基因组关联分析地衣芽孢杆菌LCDD6对核桃苗的促生作用

1、应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol Doi: 10.19675/ki.1006-687x.2020.12010收稿日期 Received: 2020-12-05 接受日期 Accepted: 2021-04-01山东省农业科技资金（2019LY009）、国家重点研发计划（2017YFD0200804）和山东省双一流建设项目（SYL2017XTTD03）资助 Supported by Agricultural science and technology fund of Shandong, China (2019LY009), National Key R&D

2、Program of China (2017YFD0200804), and Funds of Shandong “Double Tops” Program , China (SYL2017XTTD03)*通讯作者 Corresponding author (E-mail: HYPERLINK mailto:dyq dyq)基因组关联分析地衣芽孢杆菌LCDD6对核桃苗的促生作用邴 辉1 王仲康1 杜秉海1, 3 马海林2 汪城墙1 陈安镜1 刘方春2 丁延芹1, 3*1山东农业大学生命科学学院 泰安 2710182山东省林业科学研究院 济南 2500143山东省盐碱地植物-微生物联合修复工程技

3、术中心 泰安 271018摘 要 为了挖掘地衣芽孢杆菌LCDD6的应用价值，我们将LCDD6基因组测序并进行了初步分析；通过鉴定培养基检测菌株的促生功能；将LCDD6发酵液灌根处理核桃苗，60 d后测定核桃苗长势、核桃叶片的光合作用和植株系统抗性；利用Illumina Miseq高通量测序分析了根际土壤的微生物菌群结构。结果预测到与促生、生防相关的功能基因/基因簇10个；LCDD6具有产IAA、铁载体、降解蛋白和解磷的能力；与LB对照组相比，处理组核桃苗株高、茎粗、分枝数分别增加了24.68%、7.03%和28.35%，植株鲜重和干重分别提高了12.96%和21.55%；叶片叶绿素含量提高了4

4、7.50%，达到极显著性差异（P 0.01），在暗适应下光系统的最大光化学效率提高了9.43%，达到显著性差异（P 0.05）；叶片SOD、 POD和CAT酶活分别增强了20.58%、26.10%和16.67%；根际土壤微生物菌群的丰富度提高，有益菌的相对含量增加。研究表明， LCDD6对核桃幼苗具有稳定的促生生防作用和丰富的基因资源，在绿色农业发展中具有重要的研究和应用价值。关键词 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）LCDD6；基因组；核桃苗；促生；生防Genome association analysis of the growth-promoting effec

5、t of Bacillus licheniformis LCDD6 on Walnut seedlingsBING Hui1, WANG Zhong-kang1, DU Bing-hai1, 3, MA Hai-lin2, WANG Cheng-qiang1, CHEN An-jing1, LIU Fang-chun2 & DING Yan-qin1,31 College of Life Science, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China2 Shandong Academy of Forestry, Jinan 2500

6、14, China3 Shandong Engineering Research Center of Plant-Microbial Restoration for Saline-Alkali Land, Taian 271018, ChinaAbstract To explore the value of Bacillus licheniformis LCDD6 in agricultural application, we presented and analyzed the genome sequence of strain LCDD6. Meanwhile, the growth-pr

7、omoting function of strain LCDD6 was revealed using identification medium. Walnut seedlings were treated with the fermentation broth of strain LCDD6 and grew for 60 days. The growth condition, photosynthetic capacity, and system resistance of walnut seedlings were determined. The microbial community

8、 structure of the rhizosphere soil of strain LCDD6 was analyzed by Illumina Miseq. A total of 10 genes or gene clusters according to growth promotion and biocontrol capacity were predicted out. Strain LCDD6 could produce IAA, siderophore, and protease, and solubilize phosphate. Compared with the con

9、trol, the plant height, stem diameter, branch number, plant fresh weight and dry weight of walnut seedlings treated by strain LCDD6 were increased by 24.68%, 7.03%, 28.35%, 12.96%, and 21.55%, respectively. Under dark adaptation, the maximal efficiency of PSII photochemistry of walnut seedlings trea

10、ted by strain LCDD6 was increased by 9.43% （P 0.05）. The SOD, POD, and CAT activities of walnut seedlings treated by strain LCDD6 were increased by 20.58%, 26.10%, and 16.67%, respectively. The abundance of microbial community in the rhizosphere soil of walnut seedlings treated by strain LCDD6 was i

