肿瘤细胞的培养方法

1、肿瘤细胞的培养方法肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。 一、组织培养肿瘤细胞生物学特性 肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点： （）形态和性状 培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰

2、，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。 （二）生长增殖 肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（25）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相

3、互重叠向三维空间发展，形成堆积物。 （三）永生性 永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代

4、生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat1、10T1/2等细胞证明，永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。（四）浸润性 浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。 （五）异质性 所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织；处于瘤体周边区的细胞获得血液供应多，增殖旺盛，中心区有的

5、细胞衰老退化，有的处于周期阻滞状态，那些呈活跃增殖状态的细胞称干细胞（Stem Cells）、只有这些干细胞才是支持肿瘤生长的成分。肿瘤干细胞培养时易于生长增殖；把干细胞分离出来的培养方法称干细胞培养。 （六）细胞遗传 大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞系和数个亚系，并不断进行着适应性演变。 （七）其它 肿瘤细胞在体外不易生长的原因可能由于： 依赖性：肿瘤细胞虽有较强克隆生长力，但仍有一定的群体性或与其它细胞相依存关系。一是肿瘤细胞与肿瘤细胞的相互依存，二是肿瘤细胞与基质成纤维细胞的依赖。体外分散培养和排除成纤维细胞后也会同

6、时消除或减弱这些依存关系，可能影响癌细胞增殖生长的活性； 肿瘤细胞的自泌也会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力； 并非所有肿瘤细胞都有强的生长活力和长的Life Span，只有干细胞才有强的增殖生长能力，但这些细胞数量很少； 离体培养肿瘤细胞可能需求与体内相似的特殊生存条件。 二、培养方法 肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。 1取材： 人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有

7、退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4中，但不宜栽过24小时。 2培养基： 肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之

8、间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。有的还需特异性生长因子如乳腺癌细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。 3成纤维细胞的排除： 成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法（表21）。 表21 抑制成纤维细胞生长因素方法 因素 组织细胞 选择性附着 选择性附着底物 汇合饲细胞层 选择性培养基 胰蛋白酶 胶原酶 聚丙烯酰胺 聚四氟乙烯（Teflon） 胶原（猪皮） 小鼠3T

9、3 人胎小肠 D-缬氨酸（Valine） MCDB-710 MCDB-153 Phenobarbitone 胚胎小肠、心肌、表皮 乳癌 各种肿瘤 转化细胞 表皮细胞 表皮 正常和恶性乳腺上皮 结肠癌 肾组织 乳腺 表皮 肝细胞 注：上表结果为个别实验室经验，仅供参考 三、成纤维细胞排除法 1机械刮除法： 是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热烧灼器刮除）。刮除程序为： （1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位； （2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除

10、无标记空间； （3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞； （4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止 2反复贴壁法： 根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。 （1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks 冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液； （2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。置温箱中静止培养520分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向

11、A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养； （3）培养B瓶中细胞520分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。 当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。 3消化排除法： 此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是： （1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化； （2）把消化液吸入离心管中，离心去

12、上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。 4胶原酶消化法： 本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。 （1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化； （2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。 5其它方法： 有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.0251.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液

13、后，在23中800g离心 10分种。在比重1.0251.050层为成纤维细胞，在比重1.0501.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。 选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。 四、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率措施 根据人们的经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。当肿瘤组织或细胞初代接种培养后，常出现以下几种情况：完全无细胞游出或移动； 有细胞移动和游出，但无细胞增殖，细胞长时间处于停滞状态以致难以传代； 有细胞增殖，传若干代后停止生长或衰退死亡； 传数代后细胞增

