微生物遗传实验打印

1、4操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2（1）从新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一单菌落，接种于35ml LB液体培养中，37振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:1001:50转接于100ml LB液体培养基中，37振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次OD600nm，至OD600nm0.5时停止培养；1（2）每组取培养液3个2ml转入2ml离心管中，在冰上冷却20-30min，于4，4000rmin离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；（3）倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液

2、轻轻悬浮细胞，冰浴；2（4）04，4000rmin离心10min；（5）弃去上清液，加入500l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。04，4000rmin离心10min；（6）弃去上清液，加入100l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；（7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70条件下，可保存半年至一年。32）细胞转化 (1) 分别取3个100l感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，第一组，加入1l重组质粒DN

3、A(体积不超过10l)+ 100l感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，质粒DNA对照组1l+100l感受态细胞悬液。 4(2) 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42水浴中保温6090S，然后迅速冰上冷却2min(3) 立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到0.5ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37振荡培养约30min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。53) 平板培养（有时需要稀释）取各样品培养液0.1ml，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用

4、，不要过烫）。6(2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA产生5106-2107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。74) 检出转化体和计算转化率统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养皿内菌落生长状况应如表所示: 周五8：00-9：00 一二班接合实验9：30-13：00 一班感受态制备、转化实验13：30-17：00 二班感受态制备、转化实验21：00 一二班接合实验周六上午一、二班9:00上午观察转化实验、接合实验结果周六晚上挑单菌落阳性结合子于LB液体（氯霉素40ppm+庆大霉素40ppm），30度过夜培养。同时分别在加有相应抗生素的LB液体中的培养供体菌、辅助菌、受体菌至对数中期。一班19：00二班：20：00周日分别提取质粒后进行电泳检测，