层析分离纯化技术策略通用PPT课件

1、蛋白层析分离纯化技术1分离和纯化蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括1.分子的大小和形状2.酸碱性质3.溶解度4.吸附性质5.对配体分子的特异生物学亲和力。 2常用测定方法：1. 根据化学组成测定最低相对分子质量2. 凝胶过滤法测定相对分子质量3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量4.渗透压法5.沉降分析法（离心）3沉淀蛋白质的方法(1) 盐析法(2) 有机溶剂沉淀法(3) 重金属盐沉淀法(4) 加热变性沉淀法4蛋白质纯化策略融合蛋白质非融合蛋白质表达简单纯化一步 亲和层析90 - 97 % 纯度更高纯度三步纯化策略粗提中度纯化精细纯化多步纯化5高效纯化策略粗提纯化精细

2、纯化载量速度分辩率回收率6减少处理步骤得率 (%)95% / 步90% / 步85% / 步80% / 步75% / 步02040608010012345678步骤7准备工作 考虑:纯度水平需要量保持生物活性有效和经济 蛋白质特性:稳定性- pH- 离子强度- 温度分子量等电点8pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变滴定曲线蛋白质净电荷 1210稳定性范围用阳离子交换用阴离子交换3pH不同 pH 下的分离情况21+-9pH 的重要性: 蛋白质净电荷随 pH 改变流动相的 pH 选择性VVV阳离子阴离子pH0+-VVVVVAbsAbsAbsAbs表面净电荷Abs Abs Abs Abs10

3、样品准备考虑:根据蛋白质来源选择不同萃取方法使用温和的步骤减少酸化和释放蛋白酶在室温以下快速处理用缓冲液维持 pH, 离子强度目的: 稳定样品11三步纯化策略Step 纯度粗提 中度纯化 精细纯化 样品准备,萃取,净化 达到最高纯度去除大部分杂质 分离, 浓缩和稳定样品12三步纯化策略步骤粗提精细纯化层析填料的颗粒大小中度纯化13三步纯化策略步骤粗提精细纯化流速中度纯化14三步纯化策略步骤粗提精细纯化分辩率中度纯化15前处理分离纯化某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至

4、去种皮以免受杂质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。16样品预处理污染物害处预防措施絮状物堵柱膜过滤、离心、匀浆脂类阻断配基、引致凝集、非特异吸附离心、如可跟目标分子兼容，可用有机溶剂核酸阻断配基、高黏度添加硫酸链霉素、硫酸精蛋白或锰盐沉淀核酸、添加核酸酶蛋白酶分解目标分子添加蛋白酶抑制剂、用亲和层析去除蛋白酶、缩短粗分时间、低温操作17粗提目的纯化粗样快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶)最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析分辩率快速回收率载量18粗提: 离子交换填料预装柱 20ml颗粒大小流速HiPre

5、p 16/10 Q XL & SP XL 90 m 10 ml/minHiPrep 16/10 DEAE & CM 90 m 10 ml/minSepharose Big BeadsSTREAMLINESepharose Fast Flow19粗提: 疏水层析填料高载量高流速HiPrep 16/10 Phenyl (高 & 低取代)HiPrep 16/10 ButylHiPrep 16/10 OctylHiTrapHIC 选择试剂盒放大20中度纯化目的 去除大部分杂质最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析HiLoad离子交换和疏水层析预装柱分辩率快速回收率载量21中度纯化: 离子交换填料Se

6、pharose HP 34 mQ & SP150 cm/hr小包装和预装柱 交联琼脂醣SOURCE 30 mSepharose High PerformanceSOURCE 30 Q & S 25 mg 上样载量3 m: Mini Q & SMini Beads Q & S 2 mg上样载量26精细纯化:离子交换和疏水层析填料RESOURCE15 mQ, S, Phenyl, Ether, Isopropyl1 ml 预装柱流速高达10 ml/min RESOURCE HIC Test Kit27精细纯化:反相层析填料SephasilRPCSOURCE RPC硅胶3 mC2/C18聚苯乙烯/二

