应医学院10医检专微生物检验ppt课件

1、第三章 细菌感染的病原学诊断褚云卓本章内容第一节 标本的采集和处置原那么第二节 细菌的形状学检查第三节 细菌的分别培育和鉴定第四节 细菌的非培育检测方法第一节 标本的采集和处置原那么一、标本采集的普通原那么1早期采集 2无菌采集 3根据目的菌的特性用不同的方法采集4采集适量标本 5平安采集 第一节 标本的采集和处置原那么二、标本的处置1. 对环境敏感的细菌如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血杆菌等应保温并立刻送检2. 其他一切的标本采集后最好在2h之内送到实验室3. 假设不能及时送检，标本应置于一定环境中保管4. 普通情况下，用于细菌培育的标本保管时间不应超越24h.病人标本中能够含有大量致病

2、菌，必需留意平安防护.标本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必需包装好，防止送检过程中倒翻或碰破流出.对于烈性传染病标本运送时更要特别严厉，必需按规定包装，由专人运送.厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，有时可直接用抽取标本的注射器运送第二节 细菌的形状学检查1.包括不染色标本检查法和染色标本检查法2.镜检可以了解有无细菌及大致的菌量3.根据细菌形状、构造和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类4.经过形状学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义第二节 细菌的形状学检查一、不染色标本1.细菌不经染色直接镜检，主要用于检查生活形状下细菌的动力及运动情况2.常用的方法有压滴法

3、和悬滴法 有动力：可看到细菌自一处移至另一处，有明显 的方向性位移 无动力：细菌呈现布朗运动，只在原地颤抖而无 位置的改动第二节 细菌的形状学检查3.有些病原菌经过不染色标本的动力检查可作出初步鉴定 如疑似霍乱患者，镜下察看到来回穿越似流星状运动的细菌，制动实验阳性，可初步推断为“疑似O1群霍乱弧菌。第二节 细菌的形状学检查二、染色标本一常用染料1碱性染料：碱性复红、结晶紫、美蓝等2酸性染料：有伊红、刚果红等3复合染料中性染料及荧光染料：复合染料有瑞氏染料伊红美蓝、姬姆萨染料伊红天青等；荧光染料有荧光标志的抗体 第二节 细菌的形状学检查二常用的染色方法1革兰染色gram stain 革兰阳性球

4、菌 革兰阴性杆菌第二节 细菌的形状学检查2抗酸染色 acid-fast stain 可将细菌分为两大类： 即-抗酸性细菌 -非抗酸性细菌第二节 细菌的形状学检查3荧光染色 1荧光染色法敏感性强，效率高而且容易察看结果，在临床细菌鉴定中有很大的适用价值。2主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。第二节 细菌的形状学检查4.鞭毛染色 可察看到菌体上有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。5.异染颗粒染色 用于白喉棒状杆菌染色。第二节 细菌的形状学检查6.芽胞染色： 绿色部分 为芽胞第二节 细菌的形状学检查7.墨汁染色: 普通用于新型隐球

5、菌检查第三节 细菌的分别培育和鉴定一、培育基的种类和选择 培育基的组成成分、培育基种类、培育基的选择二、分别及培育 细菌的分别、细菌培育方法三、生化反响和鉴定 碳水化合物的代谢实验 蛋白质和氨基酸的代谢实验 碳源和氮源利用实验第三节 细菌的分别培育和鉴定一、培育基的种类和选择 培育基culture medium 是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁衍运用的混合营养物制品。 第三节 细菌的分别培育和鉴定(一)培育基的组成成分1营养物质 蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖类、醇类、血液、 无机盐类、鸡蛋和动物血清生长因子2凝固物质 琼脂、明胶、卵白3抑制剂和指示剂第三节 细菌的分别培育和鉴定二培育基种

6、类1根底培育基based medium2营养培育基nutrient medium3鉴别培育基diferential medium4选择培育基selective medium5特殊培育基special medium第三节 细菌的分别培育和鉴定1根底培育基 含有根底生长所需的根本营养成分，最常用的是肉浸液，俗称肉汤broth，主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。第三节 细菌的分别培育和鉴定2营养培育基nutrient medium 最常用的是血琼脂平板、巧克力血平板等第三节 细菌的分别培育和鉴定 3鉴别培育基diferential medium 糖发酵管、克氏双糖铁琼脂KIA、伊红-镁蓝琼脂和动力-吲哚-

7、尿素MIU培育基等。第三节 细菌的分别培育和鉴定4选择培 selective medium SS琼脂使致病的沙门菌、志贺菌容易分别到第三节 细菌的分别培育和鉴定5特殊培育基 special medium 疱肉培育基、 巯基乙醇酸纳培育基第三节 细菌的分别培育和鉴定三培育基的选择 根据标本来源和能够存在的病原菌，确定选用各种分别培育基。伊红美蓝/麦康凯用于挑选革兰阴性杆菌。第三节 细菌的分别培育和鉴定三培育基的选择 从血液、骨髓中分别病原菌用血液增菌培育基 第三节 细菌的分别培育和鉴定1平板划线分别法2斜面接种法3液体接种法二、分别及培育一细菌的分别4穿刺接种法5倾注平板法6涂布接种法第三节 细

