细胞工程基本原理第一节细胞培养的设施和仪器设备

1、细胞工程基本原理第一节细胞培养的设施和仪器设备1细胞工程 (Cell engineering)*按一定设计方案，在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官及个体，创造优良品种和产品的生物工程。绪论与课程介绍 P1-4细胞生物学、生物工程是其基础5细胞工程的研究内容* 细胞与组织培养(Cell/Tissue culture)(P1) 细胞融合或细胞杂交(Cell fusion/hybridization)： 在自然或人工诱导条件下，两个或两个以上细胞 形成一个细胞的过程 运用：单克隆抗体技术 细胞核移植(Nuclear transplantation)：利用显微操作 技术

2、，将胞质与胞核分离，再将不同来源的胞质与胞核 重组，形成一个新的杂合细胞绪论与课程介绍 P1-46细胞工程的范畴 染色体工程(Chromosome engineering)： 将单个染色体、染色体组转入或移出目的细胞，使目的 细胞的染色体组发生变化 胚胎工程(Embryonic engineering)： 以生殖细胞和胚胎细胞为对象，进行的细胞工程操作 运用：畜牧业绪论与课程介绍 P1-47细胞工程的范畴 干细胞与组织工程(Tissue engineering)： 将干细胞与材料科学相结合，将自体或异体干细胞经体外 扩增后，种植在预先构建好的聚合物支架上，在适宜条件 干细胞沿聚合物支架迁移、铺

3、展、生长、分化，最终发育 为具有特定形态和功能的工程组织。 转基因生物与生物反应器(P2)： 绪论与课程介绍 P1-48绪论与课程介绍 P1-4细胞工程发展的4个基本阶段 P3-4细胞与组织培养细胞融合细胞核移植转基因生物9“细胞生物学”与“细胞工程”的区别？细胞生物学 是研究细胞的生命活动规律及其机制的基础性学科 研究内容： 在分子、细胞和个体水平上研究细胞的结构、功能、表型及其调控机制； 着重细胞活动的精细分子调节机制及复杂的调控网络研究 细胞生物学：一级学科细胞工程：二级学科10主要以细胞为对象，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性生物技术。细胞工程(Cell enginee

4、ring)11前沿性：现代生物技术的热点综合性：多学科交叉应用性：工程类课程，重在产品与技术争议性：新技术给伦理道德带来的冲击细胞工程特点12发酵工程酶工程基因工程细胞工程组织工程蛋白质工程代谢工程细胞工程是现代生物工程技术中最具有现代性和生命力的组成部分，细胞工程课程在生物工程与生物技术人才培养中具有重要的作用。该课程是生物工程、生物技术专业的核心课程之一。现代生物工程131997年多莉羊口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、及干扰素、凝血因子和、生长激素、免疫球蛋白以及单克隆抗体等。 2001年人耳鼠动物细胞工程的成果14第一章 细胞工程的设施与技术基础 细胞培养的设施

5、和仪器设备 细胞培养的条件无菌操作基础-清洗与消毒15第一节细胞培养的设施和仪器设备16细胞培养的设施和仪器设备实验室设计与要求： 严格的无菌环境 无微生物污染 不受其它有害因素的影响细胞培养室的设计原则：无菌操作室最好单独设置，设在室内较少走动的内侧 常规操作和封闭培养于一室 培养、储存位于中间清洗、消毒在另一侧1718无菌操作室培养室制备室：通常是单独的，对无菌的要求不如上述严格，培养基等的制备清洗室：器皿等清洗消毒灭菌室储藏室：液氮罐、冰箱、培养基、消毒后培养器皿常于一室，即常称的细胞培养室动物工程实验室的设置及六项工作室19常用仪器与设备（P9）滤器，酸缸超净工作台CO2培养箱显微操作

6、仪、倒置显微镜液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪冰箱培养器皿：培养瓶、培养皿、培养板离心设备：离心机、离心管、移液管/吸管/移液器摇床水纯化装置压力蒸汽消毒器电热干燥箱细胞计数器/仪、计数板20工作原理利用鼓风机驱动空气滤过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒而净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。 超净工作台21超净工作台：也称净化工作台 （形成气流屏障）。常见类型（P9） 侧流式（垂直式，吸气型） 外流式（水平层流式，面向操作者流动，吹气型）超净工作台22侧流式超净工作台2324无菌操作间：一般由更衣间、缓冲间和操作间三部分组成。操作间放置：超净工作台及二氧化碳培养箱、离心机、倒置

7、显微镜等。缓冲间放置：电冰箱、冷藏器及消毒好的无菌物品等。实验室布局2526 CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题： 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微 松，以保证通气。 保持培养箱内空气干净。定期消毒 （90，14hrs)。 箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以 保持箱内湿度，避免培养液蒸发。CO2培养箱27二氧化碳培养箱控制中心(包括键盘、显示器、指示器等) 28二氧化碳培养箱的结构29大容量细胞培养箱细胞转瓶机30倒置显微镜31自动双重纯水蒸馏器纯水仪纯水装置32过滤装置-过滤除菌各种培养用液只能用过滤的方法进行除菌消毒处理。微孔滤膜滤器是目前

