蛋白质合成、转运、加工与修饰deflate

1、第二章 蛋白质的合成、转运、加工与修饰1第一节 蛋白质的合成第二节 蛋白质合成后的定向输送第三节 蛋白质合成后的加工与修饰蛋白质的合成、转运、加工与修饰2第一节 蛋白质的合成转录：以基因的DNA链为模板，以NTP为原料，在RNA聚合酶的作用下，按照AU和GC的碱基配对原则生成mRNA、tRNA和rRNA的过程。mRNA是指导蛋白质合成的直接模板。基因表达的最终产物是蛋白质、tRNA和rRNA。3一、信使RNA二、遗传密码三、核糖体-蛋白质合成的场所四、tRNA及氨酰-tRNA合成酶五、蛋白质生物合成过程六、翻译的调节 （S）第一节 蛋白质的合成4一、信使RNA（messenger RNA，mR

2、NA）mRNA的概念首先从理论上提出来，然后再用实验给予证实。Jacob和Monod（1961）提出mRNA的假设：有一种中间物质传递DNA上的信息。他们对这种中间物质的性质做了如下的预言：1. 信使是一种多核苷酸。2. 信使的碱基组成应与相应的DNA的碱基组成相一致。3. 信使的长度应是不同的。4. 在多肽合成时，信使应与核糖体做短暂的结合。5. 信使的半衰期很短，所以它的合成速度应该是很快的。5Brenner等用实验证实：用噬菌体T2感染大肠杆菌后，几乎所有在细胞内合成的蛋白质都不再是细胞本身的蛋白质，而是噬菌体所编码的蛋白质；大肠杆菌内出现了少量半衰期很短的新类型RNA，其代谢速度极快，

3、它们的碱基组成与噬菌体DNA是一致的。Spiegelman用分子杂交技术证明：经噬菌体感染后新合成的RNA可以与噬菌体DNA相杂交。6顺反子：编码一种多肽链并连同起始信号和终止信号在内的DNA区段。单顺反子mRNA：编码一种多肽链的mRNA分子。多顺反子mRNA：编码数种不同多肽链的同一条mRNA分子。多见于原核生物。反义链/（-）链：双链DNA分子中被转录成RNA转录本的链。正义链/（+）链（S）7SD序列/核糖体结合位点（ribosomal binding site，RBS）：原核细胞mRNA的翻译起始密码子AUG的上游相距813个核苷酸处有一段由46个核苷酸组成的富含嘌呤的序列，以5-A

4、GGA-3为核心，它与核糖体小亚基上的16S-rRNA的近3末端处的一段短序列互补。Kozak序列：a favorable context for efficient eukaryotic translation initiation（PuNNATGPu）。（S）典型的Poly(A)加尾信号：AATAAA。（S）cDNA末端快速扩增法（rapid amplification of cDNA ends， RACE）（S）8三联体密码（triplet code）/密码子（codon）：mRNA采用每三个相邻碱基编码一个氨基酸。二、遗传密码43=64天然蛋白质 101010114种碱基20种氨基酸9

5、第一个核苷酸（5）第二个核苷酸 第三个核苷酸（3） U C A GU苯丙氨酸丝氨酸酪氨酸半胱氨酸U苯丙氨酸丝氨酸酪氨酸半胱氨酸C亮氨酸丝氨酸终止密码（赭石型）终止密码（蛋白石型）A亮氨酸丝氨酸终止密码（琥珀型）色氨酸GC亮氨酸脯氨酸组氨酸精氨酸U亮氨酸脯氨酸组氨酸精氨酸C亮氨酸脯氨酸谷氨酰氨精氨酸A亮氨酸脯氨酸谷氨酰氨精氨酸GA异亮氨酸苏氨酸天冬酰氨丝氨酸U异亮氨酸苏氨酸天冬酰氨丝氨酸C异亮氨酸苏氨酸赖氨酸精氨酸A蛋氨酸苏氨酸赖氨酸精氨酸GG颉氨酸丙氨酸天冬氨酸甘氨酸U颉氨酸丙氨酸天冬氨酸甘氨酸C颉氨酸丙氨酸谷氨酸甘氨酸A颉氨酸丙氨酸谷氨酸甘氨酸G遗传密码和氨基酸的关系表1061个密码分别代表

