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文档简介
1、警示:在我们的手册中介绍的实验可能具有潜在的危险性,要求操作人员具有相当的安全训练、特殊装备、以及相关安全部门的监督。作为实验操作员的你承担全部的责任、义务和由于实施安全步骤和措施带来的危险。麻省理工大学没有责任、义务或承担由于实施本材料中内容所引起的危险。法律声明卩-半乳糖苷酶(LACZ)酶活测定在冰上解冻样品,同时准备裂解液(见下面关于裂解液样品的收集和准备的注意事项)准备若干(至少每个样品3个和空白一支)透明的塑料比色皿,每支装有500卩I的碳酸钠终止液。你可以在比色皿上标明测试样品的名称和使用的时间。在微量离心试管中加入如下试剂:400卩I磷酸钠盐缓冲液(pH7.5)133卩IONPG
2、溶液6卩I镁离子溶液把反应混合物放置在37C的水浴中或者加热垫上预温育。一旦预热后,加入如下物质:60卩I细胞萃取物比较明智的做法是同时做阴性对照,即用抽提物或不表达B-半乳糖苷酶的细胞抽提物代替前述的细胞抽提物。留心观察每个反应试管里黄色(0-硝基酚)的出现,在适当的时间点,从每种反应混合物中等量移取100卩I的溶液,把它加到装有碳酸钠终止液的比色皿中。当完成所有时间点测定后,在420nm处测光密度,记录吸光值,并且计算吸光值与时间的斜率。斜率和B-半乳糖苷酶的活性成正比。注意:若在420nm处吸光值高于1.0,则不能采信。在计算其实际活性时,先制作o-硝基酚标准曲线图,然后根据样品的吸光值
3、在曲线上找出对应的浓度。一个酶活力单位是指酶在37oC每分钟可催化产生1卩mol的o-硝基酚。收集和裂解细胞的注意事项细胞培养物的收集在适当的培养时间,取出1.6ml的培养物放入微量离心管中,并把它置于冰上。迅速将1.6ml样品在涡旋混匀器上振荡,然后移出100卩I放入已装有900卩L新鲜培养基的比色皿中。离心剩下的1.5ml样品,去掉上层清液,把沉淀迅速放在-80C冷藏。(注意:样品要在-80C而不是-20C冷藏保存)测量并且记录细胞培养物1:10稀释液的OD600值。(注意:OD60值将影响下一步中lacZ酶活力的计算)P.LESSARD2002,保留所有权利。细胞裂解在冰上解冻沉淀。在3
4、74卩LB-PER?细菌蛋白抽提试剂(Pierceproduct78248)中重新悬浮细胞,再加入50ul蛋白酶和磷酸化酶抑制剂以及细菌细胞提取物(Sigma产品P8465;按厂家说明再生),1uL34mg/mL的氯霉素(用甲醇配制),6卩L10mg/ml裂解酶(用蒸馏水现配,当使用大肠杆菌时可以省略这一步)快速涡旋振荡一分钟。在冰上培育5分钟。此时,你就得到了可以用来检测lacZ酶活性的粗制裂解液,使用前面的方法,按照酶所形成的产物的数量/每分钟每0D600单位来测定活力。(注意:对棒状杆菌和红平红球菌,这种方法是采用裂解法时的最好测定方法)对大肠杆菌样品,离心粗制溶解产物1min后放置于冰
5、上。你现在得到的是清亮的溶菌液(上清液中的细胞碎片已被去除)。蛋白质浓度用Bradford方法可以测定(另见蛋白质检测方案)。在清澈溶菌液中使用前面所介绍的方法检测lacZ酶活力,按每分钟每mg蛋白质所形成的nmol产物来测定。(注意:在测定酶活力的时候,用酶活力/mg蛋白质比用酶活力/OD00更恰当)磷酸缓冲液(50ml)49.6ml蒸馏灭菌水0.108gNaH2PO4100.528gNa2HPO4过滤或高压灭菌ONP溶液(10ml)10ml磷酸钠缓冲液0.04go-硝基-?-D-吡喃糖苷10mg/mL裂解酶(1ml)(若使用棒状杆菌和红平红球菌)mg裂解酶加蒸馏水至1ml现配并于冰上保存用于细胞抽提的蛋白磷酸化酶抑制剂Sigma产品P8465按厂家说明配制过滤消毒并等份装于1ml容器中,-20oC保存提前准备并等份装于200ul容器中,-80oC保存镁离子溶液(1ml)610uldH2O290ul?硫基乙醇100ul1MMgCl20.4MNa2CO3(终止液)500ml21.2gNa2CO3加蒸馏水到500ml提前准备上述试剂,于室温贮藏34mg/ml氯霉素液10ml340mg氯
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