中药透骨草有效成分和药理活性研究分析 药学专业

1、目录 HYPERLINK l _Toc17325 摘 要1 HYPERLINK l _Toc24011 Abstract3 HYPERLINK l _Toc3835 前 言4 HYPERLINK l _Toc6077 第一章 中药透骨草的研究概况5 HYPERLINK l _Toc6065 1.8.6 治疗瘢痕疙瘩17 HYPERLINK l _Toc15257 1.8.7 中药透骨草药的其他应用17 HYPERLINK l _Toc19785 第二章 中药透骨草的生药学研究18 HYPERLINK l _Toc9712 2.1 中药透骨草原植株的鉴别19 HYPERLINK l _Toc84

2、57 2.2 中药透骨草的性状鉴定19 HYPERLINK l _Toc22019 2.3 中药透骨草的薄层色谱鉴别20 HYPERLINK l _Toc25591 2.4 中药透骨草的检查21 HYPERLINK l _Toc5217 2.5 中药透骨草的浸出物21 HYPERLINK l _Toc4482 第三章 中药透骨草化学成分的研究22 HYPERLINK l _Toc22384 3.1 中药透骨草化学成分的提取、分离22 HYPERLINK l _Toc21602 3.2 化合物结构鉴定27 HYPERLINK l _Toc7502 第四章 HPLC法分析中药透骨草化学成分28 H

3、YPERLINK l _Toc16244 4.1 中药透骨草总皂苷的提取与含量测定28 HYPERLINK l _Toc28078 4.2 中药透骨草中槲皮素的含量测定32 HYPERLINK l _Toc17070 第五章 GC-MS分析中药透骨草化学成分36 HYPERLINK l _Toc2967 5.1实验材料、试剂和仪器37 HYPERLINK l _Toc25680 5.2实验方法37 HYPERLINK l _Toc24118 5.3实验步骤38 HYPERLINK l _Toc18688 5.4结果与讨论38 HYPERLINK l _Toc4384 第六章 中药透骨草总黄酮的

4、研究39 HYPERLINK l _Toc10617 6.1 材料和方法39 HYPERLINK l _Toc12210 6.2 结果与讨论42 HYPERLINK l _Toc2797 6.3 小结45 HYPERLINK l _Toc23671 第七章 中药透骨草抑菌活性的研究46 HYPERLINK l _Toc30549 7.1实验材料、仪器及试剂46 HYPERLINK l _Toc3260 7.2实验方法47 HYPERLINK l _Toc7475 7.3实验结果49 HYPERLINK l _Toc12727 7.4小结50 HYPERLINK l _Toc15011 第八章

5、结论与展望51 HYPERLINK l _Toc17385 8.1 结论52 HYPERLINK l _Toc5543 8.2 展望52中药透骨草有效成分和药理活性研究摘 要目的由于在2010版中国药典中还没有收录关于中药透骨草的有关内容但民间又经常拿它来治“风湿麻痹等”病痛考虑到用药安全等相关问题笔者决定对其展开初步探究通过以透骨草化学成分的研究为基础对其简单药理活性等展开进一步研究目的在于扩大其在临床上的应用范围并通过理论指导实践这将为透骨草化学成分的研究提供相关参考为开发该类植物资源提供科学依据同时也对拓展中草药资源产生积极影响方法和结果笔者结合所学知识对透骨草做了有关生药学的研究鉴定优

6、选出最佳提取工艺参数并进行提取采用萃取法将提取物分成了极性不同的4个部位并对乙酸乙酯层正丁醇层进行反复硅胶柱层析得到以“熊果酸”为代表的4个单体化合物运用GC-MS法对石油醚层进行分析鉴定得出萜类27.48%含氧有机物16.10%醇类14.91%酮类10.58%其它类9.5%酸类7.86%醛类5.42%酚类5.34%共占总检测量的97.19%用HPLC法优化了各天然产物大类的提取分离及含量测定对样品的抗氧化性及体外抑菌作用做了初步研究结果正丁醇层有较好抗氧化性乙酸乙酯层其次最后为水层和石油醚层其中正丁醇部位还具有良好的抑菌效果对金黄色葡萄球菌作用最强关键词透骨草化学成分提取分离药理活性Anal

7、ysis of active ingredient and pharmacological activity of Chinese medicine TougucaoAbstractobjectiveThe 2010 edition of Chinese Pharmacopoeia, but also not included on Chinese medicine Tougucao, but people also often take it to cure pain, rheumatism, paralysis, etc. .Taking into account the safety o

8、f medication and other related issues, the author decided to start a preliminary inquiry.Through the studying of Tougucao chemical composition as the basis, to further study its simple pharmacological activity.The purpose is to expand the scope of its application in clinical practice.And through the

9、 theory guiding practice.Which will Speranskia tuberculata chemical constituents study and provides reference, provide scientific basis for the development of the plant resources, but also have a positive impact on the development of Chinese herbal medicine resources.methods and resultsThe author co

10、mbines the knowledge of Tougucao, do research, identification of relevant pharmacognosy.Optimal extraction process parameters were selected and extracted, and the extract was divided into 4 parts with different polarity by the extraction method.And the ethyl acetate layer and the butyl alcohol layer

11、 were repeated silica gel column chromatography, and the 4 monomer compounds represented by bear acid were obtained.The petroleum ether layer analysis, identification, it was concluded that: terpenoid 27.48% and oxygen containing organic 16.10%, alcohol 14.91%, ketones 10.58%, other types of 9.5%, a

12、cid 7.86%, aldehydes 5.42%, phenolic 5.34% accounted for 97.19% of total inspection measurement by using GC-MS method.Optimization of extraction, separation and content determination of natural products by HPLC method.The antioxidant activity and antibacterial activity in vitro of the samples were s