7、乙烯基苯120 : 肽类C4, C8, C185 and 12 m硅胶100 : 肽类300 : 蛋白质pH 1 - 12 (14)肽类5, 15 and 30 m28Source30 m15 m5 m离子交换/疏水层析/反相层析反相层析离子交换/反相层析29适用於三步纯化策略的层析技术蛋白质性质层析技术净电荷离子交换(IEX)大小凝胶过滤(GF)疏水性疏水层析(HIC), 反相层析(RPC)生物辩识 (配基特异性)亲和层析(AC)配基特异性，净电荷, 扩张柱床吸附技术 (EBA) 疏水性有AC, IEX or HIC30适用於三步纯化策略的层析技术层析技术主要特色粗提中度纯化精细纯化IEX高

8、分辨率高载量快速HIC分辨率好载量一般快速AC高分辨率高载量快速GF高分辨率RPC高分辨率31适用於三步纯化策略的层析技术层析技术样品起始状态样品结束状态IEX低离子强度高离子强度或 pH 改变样品体积不受限制样品被浓缩HIC高离子强度低离子强度样品被浓缩AC特异性结合特异性洗脱条件样品体积不受限制样品被浓缩GF样品体积受限制交换缓冲液 (2 M (NH4)2SO4容易氧化43DAOCS - 一般准则在所有缓冲液中加 DTT 使所有半胱氨酸残基保持还原状态加入蛋白酶抑制剂以保持生物活性用 SDS PAGE 检查每一个组份中 DAOCS利用酶测定法测量生物活性44准备样品悬浮细菌细胞在溶解缓冲液

9、中超声震荡破碎细胞DNA 沉淀利用离心沉淀来源:从 S. Clavuligerus 克隆得到的DAOCS 基因 和在大肠杆菌的胞浆中扩增45选择粗提的层析技术阴离子交换: 快速, 浓缩样品处理最简单分离基础: 电荷因为 DACOS 的酸性 pI 和不稳定性，所以缓冲液选择中性 pH46粗提 - 在 KTAFPLC 上优化梯度线性梯度步级梯度优化梯度层析柱:HiPrep 16/10 Q XL系统:KTAFPLC0102030min01002003001002003004000020406080mAUmlmS/cm01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm010

10、20min01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01020min47选择中度纯化技术HIC: 分离基础: 疏水性蛋白质疏水性质很难预测: 筛选适合填料HIC 可以跟 IEX 互补衔接, 减少样品处理步骤 (只需要加盐)DAOCS 在高盐下能保持稳定48选择精细纯化的层析技术GF:分离基础: 分子量差异 GF: 最适合分离双体，寡聚体和聚合物49DAOCS - 优化好的粗提步骤层析柱:HiPrep 16/10 Q XL系统:KTAFPLC浓缩样品快速去除有害物质01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm50DAOCS -

11、优化好的中度纯化步骤层析柱: SOURCE 15ISO内径 16 mm, 长度 50 mm系统:KTAFPLCHIC 和 IEX 互补浓缩样品除去大部分杂质01002001002003004000mlA280 nm51DAOCS -优化好的精细纯化步骤层析柱: HiLoad 16/60 Superdex 75 prep grade系统: KTAFPLC去除聚合物和余下的少量污染物交换缓冲液08060402010020040060080010000mlmAU52DAOCS - 用 SDS分析4321MMM-LMW 低分子量标记1-样品2-组份 - Q Sepharose XL3-组份- SOUR

12、CE 15ISO4-组份- Superdex 75 pg67k43k30k53DAOCS 纯化 - 结果粗提中度纯化精细纯化08060402010020040060080010000mlmAU01002001000200030000020406080mAUmlmS/cm01002001002003004000mlmAu54DAOCS 纯化 - 结果DAOCS 的高分辨电子密度图谱结晶 DAOCS 的 X-射线绕射图感谢瑞典农业科技大学的 Prof. Inger Andersson 和 Dr. Anke Terwisscha van Scheltinga, 以及瑞典 Uppsala 大学生化系的 Dr. Karin Valegrd 提供以上图片55中度纯化DAO