β-半乳糖苷酶(LACZ)酶活测定

1、警示：在我们的手册中介绍的实验可能具有潜在的危险性，要求操作人员具有相当的安全训练、特殊装备、以及相关安全部门的监督。作为实验操作员的你承担全部的责任、义务和由于实施安全步骤和措施带来的危险。麻省理工大学没有责任、义务或承担由于实施本材料中内容所引起的危险。法律声明卩-半乳糖苷酶（LACZ）酶活测定在冰上解冻样品，同时准备裂解液（见下面关于裂解液样品的收集和准备的注意事项）准备若干（至少每个样品3个和空白一支）透明的塑料比色皿，每支装有500卩I的碳酸钠终止液。你可以在比色皿上标明测试样品的名称和使用的时间。在微量离心试管中加入如下试剂：400卩I磷酸钠盐缓冲液（pH7.5）133卩IONPG

2、溶液6卩I镁离子溶液把反应混合物放置在37C的水浴中或者加热垫上预温育。一旦预热后，加入如下物质：60卩I细胞萃取物比较明智的做法是同时做阴性对照，即用抽提物或不表达B-半乳糖苷酶的细胞抽提物代替前述的细胞抽提物。留心观察每个反应试管里黄色（0-硝基酚）的出现，在适当的时间点，从每种反应混合物中等量移取100卩I的溶液，把它加到装有碳酸钠终止液的比色皿中。当完成所有时间点测定后，在420nm处测光密度，记录吸光值，并且计算吸光值与时间的斜率。斜率和B-半乳糖苷酶的活性成正比。注意：若在420nm处吸光值高于1.0，则不能采信。在计算其实际活性时，先制作o-硝基酚标准曲线图，然后根据样品的吸光值

3、在曲线上找出对应的浓度。一个酶活力单位是指酶在37oC每分钟可催化产生1卩mol的o-硝基酚。收集和裂解细胞的注意事项细胞培养物的收集在适当的培养时间，取出1.6ml的培养物放入微量离心管中，并把它置于冰上。迅速将1.6ml样品在涡旋混匀器上振荡，然后移出100卩I放入已装有900卩L新鲜培养基的比色皿中。离心剩下的1.5ml样品，去掉上层清液，把沉淀迅速放在-80C冷藏。（注意：样品要在-80C而不是-20C冷藏保存）测量并且记录细胞培养物1:10稀释液的OD600值。（注意：OD60值将影响下一步中lacZ酶活力的计算）P.LESSARD2002,保留所有权利。细胞裂解在冰上解冻沉淀。在3

4、74卩LB-PER?细菌蛋白抽提试剂（Pierceproduct78248）中重新悬浮细胞，再加入50ul蛋白酶和磷酸化酶抑制剂以及细菌细胞提取物（Sigma产品P8465;按厂家说明再生），1uL34mg/mL的氯霉素（用甲醇配制），6卩L10mg/ml裂解酶（用蒸馏水现配，当使用大肠杆菌时可以省略这一步）快速涡旋振荡一分钟。在冰上培育5分钟。此时，你就得到了可以用来检测lacZ酶活性的粗制裂解液，使用前面的方法，按照酶所形成的产物的数量/每分钟每0D600单位来测定活力。（注意：对棒状杆菌和红平红球菌，这种方法是采用裂解法时的最好测定方法）对大肠杆菌样品，离心粗制溶解产物1min后放置于冰

5、上。你现在得到的是清亮的溶菌液（上清液中的细胞碎片已被去除）。蛋白质浓度用Bradford方法可以测定（另见蛋白质检测方案）。在清澈溶菌液中使用前面所介绍的方法检测lacZ酶活力，按每分钟每mg蛋白质所形成的nmol产物来测定。（注意：在测定酶活力的时候，用酶活力/mg蛋白质比用酶活力/OD00更恰当）磷酸缓冲液（50ml）49.6ml蒸馏灭菌水0.108gNaH2PO4100.528gNa2HPO4过滤或高压灭菌ONP溶液（10ml）10ml磷酸钠缓冲液0.04go-硝基-?-D-吡喃糖苷10mg/mL裂解酶（1ml）（若使用棒状杆菌和红平红球菌）mg裂解酶加蒸馏水至1ml现配并于冰上保存用于细胞抽提的蛋白磷酸化酶抑制剂Sigma产品P8465按厂家说明配制过滤消毒并等份装于1ml容器中，-20oC保存提前准备并等份装于200ul容器中，-80oC保存镁离子溶液（1ml）610uldH2O290ul?硫基乙醇100ul1MMgCl20.4MNa2CO3（终止液）500ml21.2gNa2CO3加蒸馏水到500ml提前准备上述试剂，于室温贮藏34mg/ml氯霉素液10ml340mg氯