13、tudied. The results were: the butanol layer had better oxidation resistance.The ethyl acetate layer is next, the last for the water layer and the petroleum ether layer.The butanol part also had good inhibitory effect on Staphylococcus aureus.Keywords: Tougucaochemical compositionextraction and separ

14、ationpharmacological activity前 言中药材透骨草为全草入药型植物药常被用于中医外科疾病的治疗因其具有清淤消肿活血止痛清热解毒散风祛湿等功效故多用于跌打损伤风湿疼痛淤积疼痛疮疡肿毒痈疽肿痛等目前我国现有透骨草原植物共计有20科42种此外还有5个变种植物在不同地区也作透骨草使用或也被称为透骨草笔者所用透骨草（Phryma leptostachya L.var.asiatica Hara）又被称为接生草老婆子针线等是一种多年生草本植物属透骨草科(Phrymaceae)透骨草属(Phryma)因其喜阴故在草地山坡林下等处随地可见由于在2010版中国药典中还没有收录关于透骨草

15、科透骨草属透骨草的有关内容但民间又经常拿它来治“风湿麻痹等”病痛经过查阅大量期刊文献笔者得出以下结论目前国内外对于透骨草有效成分的研究甚少已有的研究年代过早而且关于透骨草药理作用的研究更为有限考虑到用药安全等相关问题笔者决定对其展开初步探究首先笔者经过查阅大量文献期刊并结合所学药用植物学知识对中药透骨草类植物的种属做了有关生药学的研究鉴定其次对透骨草所含化学成分做了较为系统的探究优选出了最佳提取工艺参数并对其进行提取之后采用萃取法将透骨草所含物质分成极性不同的部位并对其乙酸乙酯层正丁醇层进行了反复硅胶柱层析以“熊果酸”为代表进行了进一步的结构鉴定以及工艺参数的深究接下来采用HPLC法对透骨草中

16、的总皂苷以及槲皮素等进行了含量测定还运用了GC-MS法对其石油醚层部位的挥发油成分进行了更为深入的分析最后还对透骨草的药理活性展开了初步探究对其中所含黄酮类物质进行了抗氧化研究还对透骨草各部位提取物进行了体外抑菌活性的探讨综上所述笔者以透骨草化学成分的研究为基础更进一步的研究了其药理活性等目的是为进一步开发该类植物资源提供有关科学依据同时也对拓展中草药资源起到一定参考意义此外所得的结论对透骨草传统功效的认识有所突破扩大了其在临床上的应用范围对理论和实践具有双重意义第一章 中药透骨草的研究概况1.1 中药透骨草的基源研究中药材透骨草常被用于中医外科疾病的治疗因其具有活血止痛解毒散风祛湿等功效故多

17、用于跌打损伤风湿疼痛淤积疼痛疮疡肿毒痈疽肿痛等 1 目前我国现有透骨草原植物共计有20科42种 2 此外还有5个变种植物在不同地区也作透骨草使用或也被称为透骨草 3 笔者所用透骨草(Phryma leptostachya L.var.asiatica Hara)又被称为接生草老婆子针线等是一种多年生草本植物 4 属透骨草科(Phrymaceae)透骨草属(Phryma)因其喜阴故在草地山坡林下等处随地可见 5 透骨草为全草入药型植物该药材所具备的功效包括清热利湿消肿活血等 6 透骨草科属中只存在透骨草这1种植物在全球范围内透骨草常分布在亚洲喜马拉雅山区以及北美洲的东部该植物在东亚地区常作为植物

18、性农药或用作药材 7 随后该植物相继被报道于朝鲜和日本（Miquel1866）阿穆河流域（Maximowicz1829）中国(Hance1874)越南北部（Dop1935）巴基斯坦北部克什米尔以及印度东北部（Clarke1885）等地区以上文献中所用名均为透骨草 8 1.2 中药透骨草的本草考证传统的中药材透骨草与1593年出版的本草原始里所记载的不大相同 9 李中立所鉴定并记载的透骨草是大戟科植物.地构叶 Speranskia tuberculata（Bunge）Baill的全草 10 滇南本草里记载有中药透骨草为杜鹃花科植物.滇白珠Caultheriayunanensis（Franch）R

19、ehd 11 而近代的东北药植志里所记载的中药透骨草则为与豆科植物.山野豌豆等同科属的多种植物的全草 12 张国栋 13 曾针对透骨草植物的同名异物现象进行了专门的研究迟玉明 14 则通过翻阅大量的文献资料专门对透骨草植物进行了种属的汇总其结果发现目前已知的透骨草植物至少有20科42种5个变种1.3 中药透骨草的性状研究透骨草的主要性状表现为株高在3080cm之间为落叶或常绿灌木全株具有强烈香气气微味微苦枝条较为细长茎长约35cm直径35mm表面显棕红色或黄棕色有纵纹枝条细长左右曲折带红绿色或红色叶片呈卵状距圆形边缘带锯齿略向外卷纸质互生叶背面显青白色有细柔毛花序呈总状腋生花萼裂片数5花冠钟形

20、花白绿色雄蕊数10花药顶部每室有2长芒子房呈球形有毛蒴果呈球形5裂包裹于宿存的黑色肉质花萼中状似浆果种子数多细小呈黄褐色花期为9月 15 在东北的各地区都有种植其主要产区为凌源大连和绥中等地 16 王漩 17 等对铁线透骨草等5种药材分别进行了研究并首次提出了参数RCR（层环直径比）且对其加以运用来区分不同品种的植物金延明 18 等对羊角透骨草等的组织形态进行了研究并对各透骨草品种的构造性状和粉末特征进行了细致深入地描述还指出了依据这些特征可对不同品种的药材进行鉴别郑太坤 19 等对山野豌豆等品种的性状进行了初步的研究结果认为鉴别该类植物的特点主要在其表皮细胞内是否含有色素类物质小叶主茎脉和侧

