毒性试验的主要内容是求LD50，除特殊要求外，一般急性毒性试验对动物性别要求为雌雄各半。如果在预试验时发现化学毒物(如农药)对雌、雄动物毒效应的敏感性有明显差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。如果试验是为致畸试验作准备，也可仅作雌性动物的LD50测试。 （二）试验动物的饲养环境恒定的温度：223湿度：3070%照度：昼夜各半饲料合格、饮水合格、垫料合格（三）剂量与分组 1查阅文献了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。确定使用哪一种计算方法求LD50，然后再设计剂量分

7、组。LD50的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍思法等。找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值。 2、剂量设计 预试验得出0-100%的死亡剂量范围内，设计5-6个剂量组。各剂量组间距为1:0.65-0.85,高剂量70%死亡率以上，低剂量死亡率30%以下。 每组10只，雌雄分开单独进行，也可以雌雄各半来进行试验。 分组严格遵守随机分组原则，采用随机分组表进行。 （四）给药途径的选择: 给药途径（exposure routes）的选择需考虑：模拟人在生活和生产环境中实际接触受试

8、物的途径和方式；有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；受试物的性质和用途；各种受试物毒性评价程序的要求等。 最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。 经口(胃肠道)接触 : 灌胃:小鼠0.21.0ml/只或0.20.4ml/10g 大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只 家兔不超过10ml/2kg 狗不超过50ml/10kg 吞咽胶囊: 经呼吸道接触 : 静式吸入 动式吸入 经皮肤接触 :注射途径接触: （五）试验周期与毒效应观察1.中毒症状器官或系统中毒后常见表现中枢神经系统和躯体运动叫声异常、痉挛、抽搐、强直、麻痹、反应过低或过高等自主神经系统瞳孔散大或缩小、流涎、流泪等呼吸系统溢液

9、、呼吸困难或过速血液循环系统心动过速或过缓、心律不齐等胃肠系统腹泻、便秘、粪便形态异常等其它皮疹、水肿、黄疸、消瘦、眼球突出或充血等（五）试验周期与毒效应观察: 2.体重在观察试验动物中毒症状的过程中，应同时观察体重的变化。体重可以反映动物中毒后的整体变化。体重改变的原因很多，若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。所以，对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物应在观察期14天内称量其体重的变化以便了解受试物引起毒效应的持续时间。 （

10、五）试验周期与毒效应观察:3.病理检查及其他指标:急性毒性试验中，对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查，肉眼观察主要脏器的大体病理变化，如脏器大小、外观、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其它改变，对有改变的脏器进行取材做组织病理学检查。对存活动物在观察期结束时进行大体病理检查必要时做组织病理学检查。根据试验需要可进一步扩大观察项目如体温、心电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。（五）试验周期与毒效应观察4.死亡和死亡时间重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。分析中毒死亡时间的规律具有一定意义，可为深人研究化学物的毒作用机制提供参考。

11、(六)经典急性毒性试验的局限性1.消耗的动物量大2.获得的信息有限3.测得的LD50仅仅是一个近似值4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。三、最大给药量测定法 在受试药物合理的最大容积和最大浓度条件下，仍未测出LD50，可只求MTD值。 方法：用最大浓度和最大允许容量一次或一日23次给20只动物（雌雄各半）后，连续观察7-14天，未见任何动物死亡，即为最大给药量。 四、近似致死剂量法主要用于非啮齿动物的试验。常用Beagel犬或猴。1、估计可能的致死范围。2、按50%递增法，设计10-20个剂量的序列表。3、

12、在剂量的序列表中找出可能致死剂量范围。五、固定剂量法（Fixed-dose procedure) 试验不以死亡为观察终点，而以明显的毒性体征为评价指标。 用5、50、500和2000 mg/kg4个固定剂量中的一个做初试剂量，单次给药。首选雌性动物进行试验。六、其他方法 1、上下法（阶梯法、序贯法） 2、累积剂量设计法（金字塔法）上下法（Up-and-Down Procedure）UDP由限度试验和主试验组成。限度试验分为2000mg/kg剂量水平和5000mg/kg剂量水平，用于受试物毒性可能较小的情况。两种剂量的限度试验具体步骤有细微差别，但最多仅用5只动物。 上 下 法主试验是一个预先设