14、殖缓慢，经过一段停滞期后，才又呈旺盛生长状态，形成稳定生长的肿瘤传代细胞系。以上现象说明肿瘤细胞对体外生存条件有较高的要求，并需经过对新环境的适应才能生长，因此欲获得好的培养效果，不能局限于一般培养法，必须采用一些特殊的措施。 1适宜底物：把经过纯化的细胞接种在不同的底物上，如鼠尾胶原底层、饲细胞层等。 2生长因子：应用促细胞生长因子，向培养液中增加一种或几种促细胞生长因子。根据细胞种类不同选用不同的促生长物，常用有胰岛素、氢化可的松、雌激素以及其它生长因子。 为提高肿瘤细胞对体外培养环境的适应力和增加有活力癌细胞（干细胞）的数量，可采用动物体转嫁接种成瘤后，再从动物体内取出进行培养，能提高体

15、外培养的成功率。受体动物以裸鼠最好。 3.动物体媒介培养方法： （1）瘤块接种：取新鲜瘤组织，用Hanks液洗净血污，切成13毫米小块，用穿刺针头吸一小瘤块，用酒精棉球擦拭动物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤块； （2）饲养观察，待肿瘤生长达较大体积后，剥取出瘤组织； （3）进行体外培养。 （4）为防止失败，仍取部分瘤组织继续在裸鼠体内传代。通过裸鼠媒介接种，有活力的肿瘤细胞数量增多，细胞培养易于成功。 肿瘤细胞培养方法与培养正常细胞完全相同，但成功率比正常细胞高。 五、体外培养肿瘤细胞生物学检测 一旦培养的肿瘤细胞生长成形态上单一的细胞群体或细胞系（或株）后，不论用于实验研究还是建立细胞系，都需

16、要做一系列的细胞生物学测定，主要的目的在于求得证明： 所培养的细胞系的确来源于原体内具有恶性的细胞，而非正常细胞或其它细胞。均具有瘤种特异性。阐明一般生物学性状。测定项目数量无明确规定，根据需要而定，以下为常做的项目和要点。 【形态观察】主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。 【细胞生长增殖】检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。 【细胞核型分析】检测核型特点，染色体数量、标记染色体的有无、带型等。 【凝集试验】检测凝集力。 【软琼脂培养】检测集落形成能力。 【异体动物接种】向异体动物体内（皮下）接种细胞悬液，

17、观察成瘤能力。 【其它】除上述项目外，根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析，荧光显微镜观察等。 在上述肿瘤细胞生物学检测中，最主要的为：异体动物（以用裸鼠为上）接种成瘤、软琼脂培养、核型分析、细胞骨架和电镜观察等几项。当然从分子细胞学角度考虑尚应做癌基因和抗癌基因等的检测，这些项目将在本书第二篇中介绍。 六、对肿瘤细胞系或细胞株的评价 已建成的各种肿瘤细胞系或细胞株，无疑都是可用的实验对象。近年我国已建成的肿瘤细胞系已非常多，并获得越来越广泛的应用。但根据研究者的经验，在使用这些细胞系时，应持特别审慎态度，主要是应考虑到这些细胞在长期传代中有否发生遗传性改变的可能。众所周知，长期传代细胞

18、系染色体核型常是不稳定的。另外也可能发生如基因突变、基因易位或缺失等变化。其结果可能导致细胞产生生物学性状上的变动。以近年建成的各种肿瘤细胞系为例，都已传代少则几十，多则百代以上后，才确认建成了细胞系。这种情况下很难保证细胞从初代到建成时的性状仍是一致的。 已如前述，癌细胞在培养中并非能很顺利地传下去，凡已长期传代的细胞系，都已获得不死性。当前尚未完全确证所有癌细胞都具有不死性；因此尚难肯定在长期培养中的癌细胞的生物学性状与体内时仍完全相同（包括不死性）。据上述对用癌细胞系所获实验结果应尽量做分析性的结论，避免做概括性的与体内等同的结论，外推与体内等同更是不妥的。广泛来说，应用各种较长时间培养