21、茎脉所呈夹角等鞠爱华 20 也对大叶野豌豆和山野豌豆的部分特征进行了研究其实验结果为鉴别不同品种的透骨草提供了资料依据1.4中药透骨草的解剖学研究从植物解剖学的角度对透骨草的营养体进行研究陆静梅 21 等经研究发现透骨草为喜阴植物一般在林下和山坡等阴湿的地方生长旺盛其茎叶外壁的角质层中存在大量薄壁组织其中髓细胞所占的比例较大茎叶细胞间隙较为发达叶肉的栅栏组织中含有体积较大的叶绿体综合以上性状可得出中药透骨草确为喜阴植物1.5中药透骨草的组织学研究刘羽 22 等运用愈伤组织培养法生根继代培养法和不定芽继代培养法对透骨草植株进行了无性繁殖其实验结果如下采用不定芽继代培养法得到的繁殖系数为5.29/

22、年采用愈伤组织培养法得到的繁殖系数为32.4/年采用生根继代培养法得到的繁殖系数为3.5/年其中属生根继代培养方法的繁殖系数最佳用此法培养出的试管苗中不仅没有无效苗而且其生长速度非常快因此建议工业生产中可试用“生根继代培养法”大量繁殖透骨草植株该项研究不仅证实了透骨草细胞的全能性同时为人工培育透骨草奠定了基础也在避免野生植物资源遭受破坏等方面做出了积极的贡献1.6中药透骨草的化学成分研究中药透骨草的物种来源较为复杂据笔者初步查阅文献统计其共有20科42种5个变种它们都作透骨草用 23 但由于各自产地的不同其相互之间在化学成分上也存在着不同程度的差异总体来看可分为以下几类1.6.1 生物碱甾醇嘧

23、啶有机酸类化合物范云柏 24 等从地构叶（Speranskia tuberculata）的地上部分分离出9种化合物根据其各自的理化性质和波谱学特征被鉴定为软脂酸三十烷醇-谷甾醇香草酸对香豆酸阿魏酸尿嘧啶胸腺嘧啶和loliolide其中阿魏酸以及香草酸具有良好的抗氧化活性以上9种化合物均是首次从该植物中获得的1.6.2 挥发油高海翔 25 等将透骨草干燥的全草粉碎后向其中加入乙醚冷浸再进行水浴回流提取并回收乙醚放冷加水后再进行水蒸气蒸馏最后经GCMS法实验得出结果如下透骨草的挥发油中含较多脂肪酸类化合物其占挥发油总量的27.56%；此外还含有萜类和芳香族化合物此类研究对透骨草的化学成分分类具有重

24、要的参考价值同时还有助于阐明透骨草的药理作用机制透骨草中挥发油的含量很低对挥发油中剩余的24.813%组分再进一步分离鉴定存在一定的困难这将有待于发现特别生理活性之后再进一步深入研究侯冬岩 26 等也报道了利用SDE（蒸馏萃取）装置对透骨草中的挥发性物质进行提取的研究并测得透骨草中挥发油的含量为1.06此外他们还利用GCMS法从透骨草挥发油中分离得到72种化学成分并通过化学工作站的数据处理系统利用“峰面积归一化法”得出各种化学成分在挥发油总量中所占的百分比其中的主要成分包括萜类（占27.48%）含氧化合物（占16.10%）醇类（占14.91%）酮类（占10.58%）其它化合物（占9.50%）酸

25、类（占7.86%）醛类（占5.42%）酚类（占5.34%）共占透骨草中挥发性物质总检出量的97.19%1.6.3 黄酮透骨草中总黄酮含量的测定方法紫外分光光度法以芦丁标准品作为对照测定透骨草总黄酮的含量测定波长510nm实验结果为透骨草总黄酮的平均含量是1.42%其浓度在0.0080.040mg/mL范围内与吸光度之间呈现出较好的线性关系（r=0.9999n=5）且平均回收率高达99.86%（RSD=1.21%，n=6） 27 据查阅大量文献资料发现在透骨草中含量最为丰富的当属木脂素类化合物韩国的SangMyungZee等在透骨草地上部分的乙酸乙酯层中分离得到了熊果酸和透骨草灵（phrymal

26、in-）日本的Yasuyoshi Oshima和Eiji Taniguchi在透骨草的根部分离得到了乙酰透骨草脂素（leptostachyol acetate）透骨草灵（phrymalin-） 28 和透骨草灵 29 紧随其后Fumito Ishibashi和Eiji Taniguchi就合成出了透骨草灵和以及二者的同分异构体除此之外Fumito Ishibashi和Eiji Taniguchi两位学者还合成出了倍半木脂素haedoxao A但其合成条件相对比较严苛且其合成效率较低于透骨草中所分离得出的化合物除了熊果酸其余都为木脂素类化合物其化学结构如图1-1所示图1-1 部分物质的化学结构式