11、ncreased, furthermore, the relative content of beneficial bacteria and fungi were increased. Our results showed strain LCDD6 has a stable growth-promoting and biocontrol effect on walnut seedlings and rich gene resources, which could have important research and application value in the green agricul

12、ture development.Keywords Bacillus licheniformis LCDD6; genome; walnut seedling; growth promotion; biocontrol地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是一种短杆状的革兰氏阳性、兼性厌氧细菌，1901年首次发现，至今已经在NCBI上登记了188株（截止到2020年11月20日），其中30株上传了完整的基因组（/genome/browse/#!/prokaryotes/412/）。研究发现地衣芽孢杆菌对于非生物胁迫如高温、酸碱等耐受程度极高，而且还具有酶系丰富、产酶量高等

13、优点，是具有较好的应用潜能的菌种1-5。据农业农村部微生物肥料和食用菌菌种质量监督检验测试中心记载，地衣芽孢杆菌属于微生物肥料的重要菌种资源。微生物肥料生产用菌种分为四级管理，根据其安全分级目录，地衣芽孢杆菌属于第一级（A.1）免做毒理学试验的菌种，具有安全性（中华人民共和国农业农村部行业标准NY 11092016）。地衣芽孢杆菌也被纳入了中国饲料添加剂品种目录（2013）中，饲料中添加地衣芽孢杆菌有助于饲料成分分解，帮助宿主更好地吸收利用，提高动物饲料的利用率6。地衣芽孢杆菌在猪、家禽及水产动物的养殖上已广泛应用，地衣芽孢杆菌BCR43能够增加对虾的免疫力和存活率7。地衣芽孢杆菌制剂对于人肠

14、道健康具有积极作用，能改善溃疡性结肠炎患者的炎症水平8。且从地衣芽孢杆菌中不断有新的医用活性物质被发现，它在医学上也具有重要的研究和应用价值9。地衣芽孢杆菌已经成为在农业、工业、畜牧业、医药等领域广泛应用的重要微生物资源，也是研究较热门的菌种10。由地衣芽孢杆菌制成的微生物菌剂在大田作物和经济蔬果上取得了显著促生、生防效果。但是不同的菌株应用效果存在较大差异，地衣芽孢杆菌FMCH001在干旱胁迫条件下促进玉米根茎的发育11；地衣芽孢杆菌HSW-16能够缓解小麦的盐胁迫，并在小麦的根长，枝长，鲜重和干重方面提高了6%-38%12；地衣芽孢杆菌A2使花生植株的鲜生物量、植株总长和根长分别提高了43

15、%、31%和39%13；地衣芽孢杆菌W10对桃树褐腐病的致病菌有较强的抑制作用，能明显推迟病害发生14。随着基因组学技术的发展，人们现在开始从获得地衣芽孢杆菌完整的基因组核苷酸序列着手，启动功能和比较基因组学的研究。Paul等研究了地衣芽孢杆菌GL174潜在生物防治作用，并通过基因组序列分析，评估了涉及生物防治和植物-细菌相互作用的基因功能15；Rey等在地衣芽孢杆菌ATCC 14580基因组中发现了与地衣素合成相关的基因16。基因组学的研究将为研究微生物代谢产物的合成调控机制，菌株之间不同表型差异的原因提供理论支撑，最终可能会改善菌株在生产应用中的策略。关于地衣芽孢杆菌的促生作用研究多集中在

16、生理水平上，并没有深入解析菌株的促生效应，限制了菌株的应用。本文所使用的菌株LCDD6是实验室从玉米芯和鸡粪发酵堆中分离得到的，通过基因组分析，同时挖掘其促生和生防相关基因资源，并将菌株的促生基因、促生能力和对核桃幼苗的促生作用进行关联分析，研究结果阐释了LCDD6的重要应用价值，为绿色农业发展奠定理论和应用基础。1材料和方法1.1材料菌种： 地衣芽孢杆菌LCDD6；核桃：香玲核桃实生苗。1.2培养基LB培养基：酵母粉，5 g；蛋白胨，10 g；氯化钠，10 g；水，1000 mL；固体培养基添加琼脂粉16 g；121 灭菌20 min；pH 7.0。豆芽汁培养基：豆芽，100 g；水煮30