8、菌的分别培育和鉴定二细菌培育方法 1需氧培育法 2二氧化碳培育法 3厌氧培育法 第三节 细菌的分别培育和鉴定三、生化反响和鉴定一碳水化合物的代谢实验 1. 糖醇、苷类发酵实验 是鉴定细菌最主要和最根本的实验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要第三节 细菌的分别培育和鉴定2氧化发酵实验O/F实验 主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。第三节 细菌的分别培育和鉴定3半乳糖苷酶实验ONPG实验 迅速及缓慢分解乳糖的细菌ONPG实验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于缓慢发酵乳糖菌株的快速鉴定。第三节 细菌的分别培

9、育和鉴定4七叶苷水解实验 主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别。5甲基红实验 主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌。6VP实验 本实验常与甲基红实验一同运用，由于前者阳性的 细菌，后者通常为阴性。第三节 细菌的分别培育和鉴定2吲哚(靛基质)实验 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。二蛋白质和氨基酸的代谢实验1明胶液化实验 主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。第三节 细菌的分别培育和鉴定3硫化氢实验 培育基：醋酸铅培育基 运用：主要用于肠杆菌 科中属及种鉴别第三节 细菌的分别培育和鉴定4尿素分解实验 主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。5苯丙氨酸脱氨酶实验 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗菲登斯菌

10、属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。6氨基酸脱羧酶实验 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。第三节 细菌的分别培育和鉴定三碳源和氮源利用实验1枸橼酸盐利用实验 用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。2丙二酸盐利用实验 肠杆菌科中属间及种的鉴别。第三节 细菌的分别培育和鉴定四各种酶类实验1氧化酶实验 主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别。2过氧化氢酶实验触酶实验 用于革兰阳性球菌的初步分群。第三节 细菌的分别培育和鉴定 3硝酸盐复原实验 本实验在细菌鉴定中广泛运用。肠杆菌科细菌均能复原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球菌等实验也为阳性。第三节

11、细菌的分别培育和鉴定4脂酶实验 主要用于厌氧菌的鉴别。5卵磷脂酶实验 主要用于厌氧菌的鉴定。6 DNA酶实验 在革兰阳性球菌中只需金黄色葡萄球菌产生 DNA酶，在肠杆菌科中沙雷氏菌和变形杆菌 产生此酶。第三节 细菌的分别培育和鉴定8 CAMP实验 在链球菌中，只需B群链球菌CAMP实验阳性，故可作为特异性鉴定。7 凝固酶实验 作为鉴定葡萄球菌致病性的重要目的，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个实验。第三节 细菌的分别培育和鉴定五抑菌实验1 O/129抑菌实验 用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属 对O/129敏感，而气单胞菌属耐药。2杆菌肽实验 用于A群链球菌与非A群链球群的鉴别。3奥普托欣Op

12、tochin实验 主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。第四节 细菌的非培育检测方法一、免疫学检测 抗原检测、抗体检测二、分子生物学检测 核酸杂交、聚合酶链反响、生物芯片技术三、细菌毒素的检测 内毒素、外毒素四、动物实验 第四节 细菌的非培育检测方法一、免疫学检测一抗原检测 免疫荧光技术是利用免疫学特异性反响与荧光示踪技术相结合的显微镜检查手段。既坚持了血清学的高特异性，又极大地提高了检测的敏感性，在细菌鉴定方面占有重要位置。常用的方法有直接法、间接法和免疫荧光菌球法。第四节 细菌的非培育检测方法一、免疫学检测二抗体检测 抗体的量常随感染过程而增多，表现为效价的升高。因此用知的细菌或其特异性抗

13、原检测病人血清中有无相应抗体及其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。主要适用于抗原性较强的致病菌和病程较长的感染性疾病。第四节 细菌的非培育检测方法二、分子生物学检测一核酸杂交 DNA可进展变性、复性、杂交。我们利用这一特性，制备特定序列DNA片段，进展标志后用作探针，在一定条件下，按照碱基互补配对原那么与标本中已变性的细菌DNA进展杂交，经过检测杂交信号确定能否发生杂交反响，从而鉴定标本中有无相应的病原菌基因。第四节 细菌的非培育检测方法二、分子生物学检测一核酸杂交 1. 探针的种类 1全染色体DNA探针2染色体克隆片段DNA探针3质粒DNA探针4rRNA基因探针5寡核苷酸探针第四节

14、 细菌的非培育检测方法 2核酸杂交在临床细菌检测中的运用1细菌分类鉴定2细菌快速鉴定3细菌耐药性的检测4细菌毒素的检测5细菌流行病学调查第四节 细菌的非培育检测方法二聚合酶链反响 polymerase chain reaction,PCR 1. 特异性DNA体外扩增技术 2. 特异、灵敏、快速、操作简便 3. 广泛运用于细菌的鉴定第四节 细菌的非培育检测方法PCR在临床细菌检测中的运用1. 细菌的快速检测 2. 细菌毒素的检测 3. 细菌耐药性的检测 4. 细菌流行病学调查 第四节 细菌的非培育检测方法三生物芯片技术 1. 经过微加工技术和微电子技术在固体芯片 外表构建微型生物化学分析系统。 2. 对细胞、蛋白质、DNA以及其他生物组分的 准确、快速、大信息量的检测。 3. 常用的生物芯片分为二大类：即基因芯片和 蛋白芯片。第四节 细菌的非培育检测方法三、细菌毒素的检测一内毒素 内毒素的测定，主要用于确诊病人能否发生革兰阴性细菌感染。另外，还可用于检测注射用液和生物制品有无内毒素污染。 方