6、各种氨基酸（amino acid，aa）。一种aa少的只有1个密码（色氨酸和蛋氨酸），多的可有6个，但以2个和4个居多。终止密码子（terminator codon）：UAA（赭石，ochre）、UGA（蛋白石，opal）和UAG（琥珀，amber）。起始密码子（initiator codon）：AUG（91）/GUG（8）。11遗传密码的特点1. 连续性（commaless）。三联体密码是不间断的。mRNA链上碱基的插入或缺失可造成框移（frame shift），使下游翻译出的氨基酸完全改变。2. 通用性（universal）。从最简单的生物一直到人类，在蛋白质的生物合成中都使用同一套遗传密

7、码。哺乳动物线粒体的蛋白质合成体系中有例外！3. 简并性（degeneracy)。有两个以上密码子的氨基酸，三联体密码上第一、二位碱基大多是相同的，只有第三位不同。密码子上第三位碱基的变化往往不会影响原有氨基酸的翻译。（密码子的“偏爱性”）124. 摆动性（wobble）。翻译过程氨基酸的正确加入，需靠mRNA上的密码子与tRNA上的反密码子相互以碱基配对辨认。密码子和反密码子配对，有时会出现不遵从碱基互补配对的规律，这一现象更常见于密码子的第三位碱基与反密码子的第一位碱基之间，两者虽不严格互补，也能相互辨认（表2-2）。5. 不重叠性（non-overlapping）。在绝大多数生物细胞中基

8、因的读码规则是不重叠的。例外：少数大肠杆菌噬菌体（如R17、QB等）的RNA基因组中，部分基因的遗传密码是重叠的。13tRNA反密码子碱基 I U CmRNA密码子碱基 A,C,U A,G C,G,U表 密码子和反密码子配对的摆动现象I：次黄嘌呤14三、核糖体-蛋白质合成的场所核糖体（ribosome）/核糖核酸蛋白体：一种非膜性细胞器，由核糖核酸和蛋白质组成。是细胞合成蛋白质的重要场所。它是一种葫芦形的小体，由大小两个亚基组成。在大小亚基的结合面上有一条隧道，是mRNA穿过的通道。在大亚基的中央有一条中央管，是新合成的多肽链释放的通道。15原核生物核糖体结构示意图161. 受位/ A位点/

9、氨酰-tRNA位点：接受氨酰-tRNA的部位。2. 供位/ P位点/ 肽酰-tRNA位点：肽酰-tRNA移交肽链后，tRNA被释放的部位。3. 退出位点/ E位点（exit site）：空载的tRNA从此位点被排除。4. 肽基转移酶位点/ 转肽酶位点：位于大亚基上，是肽链合成过程中催化形成肽 键的酶活性部位。5. GTP酶位点/ 转位酶位点：可水解GTP，为催化肽基-tRNA由A位转到P位提供 能量的酶活性部位。核糖体活性部位示意图171. 核糖体单体：核糖体以单体形式存在。2. 多聚核糖体：核糖体单体由mRNA串联在一起，是合成蛋白质的功能单位。1. 游离核糖体（free ribosome）

10、：合成结构蛋白质/内泌性蛋白质（endogenous protein），指用于细胞本身或参与组成细胞自身结构的蛋白质。2. 结合核糖体（fixed ribosome）：合成输出蛋白质（export protein）/分泌蛋白质（secretory protein），指输送到细胞外面，以发挥生物作用的蛋白质。核糖体的存在形式18核糖体的存在形式19 表 原核细胞与真核细胞的核糖体理化性质比较20E.coli核糖体小亚基中rRNA与r蛋白的相互关系示意图线条表示相互作用及作用力的强（粗线）与弱（细线）（引自Alberts et al，1989）21核糖体小亚单位rRNA的二级结构（a）E. col

11、i 16S rRNA（红色为高度保守区）；（b）酵母菌18S rRNA。它们都具有类似的40个臂环结构（图中140），其长度和位置往往非常保守；P和E分别代表仅在原核或真核细胞中存在的rRNA的二级结构。（Darnell et al.，1990）22四、tRNA及氨酰-tRNA合成酶转运核糖核酸（transfer RNA，tRNA）：分子量较小，沉降系数约为4S，约占细胞中RNA总含量的1015，在蛋白质合成时起搬运氨基酸的作用。它对不同的氨基酸有特异性，一种tRNA只能搬运一种氨基酸。23翻译过程中行使“起动”作用的tRNA，能特异地识别起始密码子AUG： 蛋氨酰-tRNA（真核细胞） 甲酰