8、应用最广泛的过滤装置33液氮容器冰箱冰箱与液氮罐34压力蒸汽消毒器35压力蒸汽消毒器36移液器37常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。 培养皿、培养瓶和培养板381个10cm培养皿 个6cm培养皿1个6cm培养皿 = 2个3cm培养皿1个3cm培养皿 = 1个6孔板1个6孔板 个12孔板 = 4-6个24孔板经验数据39生物安全的责任和义务 保证培养物不受污染，更要保证培养物不对人和环境造成 污染和危害 从事致病性微生物实验的科研、教学、生产单位，实验室 必须有防止致病性微生物扩散的制度和人体防卫措施实验室的生物安全(补充)40 据病原微生物的传染性、感染后对个体或人群的危害程度分为

9、4类： 一类：引起非常严重疾病的微生物实验室的生物安全病原微生物的分类 二类：引起严重疾病，较易直接或间接人与人、动物与人、 动物与动物间传播的微生物 三类：可引起人与动物疾病，但不构成严重威胁，传播风险有限，实验室 感染很少引起严重疾病，且能有效治疗和预防的微生物 四类：一般不会引起人与动物疾病的微生物41 据对病原微生物的生物安全防护水平，按国家实验室生物安全认可准则， 将实验室分为4级(细则略) BSL-1：不得从事高致病病原微生物实验实验室的生物安全实验室生物安全等级 BSL-2：不得从事高致病病原微生物实验 BSL-3：可从事高致病病原微生物实验，须经国家认可 BSL-4：可从事高致

10、病病原微生物实验，须经国家认可42第二节 细胞培养的条件补充材料及参阅P42-5143恒定的细胞生长温度 合适的气体环境优质血清 合适的细胞培养基无菌无毒的细胞培养环境 培养细胞的体外生存条件441. 恒定的温度:37 人体细胞培养的标准温度为36.50.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡培养细胞对低温的耐受力较对高温强人体细胞在39-40 1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复当温度在43以上1小时，细胞全部死亡452. pH：当pH低于或高于时的生长会受到影响，甚至死亡。 酚红在培养基中被用来作为pH值的指示剂: 酸性培养液呈橙黄色 碱性培养液呈深红色 细胞耐酸性比

11、耐碱性大一些463. 气体有调节pH值的作用。开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。474. 营养培养基保证细胞渗透压培养液里的成分要满足细胞进行代谢所需要的各种营养成分：12种必需氨基酸多种非必需氨基酸碳水化合物(主要是六碳糖)维生素无机盐类48动物细胞培养基的发展过程天然培养基阶段合成培养基阶段无血清培养阶段49动物细胞培养基的基本要求营养成分氨基酸单糖维生素无机盐促生长因子及激素适宜的渗透压：260-320mOsm/kg50天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点

12、：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染。 4.1 天然培养基511951年厄尔开发了供动物细胞体外生长的人工合成培养基(MEM)合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的目前已设计出许多种培养基，如DMEM、MEM、IMDM、 RPMI-1640、 M199、Ham12、McCoys 5A等4.2 合成培养基52合成培养基优缺点：优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成本低缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要4.2 合成培养基53培养基的配制举例RPMI-1640培养粉 1袋碳酸氢钠

13、2.0 g青、链霉素 各100单位毫升加三蒸水至 1000ml，调节pH值至4过夜，过滤除菌54无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子等无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖4.3 无血清培养基55无血清培养基的组成及其主要补充成分（1）激素和生长因子（2）结合蛋白（3）贴壁因子和扩展因子（4）低分子量营养因子4.3 无血清培养基56可提高产品的表达水平、简化了提纯、鉴定 各种细胞产物的程序使

14、细胞产品易于纯化有利于体外培养细胞的分化避免血清组分对实验研究的影响避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染可避免血清批次间的质量变动，保证细胞培养和 实验结果的重复性、准确性、可重复性和稳定性无血清培养基的优点57无血清培养基的缺点培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便细胞的适用范围窄细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和 化学因素的影响58无血清培养基的应用领域研究细胞的分化条件用于激素、生长因子和药物等与细胞相互作用的研究用于从多种细胞混杂的培养基中选择目的细胞肿瘤病理学和病因学的研究用于生产疫苗、单克隆抗体和生物活性蛋白等生物制品用于干细胞的研究59向无血清培养液中添加能促进细胞系生

15、长的补加物 都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种 细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广无血清培养基应用的局限605. 血清提供有利于细胞生长增殖所需的生长因子、激素， 提供合成培养基所缺乏的营养物质提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白， 对这些物质起到稳定和调节作用；结合蛋白还可消除某些 毒素和金属对细胞的毒性作用为贴壁细胞的附着提供适当的贴壁因子和扩展因子提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋白酶的损伤提供 pH 缓冲物质，调节培养基pH影响培养系统中的某些物理特性如：剪切力、黏度、 渗透压和气体传递速度61主要的血