19、细胞做实验时，都应如此。199细胞培养基（粉末型）成分序号 化合物名称 含量 (mg/L) 序号 化合物名称 含量 (mg/L) 1 无水氯化钙 185.00 31 维生素 D 2 0.010 2 硝酸铁 .9H 2 O 0.72 32 氯化胆碱 0.500 3 氯化钾 400.00 33 叶酸 0.010 4 无水硫酸镁 97.67 34 肌醇 0.050 5 乙酸钠 50.00 35 维生素 K 0.016 6 氯化钠 6800.00 36 烟酰胺 0.025 7 无水磷酸二氢钠 122.00 37 烟酸 0.025 8 L-丙氨酸 50.00 38 对氨基苯甲酸 0.050 9 L-盐酸

20、精氨酸 70.00 39 泛酸钙 0.010 10 L-门冬氨酸 60.00 40 盐酸吡哆醇 0.025 11 L-盐酸半胱氨酸 0.11 41 盐酸吡哆醛 0.025 12 L-盐酸胱氨酸 26.00 42 维生素 A醋酸盐 0.100 13 DL-谷氨酸 133.60 43 核黄素 0.100 14 L-谷氨酰胺 100.00 44 盐酸硫胺 0.010 15 甘氨酸 50.00 45 D 2 -磷酸生育酚钠盐 0.010 16 L-盐酸组氨酸 21.88 46 硫酸腺嘌呤 10.00 17 L-羟脯氨酸 10.00 47 腺嘌呤三磷酸 1.00 18 DL-异亮氨酸 40.00 48

21、腺嘌呤一磷酸 0.2385 19 DL-亮氨酸 120.00 49 胆固醇 0.200 20 L-盐酸赖氨酸 70.00 50 脱氧核糖 0.500 21 DL-甲硫氨酸 30.00 51 葡萄糖 1000 22 DL-苯丙氨酸 50.00 52 还原谷胱甘肽 0.050 23 L-脯氨酸 40.00 53 盐酸鸟嘌呤 0.300 24 DL-丝氨酸 50.00 54 次黄嘌呤 0.300 25 DL-苏氨酸 60.00 55 吐温 80 5.00 26 DL-色氨酸 20.00 56 核糖 0.500 27 L-酪氨酸.钠盐 57.66 57 胸腺嘧啶 0.300 28 DL-缬氨酸 50.

22、00 58 尿嘧啶 0.300 29 维生素 C 0.0566 59 黄嘌呤钠盐 0.300 30 D-生物素 0.010 60 酚红 20.00 199(无酚红)细胞培养基（粉末型）成分序号化合物名称含量 (mg/L)序号化合物名称含量 (mg/L)1无水氯化钙185.0031维生素 D 20.0102硝酸铁 .9H 2 O0.7232氯化胆碱0.5003氯化钾400.0033叶酸0.0104无水硫酸镁97.6734肌醇0.0505乙酸钠50.0035维生素 K0.0166氯化钠6800.0036烟酰胺0.0257无水磷酸二氢钠122.0037烟酸0.0258L-丙氨酸50.0038对氨基苯

23、甲酸0.0509L-盐酸精氨酸70.0039泛酸钙0.01010L-门冬氨酸60.0040盐酸吡哆醇0.02511L-盐酸半胱氨酸0.1141盐酸吡哆醛0.02512L-盐酸胱氨酸26.0042维生素 A醋酸盐0.10013DL-谷氨酸133.6043核黄素0.10014L-谷氨酰胺100.0044盐酸硫胺0.01015甘氨酸50.0045D 2 -磷酸生育酚钠盐0.01016L-盐酸组氨酸21.8846硫酸腺嘌呤10.0017L-羟脯氨酸10.0047腺嘌呤三磷酸1.0018DL-异亮氨酸40.0048腺嘌呤一磷酸0.238519DL-亮氨酸120.0049胆固醇0.20020L-盐酸赖氨酸

24、70.0050脱氧核糖0.50021DL-甲硫氨酸30.0051葡萄糖100022DL-苯丙氨酸50.0052还原谷胱甘肽0.05023L-脯氨酸40.0053盐酸鸟嘌呤0.30024DL-丝氨酸50.0054次黄嘌呤0.30025DL-苏氨酸60.0055吐温 805.0026DL-色氨酸20.0056核糖0.50027L-酪氨酸.钠盐57.6657胸腺嘧啶0.30028DL-缬氨酸50.0058尿嘧啶0.30029维生素 C0.056659黄嘌呤钠盐0.30030D-生物素0.010199(无血清)细胞培养基（粉末型）成分序号化合物名称含量 (mg/L)序号化合物名称含量 (mg/L)1D