27、1.6.4 其他透骨草类中药的化学成分由于透骨草类植物其药材品种繁多且基源复杂因此该类植物药材中所含有的化学物质的品种及含量也就不尽相同了近年来很多国内外著名学者对不同品种透骨草中所含的化学成分进行了较为深入的研究并分离鉴定出了许多单体化合物而且这些单体化合物中有相当一部分具有较高的生物活性1.6.4.1珍珠透骨草化学成分Yan-Mei li 30 等从珍珠透骨草中分离得到了6种不同的黄酮类化合物其各自分别是香叶木素-573-三羟基木犀草素-5734-四羟基黄酮574-三羟基二氢黄酮-7-O-D-(3-对香豆酰)-吡喃葡萄糖苷4-甲氧基黄酮木犀草素-7-O-芸香糖苷穗花杉双黄酮574-三羟基二

28、氢黄酮-7-O-D-(3-对香豆酰)-吡喃葡萄糖苷目前在此种植物中已分离得到了9种不同的化合物经理化鉴定其各自分别为软脂酸-谷甾醇胸腺嘧啶香草酸对香豆酸三十烷醇阿魏酸以及单萜类化合物 31 石建功 32 等于1999年在地构叶植物的全草中分离得到了18-H(-)-泪柏醇高海翔 33 等则进一步对该植物叶中的挥发油成分进行了提取并通过分离鉴定了其总挥发油成分中所含有的75.087%的单体化合物1.6.4.2羊角透骨草化学成分羊角透骨草为紫葳科植物角蒿Incarvil leasiensis Lam有学者曾运用GC-MS分析法对所含的72种化学成分进行了鉴定发现其中主要包含萜类（27.48%）含氧化

29、合物（16.10%）醇类（14.91%）酮类（10.58%）酸类（7.86%）醛类（5.42%）酚类（5.34%）以及其它种类化合物（9.50%）共占羊角透骨草中挥发油总含量的97.19% 34 1.6.4.3东北透骨草化学成分东北透骨草为山野碗豆Vicia amoena Fisch魏锋 35 等从该植物中分离得到了6种不同的化合物经理化鉴定其各自分别为山野豌豆苷山柰酚-37-O-L-二鼠李糖苷等1.6.4.4小透骨草化学成分小透骨草为杜鹃花科植物滇白珠Caultheria yunanensis（Franch）Rehd的枝叶目前以从中分离鉴定出了38种不同的单体化合物经研究发现起主要药效的成分

30、为滇白珠苷 36 麻秀萍 37 等运用了HPLC法对其中水杨酸的含量进行了测定其实验结果为34.46%62.49%g/g（0.0034%0.0062%）1.6.4.5山野豌豆化学成分鞠爱华 38 等曾对大叶野豌豆和山野豌豆中所含的总黄酮类物质进行了含量测定魏峰 35 等则在山野豌豆中经提取分离获得了6种不同的黄酮类化合物单体且其中包括1种首次发现的化合物“山野豌豆苷”1.6.4.6其他透骨草化学成分宋志宏 39 等在铁线莲属透骨草中发现了5种化合物单体其各自分别是东莨菪碱咖啡酸三十烷醇肌醇以及-谷甾醇日本科学家Tanigushi 40 等经19691972年间的不断研究最终在透骨草科植物 Ph

31、ryma leptostachya L. 的根部经提取分离得到了醋酸透骨草醇和透骨草灵2种化合物单体1.7中药透骨草的药理学研究1.7.1 透骨草类药材的功效由于透骨草类药材其植物来源各不相同其中仅以文献记载的来自不同科属的品种就多达15种来源本就较为复杂的透骨草类药材有着各不相同的化学成分和药理作用也就不足为奇了因此其在临床上和民间也有着不尽相同的应用中药志里记载有透骨草的性味归经入肺肝经祛风除湿舒筋活血止痛解毒化疹本草纲目里记载有透骨草可治筋骨一切风湿疼痛挛缩寒湿脚气灵秘丹药笺里记载有透骨草可疗热毒山东中草药手册里记载有透骨草可祛风湿活血止痛最近几年以来许多国内外学者通过药理学和临床实验对

32、各类透骨草品种进行了系统的研究发现了其潜在的各种生物活性价值1.7.2 抗炎镇痛作用王璇 41 等对透骨草类中药材的抗炎镇痛作用进行了比较其目的在于分别对凤仙珍珠铁线东北以及羊角透骨草这5个不同品种的透骨草药材进行镇痛抗炎作用的研究并找出其中药效最佳者实验方法将实验小白鼠进行随机分组抗炎实验包括用巴豆油引发小白鼠耳朵的肿胀以及用醋酸引发小白鼠腹腔毛细血管壁的通透性增高阳性对照组分别为氢化可的松和阿斯匹林镇痛实验则包括用热板引发小白鼠足痛以及用醋酸引发小白鼠腹痛阳性对照组则为盐酸吗啡实验结果为5种透骨草的毒性都很低其中属角蒿和地构叶的毒性最低此外4种透骨草对2种疼痛模型都有镇痛效果且都能对抗醋酸

33、引发的小白鼠腹腔毛细血管壁的通透性增高仅地构叶可对巴豆油引发的小白鼠耳朵肿胀产生抑制作用研究结论表明地构叶可作透骨草的基源品种角蒿黄花铁线莲以及凤仙花等应当分别以各自的学名入药使用1.7.3抗过敏作用Fukumoto 42 等在对凤仙花科透骨草药材进行实验研究的过程中发现其花瓣的乙醇提取物具有较强的抗过敏作用且作用机理和化药“苯海拉明”不同凤仙花科透骨草药材除了有抗H1的作用机理之外还具有尚未明确的其他抗过敏作用机理1.7.4抗神瘤作用曾常茜 43 等通过大量实验研究发现透骨草的乙醇提取物可对人的体外卵巢癌细胞乳腺癌细胞宫颈癌细胞肝癌细胞肺癌细胞的增殖产生较强的抑制作用研究结果显示透骨草的乙醇