17、min，取滤液；蔗糖，20 g；定容至1000 mL，121 灭菌20 min。有机磷培养基：葡萄糖10 g，硫酸铵0.5 g，氯化钠0.3 g，酵母浸粉0.5 g，氯化钾0.3 g，硫酸镁0.3 g，硫酸亚铁0.03 g，硫酸锰0.03 g，卵磷脂0.2 g，碳酸钙1.0 g，琼脂15 g，pH 7.0-7.5；水，1000 mL；121 灭菌15 min。铁载体产生菌的鉴定用CAS培养基17。脱脂奶粉培养基：脱脂奶粉15 g，水 1000 mL，琼脂15 g。108 高压灭菌15 min。1.3菌株促生功能鉴定1.3.1液体培养 在LB固体平板上活化菌种，单菌落接种于液体培养基，37 ，1

18、80 r/min，过夜培养。1.3.2分泌吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid, IAA）定性测定 按1%接种量向含有L-色氨酸（200 mg/L）的LB液体培养基中接菌，28 ，180 r/min，摇床培养4 d。取50 L菌悬液滴于白色陶瓷板上，加50 L Salkowski比色液。同时用50 mg/L IAA加入比色液作为阳性对照，将白色陶瓷板暗光保存30 min，如果颜色变红，表明细菌有产IAA的能力。1.3.3产铁载体的鉴定 LB平板上活化菌株，再用灭菌的牙签挑取单菌落接到CAS固体检测平板上，37 倒置培养2-3 d，菌落周围显示橙色圈，表明产生铁载体。1.3.4解有

19、机磷能力鉴定 用无菌牙签将活化菌种接种到有机磷培养基平板上，28 培养2-5 d后，菌落周围有透明圈出现，表明具有解磷功能。1.3.5降解蛋白能力鉴定 用无菌牙签将活化菌种接种到脱脂奶粉培养基平板上，37 恒温培养16-26 h后，菌落周围有透明圈出现，表明具有降解蛋白的能力。1.4盆栽实验1.4.1盆栽试验设计 盆栽试验在试验田进行。实验用40 cm 60 cm盆，每盆装8.5 kg土，每个处理5个重复。育苗后移栽，缓苗7 d后，处理组取10 mL发酵液（2108 cfu/mL）用清水稀释至1000 mL灌根，对照组取10 mL灭菌液体LB培养基并用清水稀释至1000 mL灌根。每隔3 d浇

20、1次水，培养60 d后测量核桃苗各项指标。1.4.2测定方法 （1）农艺性状。用米尺测量标记幼苗地上茎的高度，用游标卡尺测量离地2 cm部位的茎围，计数主杆上的分枝数，进行记录。计算株高增长值，茎粗增长值和分枝增长数。（2）核桃苗重。盆倒扣倒出核桃苗，尽可能保持植株的完整性，洗净核桃根际土，迅速用滤纸吸干水分，短时间内完成称量核桃苗鲜重并记录；将核桃苗放入烘箱，105 杀青，85 烘干至恒重，称量干重并记录。（3）叶绿素和光合作用。测定叶绿素含量，参照文献18；使用封闭式荧光仪（Photon Systems Instruments FluorCam 800MF，易科泰生态技术）测量植株同一位置

21、叶片的暗适应下光系统最大光化学效率。（4）叶片酶活。核桃苗叶片的超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性测定参考文献18。（5）土壤微生物群落结构分析。施菌60 d后，盆倒扣倒出核桃苗，尽可能保持植株的完整性，抖掉根上的松散土壤，小心收集根际土，采集对照组（标记为CK）和处理组（标记为LCDD6）的土样各三份，样品采集后立即放4 保存，尽快转移到-80 冰箱保存备用。土壤样品由上海派森诺生物科技有限公司用Illumina Miseq平台进行高通量测序。土壤微生物总DNA的提取使用E.Z.N.A.Soil DNA Kit试剂盒（美国OMEGA公司），之后通过16S

22、 rDNA（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT）和ITS（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG/ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）引物进行测序分析。1.5基因组测序分析1.5.1试验流程 将LCDD6于液体LB培养基中培养16 h至对数生长期后期离心收集菌体，使用康为试剂的细菌基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，检测合格后进行测序，分别进行组分、通用功能和特殊功能鉴定。1.5.2数据分析 采用Illumina Hiseq结合第三代测序技术完成菌株LCDD6的基因组完成图测序，使用ABySS拼接软件对