25、水氯化钙.2H 2 O265.0032维生素 D 20.0102硝酸铁 .9H 2 O0.3033氯化胆碱0.5003氯化钾400.0034叶酸0.0104无水硫酸镁97.6735肌醇0.0505乙酸钠50.0036维生素 K0.0166氯化钠6800.0037烟酰胺0.0257无水磷酸二氢钠122.0038烟酸0.0258硫酸锌0.1039对氨基苯甲酸0.0509L-丙氨酸25.0040泛酸钙0.01010L-盐酸精氨酸150.0041盐酸吡哆醇0.02511L-门冬氨酸30.0042盐酸吡哆醛0.02512L-半胱氨酸4.0043维生素 A醋酸盐0.10013L-盐酸胱氨酸43.844核黄

26、素0.10014L-谷氨酸75.0045盐酸硫胺0.01015L-谷氨酰胺300.0046D 2 -磷酸生育酚钠盐0.01016甘氨酸100.0047硫酸腺嘌呤10.0017L-盐酸组氨酸40.0048腺嘌呤三磷酸1.0018L-羟脯氨酸10.0049胆固醇0.20019L-异亮氨酸20.0050脱氧核糖0.50020L-亮氨酸60.0051无水半乳糖1000.0021L-盐酸赖氨酸70.0052葡萄糖2000.0022L-甲硫氨酸15.0053还原谷胱甘肽0.05023L-苯丙氨酸25.0054盐酸鸟嘌呤0.30024L-脯氨酸40.0055次黄嘌呤0.30025L-丝氨酸25.0056酚红

27、钠11.0026L-苏氨酸30.0057吐温 805.0027L-色氨酸10.0058丙酮酸钠150.0028L-酪氨酸二钠盐116.0059核糖0.50029L-缬氨酸25.0060胸腺嘧啶0.30030维生素 C0.05061尿嘧啶0.30031D-生物素0.01062黄嘌呤钠0.300DMEM(A) 细胞培养基（粉末型）成分序号化合物名称含量 (mg/L)序号化合物名称含量 (mg/L)1无水氯化钙 .2H 2 O265.0018L-丝氨酸42.002硝酸铁 .9H 2 O0.1019L-苏氨酸95.003氯化钾400.0020L-色氨酸16.004无水硫酸镁97.6721L-酪氨酸72

28、.005氯化钠6400.0022L-缬氨酸94.006无水磷酸二氢钠109.0023D-泛酸钙4.007丁二酸75.0024酒石酸胆碱7.208丁二酸钠100.0025叶酸4.009L-盐酸精氨酸84.0026肌醇7.2010L-盐酸胱氨酸63.0027烟酰胺4.0011甘氨酸30.0028核黄素0.4012L-盐酸组氨酸42.0029盐酸硫胺4.0013L-异亮氨酸105.0030盐酸吡哆辛4.0014L-亮氨酸105.0031葡萄糖1000.0015L-盐酸赖氨酸146.0032丙酮酸钠110.0016L-甲硫氨酸30.0033酚红9.30.0017L-苯丙氨酸66.00DMEM(H) 细

29、胞培养基（粉末型）成分序号化合物名称含量 (mg/L)序号化合物名称含量 (mg/L)1无水氯化钙200.0017L-丝氨酸42.002硝酸铁 .9H 2 O0.1018L-苏氨酸95.003氯化钾400.0019L-色氨酸16.004无水硫酸镁97.6720L-酪氨酸钠盐104.005氯化钠6400.0021L-缬氨酸94.006无水磷酸二氢钠125.0022D-泛酸钙4.007L-盐酸精氨酸84.0023氯化胆碱4.008L-盐酸胱氨酸63.0024叶酸4.009L-谷氨酰胺584.0025肌醇7.2010甘氨酸30.0026烟酰胺4.0011L-盐酸组氨酸42.0027核黄素0.4012