34、提取物可强烈抑制卵巢癌细胞乳腺癌细胞宫颈癌细胞肝癌细胞肺癌细胞等细胞的体外增殖分裂1.7.5抗菌活性中药透骨草中所含的三萜类化合物为熊果酸其对革兰氏阳性菌阴性菌以及酵母菌等细菌的活性可产生较为强烈的抑制作用并且呈现出一定的剂量关系 44 张治针 45 等通过大量实验对滇白珠挥发油提取物的抗菌活性进行了研究结果发现滇白珠的挥发油成分对金黄色葡萄球菌的各种亚型均可产生生物活性的抑制作用Yang Xiaolong 46 等研究发现凤仙花科透骨草的茎叶提取物对可真菌和细菌的生物活性有明显的抑制作用1.7.6杀虫活性中药透骨草的新鲜汁液可将菜虫苍蝇蚊子等有害昆虫杀死故在民间常作杀灭蚊虫等用 47 Eij

35、iTaniguchi等证明了乙酰透骨草脂素可引发家蝇的胃部中毒IL-kwon park等经过反复实验研究也间接证实了该结论的正确性此外还有学者曾经过实验证实了透骨草提取物亦可对孑孓产生较强的制死效果1.7.7 透骨草的毒性于豪等曾经报道透骨草导致接触性皮炎的发生 48 病人头部患有脂溢性皮炎且伴有脂溢性脱发其用透骨草煎水清洗头部3小时后自觉头皮灼热瘙痒10小时后头皮肿胀且相继出现糜烂丘疱疹等经医生诊断为接触性皮炎予以维生素C地塞米松等药口服3天后红肿消退5天后痊愈二周后用透骨草液作斑贴实验其结果呈阳性1.8 中药透骨草药的临床应用1.8.1 治疗风湿性关节炎 陕甘宁青中草药选里记载有用透骨草三

36、钱伸筋草二钱制草乌制川乌各一钱煎水服用可治风湿性关节炎周益生家宝方里也记载有用透骨草二两防风二两穿山甲二两当归三两白芍三两白蒺藜四两稀莶四两（九蒸九晒去茎用叶）海风藤二两广皮一两生地四两甘草一两以上为末用猪油一斤蜜炼为梧桐子大早晚各五钱酒下可治风气疼痛不拘近日远年民间还常用透骨草熬汤治疗跌打损伤风湿痹痛以及骨质增生等疾病把铁线透骨草完全粉碎并用来外敷此法对关节疼痛风湿性腰腿痛等有一定的治疗作用 49 金伯华 50 等将铁线透骨草提取液用于穴位注射此法可治疗类风湿性关节炎詹菁 51 等用水将凤仙透骨草煎煮后用以外敷此法对风湿痹痛有一定疗效1.8.2 治疗代指代指指的是以十指肿痛为主要症状的一种疾

37、病中国医学大辞典中指出代指是由于经脉血热凝结而产生其生于指甲内常伴有肿疼热透骨草熬汤浸洗可以治疗 52 在杨诚经验方里也记载有用透骨草防风地榆漏芦等药煎汤绵蘸乘热不住荡之可治疗肿毒初起1.8.3 治疗足跟痛 足跟痛病人常在晨起或由坐姿转为站姿时其足跟底部及周围组织存在明显疼痛感更有甚者则表现为履地艰难严重者影响其正常的生活和工作且该病多发于中老年人群中董明生曾采用透骨草熬汤熏洗配合穴位推拿治疗该病并获得了较好的临床效果何小平 53 等也有过采用自拟透骨草熬汤熏洗配合按摩治疗足跟痛的报道郑孝宏也曾有过利用透骨草合剂治疗糖尿病足的报道也获得了较好的临床效果将小透骨草提取物制成乳膏配合适宜的按摩理疗

38、此法对软组织损伤有较明显的效果 54 1.8.4 治疗脂溢性脱发 中医称“脂溢性脱发”为发蛀性脱发病其主要致病因素为过量饮食辛辣及油腻肥甘的食物以致于湿热内生郁阻经络血行不畅故此头发失于滋养现代医学则认为其与皮脂分泌过多性激素水平失衡等有关利用透骨草具有除湿活血的功效熬汤浸洗患处可直接使药力作用到病灶局部其效果良好民间还有用透骨草45克煎水先熏后洗洗后勿用水冲洗且熏洗各20min每天1剂连用412天其治疗效果明显孙玉齐 55 逢承喜 56 也曾有过采用60g透骨草（鲜草加倍）加2000mL水煎煮20分钟后取汤汁洗发的报道此外应注意凤仙花虽然也有被称为透骨草的说法但其并无相关疗效应加以区分1.8

39、.5 治疗肝腹水肝硬化可采用组成为透骨草39份松萝茶49份麻黄57份索索葡萄310份大枣1012份的配方 57 该组方同现有技术相比其辩证彻底配伍更为精确且分析了病症根源亦以解表征护五脏为根本本药物发明的疗效为对肝腹水肝硬化效果确切1周内肝腹水消失14周即可使病人肝功能恢复正常肝硬化产生逆转此外因该组方能净化患者的血液使之极易产生HBsAB（保护性抗体）故其还对不同程度的乙肝疾病存在一定的治疗效果1.8.6 治疗瘢痕疙瘩目前治疗瘢痕疙瘩常采用外治离子导入疗法由于瘢痕上存在大量增生组织称之为瘢痕疙瘩其大部分继发于手术、烫伤、刀枪等外伤痊愈后赵燕芳 58 等曾报道过采用透骨草汤离子导入法治疗瘢痕疙