13、计的给药程序，在此程序中，每次给药一只动物，若该动物存活，第二只动物给予高一级剂量，若第一只动物死亡或出现濒死状态，第二只动物给予低一级剂量。在对每只给药动物仔细观察48小时后，可以决定是否对下一只动物给药，以及给药剂量。当出现在最高剂量下有连续3只动物存活，或在6只动物中有5只连续发生在高一级剂量死亡、在低一级剂量生存的生死转换等情况时，可以停止试验。根据终止时所有动物的状态，用最大可能性法计算LD50值 用于该方法的LD50计算软件可从以下地址免费下载： /oppfead1/harmonization/ F系列抗癌活性物的急性毒性试验研究研究背景以G四链体结构为靶点的端粒酶抑制策略，成为抗

14、肿瘤药物的研究热点。然而目前国内外对于此类药物的毒性研究甚少，缺乏有效的G四链体稳定剂安全评价体系，限制了其临床应用。吲哚喹啉（去甲基白叶藤碱）衍生物F318系列化合物和凡等. 参与抗癌新药F318体外代谢的大鼠细胞色素P450酶, 中国新药杂志 2007, 16（10）, 765-769.研究目的评价受试物的急性毒性，估算LD50及其可信限，进行大致的毒性分级。观察毒性表现，为毒性作用机制的研究提供线索。为受试物的筛选及结构修饰提供依据。为建立有效的G四链体稳定剂安全评价体系做出基本准备。研究框架研究方法上下法（Up-and-Down Procedure, UDP）试验动物：昆明小鼠，雌性剂

15、量级数因子：3.2 1.75 5.5 17.5 55 175 550 2000 （单位：mg/kg）起始剂量 研究方法上下法（Up-and-Down Procedure, UDP）停止标准 1、最高剂量下连续3只动物存活 2、任意连续6只试验动物中有5只连续发生存活/死亡转换 3、第一只动物发生转换之后至少有4只动物进入试验，并且其LD50估算值的范围超出临界值（2.5倍）研究方法上下法（Up-and-Down Procedure, UDP）观察与记录： 中毒症状，症状出现、消失时间，死亡情况，大体解剖数据处理： AOT 425(Version1.0) 研究结果试验序号给药剂量（mg/kg）死

16、亡情况LD50(95%CI)(mg/kg)155O2138.9X355X417.5O55(14.51-286)555O6175X表1 FM318小鼠经腹腔注射给药的急性毒性结果及LD50计算注：O=生存，X=死亡研究结果试验序号中毒症状死亡情况大体解剖所见1无存活无异常2竖毛,行动迟缓,闭眼,蜷缩24h后发现死亡,尸体腹面向下,伸展腹腔有少量黄色液体，肝、胃、肠颜色变黄，其他无异常3竖毛,腹式呼吸,运动不协调48h后发现死亡,尸体腹面向上无异常4无存活无异常5无存活无异常6大小便失禁,震颤,站立不稳24h后发现死亡,尸体腹面向上,蜷缩无异常表2 FM318小鼠经腹腔注射给药的急性毒性反应症状研

17、究结果试验序号给药剂量（mg/kg）死亡情况LD50(95%CI)(mg/kg)1175O255O3175X455O103(55-175)5175X655O7175X表3 F318成盐化合物小鼠经静脉注射给药的急性毒性结果及LD50计算注：O=生存，X=死亡研究结果试验序号中毒症状死亡情况大体解剖所见1无存活无异常2无存活无异常3注射时排尿，静卧，腹部抽搐，呼吸困难，挣扎，眼睛深红，紫绀死亡无异常4腹式呼吸存活无异常5腹部抽搐死亡无异常6兴奋存活无异常7上下跳跃，排尿，眼凸死亡无异常表4 F318成盐化合物小鼠经静脉注射给药的急性毒性反应症状研究结果试验序号给药剂量（mg/kg）死亡情况LD50(95%CI)(mg/kg)117.5O255O3175X455O81.41(55-72.2)5103.6X655O772.2X注：O=生存，X=死亡表5 FM318成盐化合物小鼠经静脉注射给药的急性毒性结果及LD50计算研究结果试验序号中毒症状死亡情况大体解剖所见1无存活无异常2无存活无异常3注射时排尿，行动迟缓，眼睛充血，竖毛，鼻出血，嘴紫绀死亡无异常4腹部颤动，异常兴奋存活无异常5上下跳跃，眼凸，排尿死亡无异常6兴奋存活无异常7上下跳跃，排尿死亡无异常表6 FM318成盐化合物小鼠经静脉注射给药