30、L-异亮氨酸105.0028盐酸硫胺4.0013L-亮氨酸105.0029盐酸吡哆辛4.0014L-盐酸赖氨酸146.0030葡萄糖4500.0015L-甲硫氨酸30.0031丙酮酸钠110.0016L-苯丙氨酸66.0032酚红15.00DMEM(L) 细胞培养基（粉末型）成分序号化合物名称含量 (mg/L)序号化合物名称含量 (mg/L)1无水氯化钙200.0017L-丝氨酸42.002硝酸铁 .9H 2 O0.1018L-苏氨酸95.003氯化钾400.0019L-色氨酸16.004无水硫酸镁97.6720L-酪氨酸钠盐104.005氯化钠6400.0021L-缬氨酸94.006无水磷酸

31、二氢钠125.0022D-泛酸钙4.007L-盐酸精氨酸84.0023氯化胆碱4.008L-盐酸胱氨酸63.0024叶酸4.009L-谷氨酰胺584.0025肌醇7.2010甘氨酸30.0026烟酰胺4.0011L-盐酸组氨酸42.0027核黄素0.4012L-异亮氨酸105.0028盐酸硫胺4.0013L-亮氨酸105.0029盐酸吡哆辛4.0014L-盐酸赖氨酸146.0030葡萄糖1000.0015L-甲硫氨酸30.0031丙酮酸钠110.0016L-苯丙氨酸66.0032酚红15.00实验一 动物细胞培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，

32、在体外进行培养使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的些变化。细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外

33、培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。本实验分两次进行即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。清洗与灭菌一、实验目的能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。二、实验原理清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留01个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用

34、不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。三、实验材料、用品材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为022m，微孔滤膜(直径90)：孔径为022 m，过滤器(直径25)。药品：70或75酒精，01新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，05过氧乙酸，乳酸，37甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC水体积分数01的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)。仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。四、实验步骤(一)清洗1新玻璃器皿的清洗先

35、用自来水刷洗，再浸泡5稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。2使用过的玻璃器皿的清洗(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。(3)浸酸性洗液过夜。(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗1015次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。 (5)包装(牛皮纸或一般纸)。 (6)高压(15磅20 min)或干热(1702 h)灭菌。(7)贮存备用。 3胶塞的处理 (1)新胶塞应先用清水清洗之后再用02NaOH煮沸lO-20 min。 (2)自来水清洗10次。 (3)再用1稀盐酸浸泡30 min。 (4)自来水清洗10次，蒸馏水涮

36、洗3次。晾干，高压灭菌(见(二)消毒与灭菌)。旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。（二）消毒1物理消毒法 (1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。 (2)干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160，保温90120 min。用于RNA提取实验的用品则需180，保温58 h。 (3)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及

37、加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20SSC等)。手动高压灭菌锅操作如下： 首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。加热高压锅。将放气阀打开，放气510 min，以排除锅内的冷空气。 待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用15磅(121)30 min，胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 )20 min。调节火力大小保持该压力。停止加热，待压力自然下降至0再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。 电热自动灭菌锅使用说明(型号：SANYO Autoclave MLS-3020)： 放气筒加水至LOW水平线处，将与高压锅相连的导气管插入放气筒里，然

38、后将放气筒归于原位。 打开高压锅盖，加入蒸馏水至高压锅底的水位线，水位线位于V型凹槽的1323处。 打开电源。 设定高压温度及时间，高压锅的温度范围为105121，高压灭菌一般采用1212030 min。 把待高压的物品置于高压锅内，顺时针方向将exhaust钮旋至close位置。 关闭高压锅盖，旋至显示屏上左上角的红亮点刚出现为止。按start钮，开始高压，在温度达80时显示器开始显示温度，当温度达到所需的设定温度时，在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮，直到高压时间结束后指示灯灭，此时蜂鸣器报警一声。当压力降至0 MPa时，蜂鸣器再报警一声。温度降至80时，蜂鸣器报警10次。显示屏温度指示