40、瘩并取得满意疗效1.8.7 中药透骨草药的其他应用在民间各地常采用透骨草全草入药治疗跌打损伤 47 掌灸灵透骨草精油主要用于治疗肩周炎风湿性关节炎颈椎病类风湿等疾病在市场上应用广泛桂业勤 59 曾使用羊角透骨草治疗颞下颌关节紊乱综合症其治愈率高达84.8%李晓玲等曾报道过利用透骨草治疗急性湿疹刘目胜等曾报道过根据中医理论在门诊中利用芒硝透骨草治疗弹响指并获得满意效果李去病 60 等将珍珠透骨草用水煎煮之后外敷用于治疗狭窄性腱鞘炎其治愈率较高19952003年期间林君丽曾采用透骨草汤治疗顽固性偏头痛武步经 61 用珍珠透骨草加水煎煮取汤服用此法可治疗乳房疾病且疗效显著在彝族聚居地山民们长期把透骨

41、草当作秘方用于治疗疥疮其用法是将透骨草全草揉碎并添加猪油但不要加盐充分混均后在火上烤热用布包好对痛痒处进行揉搓 62 具有较好的疗效且无其他副作用孙虹 63 等使用小透骨草对手足癣进行治疗赵卫新 64 则使用凤仙透骨草对湿脚气进行治疗而潘成轩 65 则用川椒透骨草治疗鹅掌风以上方法在临床上均有较为显著的疗效此外民间还经常用透骨草熬汤熏洗治疗手癣在陕甘宁青中草药选里记载有用蛇床子透骨草等熬汤外洗治疗疮疡肿毒和阴囊湿疹1.9小结由于透骨草植物本身有较为繁多的品种其各自的化学成分以及相关药理作用也都不尽相同且在民间各地均有悠久的药用历史如此现状极易造成其在临床用药上的混淆同时也给该类药物的运用带来诸

42、多不便但目前对透骨草类植物尚无较为深入的探索更缺乏对其中化学成分和药理活性之间所固有的联系的系统研究因此作为从事相关专业者我们应该加强对此类药物化学成分以及药理作用的研究可结合民间用药方向进行深入研究寻找出其中具有生物活性的新成分更好的指导新药开发和临床用药从而扩大新的药用资源同时也建议在运用该类植物药物时请务必明确标注所用植物的来源和种属从而确保其在临床使用上的安全性和稳定性第二章 中药透骨草的生药学研究2.1 中药透骨草原植株的鉴别 取部分材料的药用部位按照常规的石蜡制片法作成石蜡切片；再按中国药典2010版部中的“薄层色谱法”对其进行定性研究 15 实验采用的样品为透骨草科(Phryma

43、ceae)透骨草属(Phryma)透骨草(Phryma leptostachya L.var.asiatica Hara)的全株为落叶或常绿灌木植株具有强烈香气枝条较为细长稍显红绿色或红色叶片呈卵状距圆形边缘带锯齿略向外卷纸质互生叶背面显青白色有细柔毛花序呈总状腋生花萼裂片数5花冠钟形花白绿色雄蕊数10花药顶部每室有2长芒子房呈球形有毛蒴果呈球形5裂包裹于宿存的黑色肉质花萼中状似浆果种子数多细小呈黄褐色花期为9月参见图2-1。图2-1透骨草原植物图(示花果期)2.2 中药透骨草的性状鉴定 实验样品茎长约35cm直径35mm表面显棕红色或黄棕色有纵纹全株具有强烈香气枝条细长左右曲折带红绿色或红色

44、叶片多脱落花序呈总状腋生花白绿色蒴果呈球形5裂包裹于宿存的黑色肉质花萼中状似浆果种子数多细小气微味微苦参见图2-2图2-2透骨草药材图2.3 中药透骨草的薄层色谱鉴别 取样品粉末2.5g(过20目筛)于锥形瓶中加入95%的乙醇40ml静置30min后用超声波处理30min再进行滤过滤液完全浓缩至干后加入10ml甲醇溶解用氯仿溶解不溶物后合并二者作为供试品液量取透骨草供试品液体10l点在以0.3%羧甲基纤维素钠作为粘贴剂的硅胶G板上再分别以展开系统A醋酸乙酯正己烷(4:9)展开系统B甲醇氯仿(15:95)为展开剂对样品进行展开取出后晾干再分别用365nm紫外灯和5%磷钼酸显色结果显示不同颜色的斑

45、点 66 详见图2-3展开系统 A 展开系统 B图2-3透骨草药材 TLC图2.4 中药透骨草的检查 依照“水分测定法”（中国药典2010版部-附录）测定样品的水分依照“灰分测定法”（中国药典2010版部-附录）测定样品的总灰分和酸不溶性灰分4次测定结果见表2-1根据测定结果初步得出透骨草药材水分不得超过15.0%总灰分不得超过15.0%酸不溶性灰分不得超过1.0%表2-1 4次测定的水分总灰分酸不溶性灰分数据（%）Tab 2-1 The data of water contenttotal ashacid-insduble ash content（%）2.5 中药透骨草的浸出物 通过查阅资料

46、发现透骨草中主要有效成分为醇溶性化学物质 67 因此选择乙醇为溶剂考察样品的浸出物按照“醇溶性测定法”（中国药典2010版部-附录）中的“热浸法”进行测定4次测定结果如下9.31%（第1次）8.76%（第2次）9.82%（第3次）10.02%（第4次）根据以上测定结果初步得出透骨草浸出物不可少于7.0%第三章 中药透骨草化学成分的研究3.1 中药透骨草化学成分的提取、分离3.1.1实验材料、试剂和仪器3.1.1.1实验材料笔者所用实验材料为透骨草科(Phrymaceae)透骨草属(Phryma)植物-透骨草(Phryma leptostachya L.var.asiatica Hara)的全草