23、Illumina测序数据进行初步组装，使用CANU软件进行后续组装，最终获得基因组最优组装结果。利用Genemark分析工具进行基因预测，之后将预测基因的蛋白序列分别与Nr、genes、string和GO数据库进行blastp比对，从而获得预测基因的注释信息。通过antiSMASH程序进行抗生素类物质生物合成基因簇的快速鉴定，注释和分析。2结果与分析2.1地衣芽孢杆菌LCDD6形态和基因组特征LCDD6（CGMCC NO.19225）是实验室专利保存菌种，菌落为白色、不透明、形状不规则，革兰氏阳性菌（图1）。将LCDD6基因组序列通过比对后确定为地衣芽孢杆菌，其基因组信息提交GENBANK（/

24、nuccore/CP065029）。LCDD6基因组包含1条染色体，基因组大小为4249389 bp， GC含量46.22%。共有4736个编码蛋白的基因，总长度为3799830 bp，占总序列的89.02%，平均每个基因长度为802 bp，基因区GC含量为47.03%（图2）。图1 LCDD6菌落形态。Fig.1 Bacterial LCDD6 colony morphology. 图2 LCDD6的基因组环形图谱。Fig.2 Ring map of LCDD6 genome.2.2 LCDD6促生特性通过鉴定培养基验证其可以产吲哚乙酸（图3A）、降解蛋白质（图3B）、分泌铁载体（图3C）以

25、及溶解有机磷（图3D）。LCDD6菌株的这些特征表明它可以活化土壤中的铁和磷，将有机氮降解转化，并直接产生植物激素IAA，从而促进植物生长。图3 LCDD6功能鉴定。（A）产IAA（B）产蛋白酶（C）产铁载体（D）解磷Fig.3 Identification of LCDD6 function. (A) IAA (B) protease (C) siderophore (D) phosphorus-solubilizing2.3产吲哚乙酸（IAA）关键基因分析合成植物激素IAA促进植物生长是细菌促生的作用机理之一。细菌合成IAA有三条主要途径：吲哚-3-丙酮酸（indole-3-pyruvic

26、acid，IPA）途径、吲哚-3-乙酰胺（indole-3-acetamide，IAM）途径和吲哚-3-乙腈（indole-3-acetonitrile，IAN）途径19。通过对LCDD6基因组的分析发现（表1），LCDD6菌中IAA主要是通过IPA途径合成的：以色氨酸为前体物质，在patB编码的氨基转移酶的催化下转化为吲哚3-丙酮酸，然后在yclC编码的脱羧酶的作用下形成吲哚-3-乙醛，最后在aldH编码的醛脱氢酶（NAD+）作用下氧化成IAA20。在LCDD6菌株中还找到了酰胺酶的编码基因amiE，酰胺酶是细菌通过吲哚乙酰胺（IAM）途径合成IAA必需的，推测LCDD6在特定条件下还可以通

27、过IAM途径合成IAA。表1 LCDD6产IAA相关基因Table 1 Production of IAA related genes in LCDD6 genome基因编号 ID基因功能 FunctionKEGG编号 KEGG IDKO基因编号 KO/Gene_ID基因 GeneLCDD6003707aminotransferase3K14155patBLCDD6000419UbiD family decarboxylaseyclCLCDD6000268aldehyde dehydrogenase (NAD+)K00128aldHLCDD6003966amidaseK01426amiE2.4

28、解有机磷相关基因分析碱性磷酸酶、碱性磷酸二酯酶和碱性磷脂酶是用来评价有机磷转化为无机磷的常用指标，编码碱性磷酸酶的基因有phoA 、phoB和 phoX，编码碱性磷酸二酯酶的基因 phoD，编码甘油磷酸二酯酶的基因glpQ、编码环状二核苷酸磷酸二酯酶的基因yybT21-22。据报道，绝大部分碱性磷酸酶同时还具有碱性磷脂酶的活性23。LCDD6基因组中与解有机磷相关的基因有4个（表2）。表2 解有机磷相关基因Table 2 Genes related to degradation of organophosphorus基因编号 ID基因功能 FunctionKEGG编号 KEGG IDKO基因编

29、号 KO/Gene_ID基因 GeneLCDD6002826alkaline phosphataseK01077phoA、phoBLCDD6003358alkaline phosphatase DK01113phoDLCDD6002854glycerophosphodiester phosphodiesterase6K01126glpQLCDD6004709cyclic dinucleotide phosphodiesterase9K22927yybT、gdpP2.5产铁载体相关基因分析细菌可以通过不依赖于非核糖体肽（NRPS）途径合成铁载体， IucA和IucC合成酶是该途径的重要标志24-