12、蛋氨酰-tRNA（原核细胞或线粒体）24aaATP+氨酰-tRNA合成酶Mg 2+aaAMP氨酰-tRNA合成酶+PPitRNAAMPaatRNA氨酰-tRNA合成酶+氨基酸的活化过程示意图氨基酸 + tRNA + ATP 氨酰-tRNA + AMP + ppi + H2O 25氨酰-tRNA合成酶的专一性对aa有极高的专一性；有的酶对aa的专一性并不很高，但对tRNA却有极高的专一性。只作用于L-氨基酸，不作用于D-氨基酸。26五、蛋白质生物合成过程翻译过程从读码框架的5-AUG开始，按mRNA模板的三联体的顺序延长肽链，直至终止密码出现。活化的aa由tRNA搬运，通过“核糖体循环”的机制，

13、依照mRNA的指令，依次合成肽链。“核糖体循环”人为地分为三个阶段：（一）起动阶段翻译起始复合物的生成（二）肽链的延长（三）肽链合成的终止核糖体；mRNA；tRNA；aa；蛋白因子；能量27IF-3IF-1（一）起动阶段翻译起始复合物的生成1. 核糖体亚基的拆离。利于mRNA和fmet-tRNA结合到小亚基上。28AUG53IF-3IF-12. mRNA在核糖体小亚基上就位。29核糖体小亚基上的16S-rRNA的近3末端处的一段短序列与SD序列互补；紧邻SD序列AGGA的小段核苷酸被核糖体小亚基蛋白rps-1辨认结合。30IF-3IF-1IF-2GTP3. fmet-tRNA的结合。fmet-

14、tRNA只能辨认和结合于起始密码子AUG上，推动了mRNA的前移，保证了mRNA就位的准确性。AUG5331IF-3IF-1IF-2GTPGDPPi4. 核糖体大小亚基的结合。加入核糖体大亚基，翻译起始复合物生成。P位被fmet-tRNA和mRNA上的AUG占据；mRNA上仅次于AUG的第二个三联体密码子已相应于A位。AUG5332IF-3IF-1AUG53IF-2GTPIF-2-GTPGDPPi33起始因子（Initiation Factor，IF）1. IF-1：协助IF2和IF3的作用。2. IF-2：使fmet-tRNA结合mRNA及核糖体。IF2先与GTP结合，再结合fmet-tRN

15、A，生成fmet-tRNA-IF2-GTP复合物，同时推动mRNA在30S亚基上移动，使fmet-tRNA到达P位，是一个耗能过程。3. IF-3：翻译起始时IF3结合到核糖体30S亚基靠近50S亚基的边界，使大小亚基拆离。34（二）肽链的延长1. 第一步：进位；2. 第二步：成肽；3. 第三步：转位。351. 肽链延长的第一步：进位。36EF-Ts催化GDP-GTP交换，使EF-TuGDP变成EF-TuGTP才能重新参与下一轮反应。 EF-Tu、EF-Ts3738TuTsGTPGDPAUG53TuTs392. 肽链延长的第二步：成肽在转肽酶的催化下，P位上的tRNA所携的甲酰蛋氨酰基转移给A

16、位上的新进入的氨酰-tRNA，形成肽链。原在P位上的、脱去甲酰蛋氨酰基的tRNA从复合物中迅速脱落，使P位留空。403. 肽链延长的第三步：转位在转位酶/延长因子G（EF-G）的催化下，在A位的二肽连同mRNA从A位进入P位。实际是整个核糖体的相对位置移动。第三位氨基酸按密码的指引进入A位注册，开始下一轮循环。41fMetAUG53fMetTuGTP42进位转位成肽43肽链合成到一定长度的同时，在蛋氨酸氨基肽酶的作用下，氨基端的蛋氨酸残基从肽链上被水解脱落。在肽链延长阶段，每生成一个肽键需要从2分子高能磷酸键（进位和转位时各一）获得能量，即消耗2分子GTP。考虑到氨基酸活化生成氨酰-tRNA时