47、3.1.1.2实验试剂薄层层析硅胶G（青岛海洋化工有限公司）柱层析硅胶（青岛海洋化工厂）D101大孔吸附树脂（南开大学化工厂）石油醚（分析纯A.R. 北京化工厂）薄层层析预制板（福山生化试剂厂）乙酸乙酷（分析纯A.R. 北京化工厂）氯仿（分析纯A.R. 北京化工厂）正丁醇（分析纯A.R. 天津科密欧化学试剂有限公司）甲醇（分析纯A.R. 北京化工厂）浓硫酸（分析纯A.R. 北京化工厂）95%乙醇（分析纯A.R. 北京化工厂）3.1.1.3实验仪器101-2A型数显电热鼓风干燥箱（上海锦屏仪器仪表有限公司通州分公司）KQ-250DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）RE52-05型旋转蒸发

48、仪（上海亚荣生化仪器厂）百灵LA114型电子天平（长熟市衡器厂）RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）SL2001N型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）电子恒温水浴锅（天津泰斯特仪器有限公司）气流烘干器（玻璃仪器. 华鲁电热仪器有限公司）BSZ-100型自动部份收集器（上海沪西分析仪器厂）ZF-C型三用紫外分析仪（上海康禾光电仪器有限公司）熔点测定X-4型数字显示显微熔点测定仪（北京泰克仪器有限公司）核磁Bruker-speckospin AC-600P型核磁共振仪Bruker AM 400MHz型核磁共振波谱仪质谱测定ESI-MS型质谱仪Varian Mat-212型质谱仪Q

49、-Tof micro型质谱仪3.1.2 实验方法3.1.2.1 选择乙醇浓度准确称取6份样品粗粉每份1.0g将其放置到50mL的锥形瓶中分别加水20%的乙醇40%的乙醇60%的乙醇80%的乙醇95%的乙醇各30mL再经超声提取30分钟摇匀之后过滤再重复以上操作1次最后统一定容至刻度摇匀之后使用TLC法经10%的硫酸乙醇液显色其显色结果表明60%的乙醇提取效果最佳即确定提取用乙醇的浓度为60%3.1.2.2 选择提取方法准确称取3份样品粗粉每份1.0g将其放置到100mL的具塞锥形瓶中各加60%的乙醇液40mL并称重浸泡30分钟后再分别釆用回流1h超声30分钟冷浸24h等不同的操作方式进行提取过

50、滤之后在50mL得容量瓶中定容至刻度并摇匀再使用TLC法检测结检测果表明使得样品提取液中有效部位含量最高的操作是超声提取30分钟回流1h提取则次之而冷浸24h法相对偏低因此笔者选择超声法对透骨草药材进行提取3.1.2.3 中药透骨草组分的提取称取4.1kg干燥的样品粗粉向其中加10倍量60%的乙醇冷浸过夜后进行超声提取30分钟将滤液减压至无醇味并回收之后依次加入8倍量6倍量60%的乙醇反复提取2次后合并浓缩液将浓缩液放置到6的冰箱中沉淀48小时后抽滤除去沉淀中的部分色素再将浓缩液依次经过石油醚乙酸乙酯水饱和正丁醇进行萃取每项分别萃取3次每次4小时之后对每个萃取部分进行溶剂回收并浓缩成浸膏再烘干

51、至恒重经此操作得到5g石油醚层提取物（组分1）14g乙酸乙酯层提取物（组分2）45g正丁醇层提取物（组分3）和92g水层提取物（组分4）3.1.2.4 中药透骨草化学成分的分离（1） 正丁醇层提取物的分离把正丁醇层的提取物溶解在氯仿中并以45g的硅胶（过200-300目）拌之挥干溶剂再选用1.5mX75mm的玻璃硅胶柱硅胶（过200-300目）用氯仿拌匀超声30分钟除去气泡后采用湿法装柱干法上样之后进行梯度洗脱洗脱剂可选用氯仿甲醇（45:1-1:1）以1/10柱体积为1馏分进行洗脱液的收集所得的不同馏分均采用TLC法进行检测并将相同组分合并再浓缩至较小体积最后将所得各较小组分反复通过硅胶柱进行

52、层析洗脱剂仍可继续选用“氯仿甲醇”经过反复纯化即可得到2种单体化合物1和2（2） 乙酸乙酯层提取物的分离把乙酸乙酯层的提取物溶解在石油醚中并以14g的硅胶（过200-300目）拌之挥干溶剂再选用0.5mX25mm的玻璃硅胶柱硅胶（过200-300目）用石油醚拌匀超声30分钟除去气泡后采用湿法装柱干法上样之后进行梯度洗脱洗脱剂可选用石油醚乙酸乙酯以1/10柱体积为1馏分进行洗脱液的收集所得的不同馏分均采用TLC法进行检测并将相同组分合并再浓缩至较小体积最后将所得各较小组分反复通过硅胶柱进行层析洗脱剂仍可继续选用“石油醚乙酸乙酯”以及“氯仿甲醇”经过反复纯化即可得到2种单体化合物3和43.1.2.