30、25。通过对LCDD6基因组的比对分析发现，LCDD6菌株与地衣芽孢杆菌TCCC 11148、类地衣芽孢杆菌ZAP17等菌株的基因组中都存在相同的铁载体合成基因簇，LCDD6中该基因簇位置为1217445-1230030，主要包括10个基因，其中包含两个核心合成基因（表3）。表3 产铁载体相关基因Table 3 Genes related to siderophore-producing基因编号 ID基因功能 FunctionLCDD6001260IucA/IucC family siderophore biosynthesis protein LCDD6001263 IucA/IucC fa

31、mily siderophore biosynthesis protein 2.6 LCDD6抗生素合成相关基因分析使用antiSMASH程序分析LCDD6和拮抗相关的基因簇，发现LCDD6的10个基因簇中有3个与已验证产物的基因簇相似度为100%，分别是地衣素（Lichenysin），基因簇位置在368281-409379；嗜铁素（Paenibactin）或杆菌素（Bacillibactin），基因簇位置在3789646-3804231和苔藓素（Lichenicidin），基因簇位置在4016034-4020175，都是具有较好抗菌活性和应用性的抗生素26-30。另外发现LCDD6菌株中脂肽

32、类物质生物合成基因簇总长度为27564 bp，包含26个基因，基因簇位置在2133302-2160865；经比对分析发现与贝莱斯芽孢杆菌 FZB42中丰原素（Fengycin）生物合成基因簇的相似性最高，为53%，总长度为49542 bp，包含了15个基因，其中相同的基因有yng E、yng F、yng G、yng H、yng I、yng J和dac C，我们猜测LCDD6菌株可能分泌与FZB42不同类型的脂肽类抗生素31。2.7 LCDD6菌株对核桃的促生作用2.7.1核桃农艺性状选取长势一致的核桃苗移栽到盆中，菌剂处理60 d后收苗（图4）。与对照相比，处理组株高提高了24.68%（图4A

33、），茎粗增长了7.03%（图4B），分枝数增加了28.35%（图4C），鲜重增加了12.96%（图4D），干重增加了21.55%（图4F）。图4 60d核桃幼苗生长情况。A）株高增长值（B）茎粗增长值（C）分枝数增长值（D）湿重（F）干重Fig.4 Walnut seedling growth after 60d. (A) Plant height (B) Stem thickness (C) Branch number (D) Wet weight (F) Dry weight2.7.2叶绿素含量与光合作用叶绿素是最重要的一类参与光合作用的色素32。处理组可以提高叶片叶绿素含量（图5A），增

34、强光合作用（图5C）。与对照相比，叶绿素含量提高了47.50%，达到极显著性差异（P 0.01）；在暗适应下光系统最大光化学效率提高了9.43%（图5B），达到显著性差异（P 0.05）。图5 叶片叶绿素含量和PS最大光化学效率。Fig.5 Chlorophyll content and maximal efficiency of PSII photochemistry in leaves.2.7.3叶片酶活植物的SOD、POD和CAT活性变化能反应植物对外界环境抗逆性的变化。本文测定了核桃叶片的三种酶活性，结果表明处理组核桃苗叶片的SOD酶活性提高了20.58%（图6A）； POD酶活性提高

35、了26.10%（图6B）；CAT酶活性提高了16.67%（图6C）。图6 核桃叶片SOD、POD和CAT含量。Fig.6 Content of SOD, POD and CAT in walnut seedling leaves.2.8 LCDD6对核桃根际土壤微生物群落结构的影响测序共得到9996个细菌OTU，其中CK对照组特有OTU 4295个，LCDD6处理组特有OTU 4087个；在真菌群落中，共得到1136个OTU，其中CK特有OTU有492个，LCDD6处理组特有OTU有518个。在相似度97%水平下将测序得到的序列进行（alpha）多样性分析，表4为不同处理的核桃根际土壤的细菌和

36、真菌群落结构和丰富度指数。与对照组相比，处理组的细菌和真菌菌群的Shannon指数分别降低了0.9%和12.89%；细菌和真菌菌群的Chao1指数分别提高了2.67%和10.83%，说明施加LCDD6菌株后，核桃根际土壤的细菌和真菌的群落多样性降低但丰富度提高。表4 真菌和细菌群落结构的多样性和丰富度指数Table4 Diversity and richness indices of bacterial and fungal communities 样本 SampleChao1指数 Chao1物种数 Observed speciesSimpson指数 SimpsonShannon指数 Shan