16、清类型胎牛血清 (fetal bovine serum， FBS)新生牛血清 (new calf serum， NCS)马血清 (horse serum ，HS)胎牛血清是从母牛剖腹取出的胎牛中分离出的血清价格昂贵、质量最好优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、 支原体、病毒污染62血清质量好坏是细胞培养成败的关键5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞 不死，但支持细胞生长一般需加10血清血清与细胞培养原代细胞需要较高浓度的小牛血清或胎牛血清；对于 肿瘤细胞，当研究生长因子、激素对其影响时，需要 极低浓度血清或无血清63血清的灭活(消除补体活性):56 ，30分钟血清的保存、灭活

17、血清贮存:20-70，4可短时贮存约一个月。血清分装：可将4045mL分装于无菌50mL离心管或消毒玻璃瓶*血清结冻时体积增加约10%，须预留空间，以防污染或容器冻裂血清过滤：商业血清为无菌，不需再无菌过滤。 若发现血清有许多悬浮物，37溶解几分钟，将血清加入 培养基内一起过滤，勿直接过滤血清64血清的保存、灭活血清解冻 (逐步解冻法): -20或70至4冰箱 溶解一天，至室温下全溶后再分装在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)， 使温度均一，减少沉淀的发生勿直接由20直接至37解冻，因温度改变太大， 容易造成蛋白质凝结而发生沉淀65在一些基础研究中，往往影响实验结果血清中含有某些不利于

18、细胞生长的毒性物质或抑制物质，对某些细胞的体外培养有去分化作用血清中大量成分复杂的蛋白质给疫苗、细胞因子、单克隆抗体等细胞产品的分离纯化带来很大困难细胞培养中血清可能引发的问题666. 抗生素在培养基配制后，培养基内添加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长通常是青霉素P.链霉素S.联合使用。培养基内P.S.最终使用浓度为每毫升100单位或微克676. 抗生素建议：常规细胞培养中尽可能不使用抗生素培养污染源很多(比如组织培养)，或者珍贵细胞株才 使用抗生素作脂质体介导质粒转染时，细胞最好提前于无抗生素的 培养基培养，防细胞死亡680.01M PBS* (pH7.4, 高压灭菌)组分含量(g/L

19、)NaCl8.0KCl0.2Na2HPO4Na2HPO47H2ONa2HPO412H2O1.44 2.683.58KH2PO40.24H2O10007. 缓冲液1PBS(Phosphate-Buffered Sallines)69Hanks 平衡盐溶液(Hanks Balanced Salt Solutions, HBSS)成分含量(g/L):CaCl2(无水氯化钙)KClKH2PO4MgCl26H2O0.140.400.060.10HBSS708. 消化液作用：分离组织和分散细胞常用消化液：胰蛋白酶二乙胺四乙酸二钠(EDTA)通常使用浓度: 0.25% Trypsin: 0.25g in P

20、BS 0.02%-0.03% EDTA:0.02-0.03g EDTA；过滤；-20 保存71胰蛋白酶(简称胰酶)：黄白色粉末，易潮解，冷暗干燥处保存 用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制目前应用的胰蛋白酶主要来自牛或猪的胰腺胰酶的主要作用是使细胞间的蛋白质水解，离散细胞 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去 细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离胰酶简介8.1 胰蛋白酶72胰酶对细胞的分离作用与细胞的种类和细胞的特性有密切关系 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞通常：胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟用含血清培养液可终止其对细胞的消化作用8.1

21、胰蛋白酶73EDTA是一种化学螯合剂，对细胞毒性小，价格低廉，使用方便通常与胰蛋白酶溶液混合使用(混合液)，使用浓度见前注意：使用EDTA 处理细胞后，一定要用Hanks 液冲洗干净，因残留的EDTA 会影响细胞生长。 8.2 EDTA4Na 溶液74第三节 无菌操作基础-清洗与消毒75器皿的清洗和消毒P17-20清洗的目的：去杂质；去微生物清洗的要求：干净；无油迹；无残留物消毒的目的：防微生物污染76器皿的清洗 玻璃器皿的清洗浸泡： 清水浸泡-软化与溶解附着物 盐酸浸泡-中和碱性物质刷洗：泡酸：有效去杂质洗液(清洁液)的配制：次强液：重铬酸钾 120g, 浓硫酸：200ml 水： 1000m

22、l强洗液：重铬酸钾 63g, 浓硫酸：1000ml 水： 200ml冲洗：去残留物、去酸液77器皿的清洗 胶塞的清洗水洗：去滑石粉；去杂质洗衣粉或2%NaOH煮沸：去蛋白1%HCl中和78器皿的清洗 塑料制品的清洗使用过的要及时浸泡不可反复使用 不锈钢器皿的清洗去污洗衣液清洗，不可泡酸79器皿的消毒 物理灭菌法紫外线消毒：破坏微生物的核酸、蛋白质；产生臭氧电离辐射消毒：X射线、g 射线破坏微生物的核酸、蛋白质湿热(高压蒸汽)消毒：最广泛、最有效干热消毒：电热烤箱法，主要适于玻璃器皿过滤除菌：，可去较大分子；可去细菌80 化学灭菌法适于不能用物理消毒法灭菌的物品和场地器皿的清洗1新洁尔灭: 实验台、细胞间地