39、消失，此时才可打开锅盖。 关电源，开高压锅盖，取出已灭菌的物品，烘干。 (4)滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径90 mm、100 mm、142 mm等)，配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径20 mm、25 mm等)。滤膜孔径有060 m、045 m、035 m、022 m、010m等，以022 m除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为022m。用

40、布包好，湿热灭菌后使用。 2化学消毒法 常用的消毒液有如下几种：(1)70(或75)酒精：超净台里常备70酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。(2)01新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有01新洁尔灭溶液的容器及纱布。 (3)来苏儿水(煤酚皂溶液)：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。 (4)05过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。 (5)乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止

41、。将门窗紧闭13 d。可将空气中漂浮的微生物杀死。 (6)37甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。13 d后方可达到消毒空气的目的。 3煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。 五、注意事项1清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗1015次。因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影响下一次使用的效果。 2干热灭菌时，应在

42、白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至100之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。 3高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。4牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS等)。5滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸)，包好，经高压灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大，压力数字以2为宜。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确

43、。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。 6使用化学消毒法时，配制75酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。 六、思考题1哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。2紫外线消毒的适用范围和目的是什么?II、传代细胞培养与观察一、实验目的了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状况二、实验原理传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2

44、以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。所以般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物，做为消化液。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。三、实验用品1、器材解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方

45、瓶或中方瓶)等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，99xl04Pa(15磅)灭菌30min备用。此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。2、试剂L磷酸盐缓冲液(PBs)无钙、镁溶液细胞消化液：o5胰蛋白酶和o4%EDTAEMEM液3%谷氨酰胺o5台盘蓝染液等3、材料喉癌细胞四、实验方法在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。1.营养液配制:EMEM液 90%犊牛血清 10%双抗(1万单位m1) 加至约100单位m1 3谷氛酞胺 1m174NaHCO3

46、调pH至6870 2换液:在酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中的细胞营养液。3.消化与分装在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，轻轻摇动，将溶液倒出。重复上述动作。加入适量消化液（0.02%EDTA或0.04EDTA1ml十o5胰蛋白酶液0.2ml）以盖满细胞为宜，置于室温，停留12min后，翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层是否出现缝隙(针孔大小的空隙)，如出现缝隙，即可倒去消化液；如末出现缝隙，则可将瓶翻回，继续进行消化，直到出现缝隙为让。此时，可倒去消化液，加入新配制的营养液20m1。然后用吸管吸取培养瓶中的营养液，反复吹打瓶壁上的细胞层至瓶壁细胞全部脱落下来为止。此时，可继续轻轻地吹打细胞悬液，以使细胞

47、散开。随之进行分装。4培养分装好的细胞瓶上，做好标志，注明细胞代号、日期。置于培养架上，轻摇使细胞均匀分布，以免堆积成团。然后置于37培养。5.观察(1)观察体外培养细胞的几个问题；细胞培养24h后，即可进行观察，观察的重点如下：A.首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混浊度B.观察培养姬颜色变化及细胞是否生长。C.如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时可参照(2)的描述进行。D观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。(2)细胞的生长阶段及其形态特征传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的

48、情况。般中层培养的细胞，从培养开始，经过生长、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为地将具分为5个时期，但各期间无明显绝对界限。现分别描述如下：A游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时细胞多为圆形，折光率高，此期可延续数h。B吸附期(贴壁)：由于细胞的附壁持性，细胞悬液静置培养一段时间(约78h)后，便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同)。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。C.繁殖期：培养l2h以后直到72h，细胞进入繁殖

49、期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到细胞铺满整个瓶壁(即所谓形成细胞单层)的过程。此期细胞形态为多角形(呈现上皮样细胞的特征)。细胞特点：透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率，又可将其生长状况分为四级。以“十”的多少表示如下：十：细胞占瓶壁有效面积(也就是细胞能生长的瓶壁面积)的25以内有新生细胞。一般要观察35个视野内的细胞生长状况，然后加以综合分析判断。十十：细胞占瓶壁有效面积的2575以内具新生细胞。十十十：细胞占瓶壁有效面积的7595具新生细胞。细胞排