17、，已消耗了2分子高能磷酸键，所以在蛋白质合成过程中，每生成一个肽键，实际上共消耗4分子高能磷酸键。44延长因子（Elengation Factor，EF）1. EF-Tu：按mRNA编码序列携带氨酰-tRNA进入A位。2. EF-Ts：使EF-Tu和GTP再生，参与肽链延长。3. EF-G：具有转位酶活性，使肽酰-tRNA从A位转移到P位。45（三）肽链合成的终止终止密码子的辨认；肽链从肽酰-tRNA水解出来；mRNA从核糖体中分离；大小亚基的拆开。46UAG53RFCOO-47释放因子（RF，RR）释放因子（release factor，RF）：辨认终止密码子和促进肽链C端与tRNA 3-O

18、H酯键的水解，使肽链从翻译中的核糖体上释放下来。（1）RF-1：辨认UAA和UAG，进入A位。（2）RF-2：辨认UAA和UGA，进入A位。（3）RF-3：激活核糖体上的转肽酶。转肽酶受RF3作用后发生变构，表现出酯酶的水解活性，水解肽酰-tRNA的酯键，使P位上的肽与tRNA分离。核糖体释放因子（RR）：使tRNA、mRNA及RF均从核糖体脱落。48在IF的作用下，核糖体大、小亚基分离，它们可再进入翻译过程，循环使用。49Question：合成20 aa的多肽需要消耗多少分子的高能磷酸键的能量？2 + 1 + 194 7950（一）mRNA自身结构。1. 翻译起始密码子及两端侧翼序列；SD序

19、列及两端侧翼序列。（通常，SD序列的中心碱基与其下游起始密码子之间保持8个核苷酸距离时，被最有效翻译。这个区段突变会显著降低翻译效率。）2. 翻译起始区（TIR）。该区域的分子内碱基配对会影响SD序列的功能。3. mRNA的密码子。（丰富tRNA识别密码子和稀有tRNA识别密码子）六、翻译的调节（S）51（二）反义RNA：同某种天然的mRNA反向互补的RNA分子。其由转录产生，可用来阻止细胞中存在的与之互补mRNA的转译活性。（反义寡核苷酸；反义技术学）（三）可以与SD序列结合并阻断其功能的蛋白质。E. coli的核糖体蛋白质，即r蛋白质。（四）抗菌素。（见表：翻译的抑制因子）52抑制因子活性

20、作用方式原核生物真核生物细胞质线粒体氯霉素+-+同50S核糖体亚基结合，阻断肽链的延长红霉素（及其它的大环内酯类抗菌素）+-+同50S核糖体亚基结合，阻断肽链的延长四环素+-+同30S核糖体亚基结合，阻断A位点放线菌酮-+-同60S核糖体亚基结合，阻断肽链的延长嘌呤霉素+同核糖体大亚基A位点结合，导致肽链成熟前终止延长链霉素（及其它的氨基糖苷类抗菌素）+同核糖体小亚基结合，阻断肽链合成的起始及延长稀疏霉素+阻断肽基转移酶的活性翻译的抑制因子53第二节 蛋白质合成后的定向输送蛋白质靶向（定向）输送：蛋白质合成后定向到达其执行功能的目标地点。54a：单体蛋白 b：寡聚体蛋白c：纤维蛋白d：线粒体和

21、叶绿体中的蛋白e：过氧化物酶体中的蛋白f：细胞核中的蛋白g：质膜蛋白i：分泌到细胞外的蛋白j：溶酶体中的蛋白蛋白质的合成与转运55蛋白质合成后的去向1. 在细胞质基质中完成多肽链的合成：（1）细胞质基质的特点部位。（2）转运至膜围绕的细胞器，如线粒体（或叶 绿体）、过氧化物酶体、细胞核。（3）最近发现有些还可转运至内质网中。2. 蛋白质合成起始后转移至糙面内质网，新生肽边合成边转入糙面内质网腔中，随后经高尔基体转运至：（1）溶酶体。（2）细胞膜。（3）分泌到细胞外。56几种典型的蛋白分选信号序列57（一）蛋白质移位装置的必需组合（二）蛋白质跨膜移位的机制分泌性蛋白质的转运系统：信号假说581.