53、5化合物分离流程图（如图3-1所示）图3-1透骨草中化学成分的提取分离流程图Fig.3-1. Extraction and separation flow chart of the chemical constituents of Phryma leptostachya L.var.asiatica Hara3.1.3 化合物薄层色谱鉴定 取部分样品的药用部位按照常规的石蜡制片法作成石蜡切片；再按中国药典2010版部中的“薄层色谱法”对其进行定性研究 15 取样品粉末2.0g加入25mL70%的乙醇经加热回流30分钟后进行过滤将滤液水浴加热挥发至无醇味再用20mL醋酸乙酯进行2次萃取并将上清液

54、合并水浴加热至蒸干滤渣中加入2mL醋酸乙酯使之溶解再取上清液作供试品液另取山奈素标品作对照加入甲醇制成每1mL含1mg的液体作为参比溶液按照“TLC法”（中国药典2010版部-附录）进行试验分别量取上述2种溶液各5在同一硅胶G薄板上点样再以甲苯-甲酸-醋酸乙酯（1014）为展开剂对样品进行展开取出晾干后再喷以5%三氯化铝溶液并置于365nm紫外灯下进行检视结果供试品色谱中在对照品色谱的相应位置上应显示相同的黄色荧光斑点 66 3.2 化合物结构鉴定3.2.1 化合物2的鉴定正丁醇部位化合物C30H48O3白色粉末20D +74（c 0.13MeOH）ESI-MS m/z479M+Na+9352

55、M+Na+和455M-H-1HNMR（400 MHzCD3OD）5.46（1HmH-12）4.17（1HmH-3）1.29（6HsH-27 and H-29）1.07（3HsH-23）1.05（3HsH-24）1.02（6HsH-25 and H-26）0.96（3HsH-30）13CNMR（100 MHzCD3OD）180.1（C-28）144.9（C-13）122.4（C-12）78.7（C-3）55.6（C-5）48.4（C-19）48.1（C-9）46.5（C-17）42.3（C-14）42.0（C-8）39.9（C-18）38.7（C-4）38.5（C-1）38.4（C-10）34.

56、3（C-22）33.3（C-29）33.2（C-21）33.1（C-7）31.0（C-20）29.0（C-15）28.3（C-23）27.1（C-2）26.2（C-27）23.9（C-16）23.8（C-30）23.7（C-11）18.8（C-6）18.3（C-24）17.4（C-26）16.8（C-25）以上数据和文献 68 中报道的“熊果酸（Ursolic acid）”一致3.2.2 熊果酸（Ursolic acid）的提取分离3.2.2.1 仪器与材料FinniganMAT95型质谱仪Nicolet Magna 750 FTIR型红外分光光度计Bruker DRX 400型核磁共振仪TM

57、S作为内标薄层层析硅胶预制板HSGF254化工研究院硅胶（柱层析用）海洋化工厂反相硅胶LiChrospher 100 Rp-18（50m）（Merck）葡聚糖凝胶Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech ABUppsalaSweden）其他溶剂均为分析纯试剂透骨草3.2.2.2 提取和分离取干燥的透骨草1kg用95%的乙醇提取3次（1.5L3）后浓缩成浸膏（约0.15kg）将浸膏悬浮在0.4 L水中再分别用等量的石油醚正丁醇和乙酸乙酯各萃取3次后减压浓缩即得石油醚部（3.5g）正丁醇部（89g）和乙酸乙酯部（19.5g）经硅胶大孔树脂反相硅胶和Sephadex LH-2

58、0柱层析分离纯化后从正丁醇部位得到熊果酸（1.9 mg） 69 3.2.2.3 小结笔者经过考察不同的乙醇提取浓度不同的提取方法最后选定了“超声提取法”对样品进行了3次提取提取温度为30时间为30分钟/次功率为100Hz提取溶剂则选用60%的乙醇溶液笔者还运用了国际通用的“萃取法”将样品中的化学成分分成了4个极性不同的组成部分并对乙酸乙酯层正丁醇层进行了分离最终采用正相硅胶柱层析的方法从提取物中分离鉴定出了4个化合物单体依次分别是芹菜素-7-O-D-吡喃葡萄糖醛酸苷熊果酸豆甾醇以及透骨草灵第四章 HPLC法分析中药透骨草化学成分4.1 中药透骨草总皂苷的提取与含量测定4.1.1 仪器与试药Ag

59、ilent1100高效液相色谱仪（标准4元泵）水浴锅烘箱真空泵透骨草甲醇（fisher色谱纯)齐墩果酸对照品（中国药品生物制品鉴定所含量测定用）其他试剂均为分析纯4.1.2 方法与结果4.1.2.1 总皂苷的提取 称取样品粉末200g加入3000mL乙醚脱脂待残渣中的乙醚完全挥尽后加入乙醇于80水浴锅中回流提取提取液合并后将乙醇减压回收向残渣中加入1000mL蒸馏水使之溶解分别用石油醚水饱和正丁醇将溶液各萃取2次每次使用溶剂量均为1000mL石油醚层丢弃正丁醇层合并将正丁醇萃取液于80下减压干燥即得到透骨草总皂苷干品 70 4.1.2.2 透骨草总皂苷含量测定（1） 色谱条件 Phenomen

60、ix Luna C18柱（4.6250mm5m）甲醇冰醋酸水（250.175）作流动相乙腈0.3%H3PO4水甲醇溶液（601030）流速1.0mL/min检测波长210nm柱温40（2） 对照品溶液的制备 精密称取2mg齐墩果酸对照品置于10mL容量瓶中加入甲醇溶解并定容至刻度即得浓度为0.2mg/mL的齐墩果酸对照品备用溶液 71 （3） 样品溶液的制备 称取20mg透骨草总皂苷置于100mL的容量瓶中加入甲醇溶解并定容至刻度备用（4） 标准曲线的绘制 精密量取对照品溶液（0.2mg/mL）12345mL分别置于10mL容量瓶中以甲醇为溶剂稀释至刻度精密量取以上溶液20L注入到高效液相色谱