37、non均匀度 Pielous evenness细菌BacteriaCK7313.64197.615942.90104.210.9990.00011.350.040.9050.005LCDD67508.611003.455409.83634.500.9990.00011.240.220.9070.005真菌FungiCK554.3740.98548.2339.670.9720.0046.590.1350.7240.015LCDD6614.0287.6599.4794.980.8710.1725.740.710.6200.172在属分类水平对细菌群落结构进行分析（图7A），发现MND1、RB41、

38、芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、类固醇杆菌属（Steroidobacter）、溶杆菌属（Lysobacter）和黄杆菌属（Flavobacterium）等为核桃根际土壤的核心菌属。与对照组相比，处理组中的芽孢杆菌属、鞘氨醇单胞菌属、溶杆菌属、黄杆菌属等有益菌属的相对丰度提高。在属分类水平对真菌群落结构进行分析（图7B），发现被孢霉属（Mortierella）、柄孢壳属（Zopfiella）、酵母属（Issatchenkia）、毛葡孢属（Botryotrichum）、梭菌属（Solicoccozyma）、链格孢属（

39、Alternaria）等为核桃根际土壤的核心菌属。与对照组相比，处理组中的酵母属、梭菌属等菌属的相对丰度提高。芽孢杆菌属、假单胞菌属、酵母属和梭菌属是公认的对植物有不同程度的促生或防病作用的有益微生物33-36。图7 属水平上细菌（A）和真菌（B）群落结构的组成和相对丰度（前20位）。Fig.7 Composition and relative abundance of bacterial (A) and fungal (B) community structures at genus levels (top 20).3讨论细菌促进植物生长的作用机制包括直接和间接两种方式。直接促生作用主要是通

40、过合成植物生长所需的化合物，如吲哚乙酸、ACC脱氨酶、细胞分裂素、赤霉素等，或通过固氮、解磷、解钾等作用增加土壤环境中可直接吸收的氮、磷、钾等有效元素含量37-38。间接作用是指细菌通过产生拮抗物质，如产抗生素、氰化物等或者诱导植物产生系统抗性来减少或阻止一种或多种由病原菌产生的有害作用来间接促进植物生长39；通过改善土壤微生物群落结构也被认为是一种间接的促生机制33。常见能产生植物激素IAA的促生细菌有：假单胞菌（Pseudomonas spp.）、根瘤菌（Rhizobium spp.）、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）、多粘类芽孢杆菌（Paenibacillu

41、s polymyxa）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、链霉菌（Streptomyces spp.）等19。在解淀粉芽孢杆菌SQR9中发现了吲哚丙酮酸脱羧酶，枯草芽孢杆菌ZJB-603和ATCC21697菌株、解淀粉芽孢杆菌FZB42均具有IAN途径中的关键酶，不同种的细菌其产生IAA的途径可能相同或不同，同种不同菌株也可能具有不同的途径19-20。而本研究中的LCDD6菌株既发现了IPA途径的关键酶又发现了IAN途径中的关键酶，实验室检测它能够产生IAA，说明它具有这两种产IAA的合成途径，至少有一种

42、途径是完整的。土壤磷主要有无机磷和有机磷两种形态，有机磷来源主要是生物残体和有机肥，且其形态更为复杂40。有机磷矿化是增加土壤中有效磷的主要方式，细菌进行有机磷的矿化是通过产生碱性磷酸酶、碱性磷酸二酯酶和碱性磷脂酶来实现的，例如枯草芽孢杆菌NCD-2、解淀粉芽孢杆菌FZB42等均具有降解有机磷的功能41-42。LCDD6基因组中找到4个编码碱性磷酸酶和碱性磷酸二酯酶的基因，而绝大部分碱性磷酸酶同时还具有碱性磷脂酶的活性，所以检测的该菌降解卵磷脂的功能是碱性磷脂酶在发挥作用。微生物产生的铁载体是一种Fe3+螯合剂，它不仅可以帮助微生物竞争铁营养还能为植物提供有效铁，铁载体可分为儿茶酚型、羟肟酸型

43、或-羟基羧酸型17,43。产生铁载体的途径有依赖于非核糖体肽（NRPS）合成酶途径和不依赖于NRPS合成酶途径，有一些类型的铁载体则是通过两种途径合成的，例如炭疽芽孢杆菌合成petrobactin25,43。研究表明，微生物不依赖于NRPS途径合成铁载体主要以IucA为代表的A型合成酶、以AcsA为代表的B型合成酶、以IucC为代表的C型合成酶为重要标志。LCDD6中找到两个核心合成基因Iuc A和Iuc C，说明其可以进行不依赖于NRPS途径合成铁载体，但本文所用的CAS方法并不能验证铁载体的类型。本文研究发现LCDD6菌株既具有直接促生作用也具有间接促生作用，其直接促生作用是通过产生特定的