22、 信号肽（signal peptide）：分泌蛋白新生肽链N端的一段1530个氨基酸残基组成的肽段，含有较大比例的疏水性氨基酸残基。信号肽似乎没有严格的专一性，目前尚未发现共同的信号序列。信号肽将分泌蛋白引导进入内质网，同时这个肽段被切除。信号肽的一级结构（一）蛋白质移位装置的必需组合592. 信号识别颗粒（signal recognition particle，SRP）：一类游离在细胞质的核蛋白颗粒，由一条单一的7S-rRNA分子和6条多肽链组成，每条多肽链都具有丰富的碱性氨基酸。SRP的作用是识别新生肽链上的信号肽并与之结合。3. SRP受体（SRP-R）：又称停泊蛋白（docking p

23、rotein，DP），是一种内质网膜整合蛋白，分子量72kDa，为一个异源二聚体，由1条链和1条链组成，这两条链均具有GTP酶活性区域。4. 通道蛋白/移位子（translocon）：嵌附在内质网上的一种蛋白复合体，与形成蛋白质穿越内质网的管道直接相关。60（二）蛋白质跨膜移位的机制1. SRP对信号序列的识别2. SRP与SRP-R的识别3. 蛋白质通道的形成4. 蛋白质进入内质网管腔61分泌性蛋白在内质网上合成过程的图解621. SRP对信号序列的识别信号肽序列一旦从核糖体大亚基的狭小通道中浮现出来，细胞质中的SRP能迅速识别信号肽并与之结合，形成复合体，引起肽链延长的暂时终止。632.

24、SRP与SRP-R的识别SRP能特异性地被位于内质网膜上的SRP-R所识别，并迅速结合，核糖体即附着于内质网上。643. 蛋白质通道的形成一旦SRP与SRP-R结合之后，即引起SRP-54的GTP酶活性区域和SRP-R的两个亚基上的GTP酶活性区域被激活，进而引起SRP从核糖体上释放出来，SRP-R将核糖体转附在通道蛋白-移位子（translocon）上。654. 蛋白质进入内质网管腔随着多肽链的延长，信号肽被信号肽酶水解，新生肽链进入内质网管腔。翻译到达终止密码子时，核糖体从mRNA上脱落，蛋白质整条多肽链完全进入内质网管腔中。66第三节 蛋白质合成后的加工与修饰一、 一级结构的加工与修饰-

25、共价修饰（一）蛋白质前体的剪切（二）氨基酸侧链的共价修饰（三）去除N-甲酰基或N-蛋氨酸（脱甲酰基酶、氨基肽酶）（四）水解修饰二、高级结构的加工与修饰（一）蛋白质折叠（二）蛋白质亚基的聚合（三）辅基链接67（一）蛋白质前体的剪切-信号肽、前导肽或插入肽的剪切人胰导素一级结构68前胰岛素原胰导素原胰导素信号肽C肽胰导素的成熟过程信号肽：使多肽链转入内质网腔。C肽：使A链和B链间的半胱氨酸间形成正确的二硫键。69C肽（S）胰岛素原在酶的作用下被分解为三段，前后两段又重新联接，成为有A链和B链组成的胰岛素，中间一段独立出来，称为C肽。 70C肽与胰岛素的关系（S） 以等分子数共存于分泌颗粒并同时释放

26、至毛细血管循环中，且C肽不被肝脏破坏，半衰期较胰岛素明显为长，故测定血循环中C肽水平能反映细胞合成与释放胰岛素的功能。 7120种氨基酸-约120种氨基酸衍生物（大多通过aa侧链的共价修饰）1. 羧基化（Pro、Lys）2. 磷酸化（Ser、Thr、Tyr）3. 乙酰化4. 甲基化5. 二硫键的形成（多肽链内或链间）（二）氨基酸侧链的共价修饰72阿片促黑皮质素原（POMC，265 aa）促肾上腺皮质激素（ACTH，39 肽）-促黑激素（-MSH，18肽）-内啡肽（11肽）- 脂酸释放激素（ -LT，91肽）（四）水解修饰（在真核细胞中，一条多肽链经翻译后加工可产生多种不同活性的蛋白质或肽）73（一）蛋白质折叠促进蛋白质折叠的大分子1. 分子伴侣（molecular chaperon）2. 蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase， PDI） 3. 肽基脯氨酰异构酶（peptidyl-proplyl isomerase， PPI）74分子伴侣（molecular chaperon）：一