50、列致密。但仍有空隙。十十十十：细胞占瓶壁95以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密，透明度好。从十十一十十十十为细胞的对数增长期(或称为指数增长期)。D维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。E衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙，细胞中颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，

51、细胞皱缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落下来。五、思 考 题1简述细胞传代培养的操作程序及注意乡项。3细胞培养获得成功的关键要素是什么?3简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。实验二 植物细胞组织培养一实验目的 植物细胞和组织培养的技术性强，要求无菌操作，通过本实验可初步掌握常规的组织培养技术，加深对无菌操作的了解。 二实验原理 植物的全能性：植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力，称为植物的全能性。 植物组织培养就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术。植物组织培养按其原始意义，就是指愈伤组织培养。但发展至今，其范围日益扩大，已包括植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质

52、体的离体无菌培养。因此，拥有几种不同水平的培养技术，即整体的、器官的、组织的、细胞的和原生质的培养技术。本实验选择豌豆为材料，豌豆（Pisum sativum）属豆科植物，是粮食、饲料和重要的蔬菜作物，也是遗传学家和植物生理学家感兴趣和乐于采用的实验植物，豌豆的根、茎、子叶、下胚轴、上胚轴、花芽等外植体，皆可形成愈伤组织，其中茎尖、幼胚、幼叶等器官可成功的再生成植株。茎尖培养可包括小至十几微米的茎尖分生组织（生长点）和大至几十毫米的茎尖或更大的芽培养。在实践应用上，常采用生长点的培养使患病植物去病毒，以达到挽救优良品种，提高产量和质量之目的。三实验材料 仪器设备：1酒精灯、三角烧瓶，培养皿；2

53、镊子、剪刀、剖针；3双筒解剖显微镜；4光照培养箱或温室；材料 烟草无菌苗、豌豆幼苗。试剂（1）MS培养基，植物激素：NAA、6-BA等；（2）饱和漂白粉液（次氯酸钠）；（3）70%酒精、100%酒精、酒精棉球；（4）无菌水 四实验步骤 豌豆苗的茎尖培养 取发芽6天的豌豆幼苗10株，简取1厘米左右的茎尖，浸入70%的酒精中1分钟，再浸入饱和次氯酸钠溶液中消毒15分钟，（此步以后要求无菌）用无菌水中冲洗5次，在灭菌的滤纸上吸干水分，放入灭菌的培养皿中。 在双目解剖镜下，用灭菌的解剖针剥去幼叶露出生长锥，用灭菌的解剖针挑取带着两至三个叶原基的生长锥。 将挑好的茎尖移到MS+10.7mol/L萘乙酸(

54、NAA)+4.4mol/L 6-苄基腺嘌呤（6-BA）的培养基上诱导愈伤组织形成，用封口膜将培养皿封好。（4）在恒温培养箱中，26下,培养六周，形成愈伤组织，经继代后，可用于生根培养实验三 酵母菌细胞融合实验一、实验目的学习酵母菌原生质体制备和再生技术，为了解酵母菌为材料的外源基因转移等技术奠定基础。二、实验原理酵母菌如酿酒酵母，在遗传学和分子生物学的研究中有很大作用，尤其是近些年来，随着科技的进步，酵母菌的遗传操作如转化、基因克隆和外源基因在酵母受体中的表达等技术都有了突破性的进展。作为受体系统的酵母菌原生质体在这些技术中有独特的地位。这种经溶菌酶处理脱壁后的细胞（脱壁不完全者称原生质球）既可以作为不同种属间细胞融合的母体，实现细胞器等大结构的转移，又可作为外源基因转移的受体，大大提高基因转移的效率。这些新技术不仅促进了酵母菌遗传学的发展，而且很多已应用到构建新的酿酒业酵母。本实