44、代谢产物来完成的，通过基因组比对找到了产生铁载体、吲哚乙酸和碱性磷脂酶等相关的功能基因，从平板试验结果来看，该菌株能分泌铁载体、吲哚乙酸、碱性磷脂酶和蛋白酶，说明LCDD6能够产生有活性的代谢产物，与这些功能相关的基因是具有活性的。同时还发现有编码非核糖体肽和脂肽类化合物合成相关基因，但这些基因的真实功能和菌株是否能分泌有活性的代谢产物是需要通过实验进行验证的，可以采用LC-MS和HPLC的方法进行研究。随着组学技术和生物信息学的不断完善，接下来可以利用比较基因组学进一步挖掘LCDD6的功能基因。4结论（1）LCDD6菌株具有丰富的促生基因资源。LCDD6菌株可以通过IPA途径和IAN途径合成

45、IAA；基因组上含有4个与降解有机磷有关的碱性磷酸酶和碱性磷酸二酯酶的基因，菌株具有矿化有机磷的功能；LCDD6中含有不依赖于NRPS途径合成铁载体的两个核心合成基因Iuc A和Iuc C，具有产生铁载体的能力；另外，发现LCDD6具有丰富的抗生素基因资源，包含地衣素、嗜铁素或杆菌素、苔藓素以及脂肽类物质生物合成基因簇。（2）LCDD6菌株既能够直接促进核桃苗的生长，又能够通过诱导植株系统抗性和影响土壤微生态环境来间接促进核桃苗的生长。施用菌株发酵液使核桃苗光合作用显著增强、提高了有机物质的合成，使植株干重增加，植株的系统抗性增强；使核桃苗根际土壤微生物菌群的丰富度提高，芽孢杆菌属、鞘氨醇单胞

46、菌属、溶杆菌属、黄杆菌属、酵母属、梭菌属等有益菌属的相对丰度提高。（3）LCDD6菌株具有明显的促生功能，研究结果丰富了农业微生物菌种资源和基因资源，该菌株具有较高的应用和研究价值。菌株的代谢产物如铁载体和抗生素类型及活性单位并没有进一步的研究，今后将采用质谱和高效液相色谱等方法详细的分析有用的代谢产物，为更好的应用菌株提供依据。参考文献 References1 Voigt B, Schroeter R, Britta Jrgen, Albrecht D, Evers S, Bongaerts J, Maurer K, Schweder T, Hecker M. The response of

47、 Bacillus licheniformis to heat and ethanol stress and the role of the SigB regulon J. Proteomics, 2013, 13(14):2140-2161.2 Paul S, Aggarwal C, Thakur JK, Aggarwal C, Thakur JK, G.S.Bandeppa, Khan MA, M.Pearson L. Gyorgy Babnigg，Carol S.Giometti，Andrzej Joachimiak . Induction of osmoadaptive mechani

48、sms and modulation of cellular physiology help Bacillus licheniformis strain SSA61 adapt to salt stress J. Curr Microbiol, 2015, 70(4):610-617.3 Dong Z, Chen X, Cai K, Chen ZX, Wang ZX. Exploring the metabolomic responses of Bacillus licheniformis to temperature stress by gas chromatography/mass spe

49、ctrometry J. J Microbiol Biotechnol, 2018, 28(3): 473-481.4 Abdelrazek NA, Elkhatib WF, Raafat MM, Aboulwafa MM. Experimental and bioinformatics study for production of L-asparaginase from Bacillus licheniformis: a promising enzyme for medical application J. Amb Express, 2019, 9(1): 39.5 唐娟, 张毅, 李雷雷

50、, 林开春. 地衣芽孢杆菌应用研究进展J. 湖北农业科学, 2008, 47(3): 351-354 Tang J, Zhang Y, Li LL, Lin KC. research advances in applying of Bacillus licheniformis J. Hubei Agr Sci, 2008, 47(3): 351-3546 徐小明, 白建勇, 宦海琳, 闫俊书, 周维仁. 地衣芽孢杆菌对发酵床饲养仔猪生长性能、消化酶活性及肠道主要菌群数量的影响J. 中国畜牧兽医, 2015, 42(04): 923-928 Xu XM, Bai JY, Huan HL, Yan

51、 JS, Zhou WREffect of Bacillus licheniformis on growth performance，digestive enzymes and the num ber of intestina main microbial flora of piglets raised in fermentation bed J. China Ani Husb Vet Med, 2015, 42(4): 923-9287 Daro Israel Garca-Medel,Carlos Angulo, Ruth Escamilla-Montes,Jess Arturo Fierr

52、o-Coronado, Genaro Diarte-Plata, Carina Gmez-Jimnez, Antonio Luna-Gonzlez. Bacillus licheniformis BCR 4-3 increases immune response and survival of Litopenaeus vannamei challenged with Vibrio parahaemolyticus IPNGS16 J. Aqu Int, 2020, 28(5): 23032318.8 李军辉, 黄璠, 许晓虹, 袁燕燕. 柳氮磺吡啶联合地衣芽孢杆菌对溃疡性结肠炎患者血清炎症因子

53、水平的影响J. 药物评价研究, 2020, 43(11): 2280-2283. Li JH, Huang F, Xu XH, Yuan YY. Effects of sulfasalazine combined with Bacillus licheniformis on serum inflammatory factor levels in patients with ulcerative colitis J. Drug Ev Res, 2020, 43(11): 2280-22839 Alrumman SA, Mostafa YS, Al-Izran KA, Alfaifi MY, Ta

54、ha TH, Elbehairi SE. Production and anticancer activity of an L-asparaginase from Bacillus licheniformis isolated from the Red Sea, Saudi Arabia J. Sci Rep, 2019, 9(1): 3756.10 周通, 徐永平, 王丽丽, 陈岩, 张楠, 王佳宁, 贾藏藏, 曲芳京, 李晓宇. 地衣芽胞杆菌在植物病害生物防治中的应用J. 生物资源, 2017, 39(2): 85-92 Zhou T, Xu YP, Wang LL, Chen Y, Zh

55、ang N, Wang JN, Jia ZZ, Qu JF, Li XY. Application of Bacillus licheniformis in biological control of plant diseases J. Biotic Resources, 2017, 39(2): 85-9211 Akhtar SS, Amby DB, Hegelund JN, Fimognari L, Grokinsky DK, Westergaard JC, Mller R, Moelbak L, Liu F, Roitsch T. Bacillus licheniformis FMCH0

56、01 increases water use efficiency via growth stimulation in both normal and drought conditions J. Front Plant Sci, 2020, 11: 297.12 Singh R P, Jha P N. A Halotolerant bacterium Bacillus licheniformis HSW-16 augments induced systemic tolerance to salt stress in wheat plant (Triticum aestivum) J. Fron

57、t Plant Sci, 2016, 7(1252): 1890.13 Goswami D, Dhandhukia P, Patel P, Thakker, JN. Screening of PGPR from saline desert of Kutch: growth promotion in Arachis hypogea by Bacillus licheniformis A2 J. Microbiol Res, 2014, 169(1): 66-75.14 Ji ZL, Peng S, Zhu W, Dong JP, Zhu F. Induced resistance in nect

58、arine fruit by Bacillus licheniformis W10 for the control of brown rot caused by Monilinia fructicola J. Food Microbiol, 2020, 92: 103558.15 Paul S, Aggarwal C, Thakur JK, Aggarwal C, Thakur JK, G.S.Bandeppa, Khan MA, M.Pearson L. Gyorgy Babnigg，Carol S.Giometti，Andrzej Joachimiak et al. Induction o

59、f osmoadaptive mechanisms and modulation of cellular physiology help Bacillus licheniformis strain SSA61 adapt to salt stress J. Curr Microbiol, 2015, 70(4): 610-617.16 Rey MW, Ramaiya P, Nelson BA, Brody-Karpin SD, Zaretsky EJ, Tang M, Lopez de Leon A, Xiang H, Gusti V, Clausen IG, Olsen PB, Rasmus

60、sen MD, Andersen JT, Jrgensen PL, Larsen TS, Sorokin A, Bolotin A, Lapidus A, Galleron N, Ehrlich SD, Berka RM. Complete genome sequence of the industrial bacterium Bacillus licheniformis and comparisons with closely related Bacillus species J. Genome Biol, 2004, 5(10): 77.17 丁延芹, 黄伟红, 姚良同, 于素芳, 杜秉海