肿瘤的分子生物学检验技术PPT通用课件

1、 第十五章 线粒体病的分子生物学检验技术滨医附院检验科 袁笑“千手观音” 21位聋哑演员中 18人有药物史部分患者使用正常剂量也会致聋“一针致聋”现象线粒体基因突变（A1555G）+环境（使用氨基糖苷类）线粒体（Mitochondrion）31. 真核细胞中的细胞器，二分裂方式进行新陈代谢，平均寿命10天2. 多数细胞含几个到几千个线粒体3. 每个线粒体含2-10 线粒体DNA（mtDNA）线粒体的主要功能 1、参与人体很多重要的生物化学过程（三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸分解代谢、血红素合成和部分尿素合成过程）被称为“细胞的能量工厂” 2、线粒体体积大小，数量增减反应器官功能负荷的变化。第一

2、节线粒体基因组及其表达系统第一节 线粒体基因组与线粒体病人体细胞中的线粒体DNA具有自主的DNA复制、转录功能，为非孟德尔遗传方式，故称为25号染色体。25号染色体7（一）人类线粒体基因组1、基因组小, 16569 bp2、双链环状DNA外环富含鸟嘌呤称为重链，内环富含胞嘧啶称轻链3、1）编码区 13 结构基因 / mRNA22 tRNA 基因2 rRNA 基因2）非编码区D-loop（约1120bp）L链复制起始区（约3050bp，tRNAAsn-tRNACys）一、线粒体基因组及其表达系统1、结构基因7个为NADH-CoQ还原酶复合体（复合体）的亚基（ND1、ND2、ND3、ND4L、ND

3、4、ND5和ND6）1个编码的结构蛋白质为CoQH2-细胞色素c还原酶复合体（复合体）中细胞色素b的亚基 3个为构成细胞色素c氧化酶（COX）复合体（复合体）催化活性中心的亚单位（COX、COX和COX）2个为ATP合酶复合体（复合体）F0部分的2个亚基（A6和A8）1、结构基因2、tRNA基因22个tRNA 基因可转录20种tRNA 满足线粒体内蛋白质翻译的需要。tRNALeutRNASer 都有2个基因外，其余18种均只有1个基因。3、rRNA基因1、mtRNA 编码两种rRNA,即12SrRNA16SrRNA2、位于H链tRNAPhetRNALeu之间以tRNAVal相隔 3、变异常发生

4、在二级结构茎环上。4、非编码区D-loop（约1120bp）位于tRNAPro和tRNAPhe基因之间，约1120bp,是mtDNA中变异最多的区域，参与并调控mtDNA的复制和转录。L链复制起始区（约3050bp，tRNAAsn-tRNACys可折叠成茎环结构。（二）线粒体基因表达系统及特点1、密码子1979年，Barrell 报道了人线粒体DNA所用的遗传密码。 通用遗传密码和线粒体遗传密码的差异密码子线粒体DNA编码核DNA编码UGA色氨酸终止AUA起始异亮氨酸AGG终止精氨酸（二）线粒体基因表达系统及特点2、mtDNA复制特点D环复制为主要模式，重链以逆时针方向复制，轻链以顺时针方向复

5、制。nDNA只在细胞分裂时复制，mtDNA一直处于分裂状态，并由nDNA编码的调控因子控制。mtDNA复制特点 mtDNA可进行半保留复制，其H链复制的起始点（OH）与L链复制起始点（OL）相隔2/3个mtDNA。复制起始于L链的转录启动子，首先以L链为模板合成一段RNA作为H链复制的引物，在DNA聚合酶作用下，复制一条互补的H链，取代亲代H链与L链互补。被置换的亲代H链保持单链状态，这段发生置换的区域称为置换环或D环，故此种DNA复制方式称D-环复制。（二）线粒体基因表达系统及特点3、mtDNA转录的特点对称性转录，重链启动子启动重链顺时针方向转录，轻链启动子启动轻链逆时针方向转录。成熟的m

6、RNA只在3末端加polyA尾巴，5 末端不修饰帽子结构（二）线粒体基因表达系统及特点4、线粒体蛋白质的合成特点 自主编码合成13个多肽，其余功能所需蛋白均由核基因组编码，与细菌合成蛋白质体系十分相似。“共生学说”18核基因组编码了1500多个线粒体蛋白线粒体基因组只编码了13条多肽链“交叉对话（cross-talk）”机制（三）mtDNA与nDNA的相互关系1、nDNA的表达状况可直接影响和调控mt DNA的表达和线粒体蛋白质的生物合成。2、 mt DNA突变可直接影响mt DNA所编码蛋白多肽的合成，而影响有氧呼吸、物质代谢和能量代谢，并进一步通过线粒体功能变化反馈影响nDNA的复制和表达

7、。3、各种转录因子是其通讯的基础。“交叉对话（cross-talk）”机制二、线粒体病的概念因线粒体功能受损或缺陷而导致的疾病。主要累及大脑和肌肉组织。分为线粒体肌病，线粒体脑病、线粒体脑肌病线粒体功能涉及众多的组织器官21三、线粒体病的特征（一）母系遗传与遗传早发线粒体疾病的母系遗传(二)同质性突变与异质性突变与发病阈值效应24线粒体基因同质性（Homoplasmy）0 或 100%异质性（Heteroplasmy） 0-100%核基因纯合子（Homozygous） 0 或 100%杂合子（Heterozygous）50%mtDNA同质性/异质性突变与阈值25线粒体DNA的突变率极高，约比核

8、DNA高10-20倍。 线粒体DNA排列紧凑，没有内含子，任何mtDNA的突变都可能影响其基因组的重要功能；线粒体DNA缺少组蛋白的保护；线粒体DNA容易被呼吸链生成自由基氧化损伤；线粒体中没有DNA损伤的修复系统；四、线粒体病的分子生物学检验标志四、线粒体病的分子生物学检验标志（一）mtDNA碱基位点1、点突变 1）结构基因点突变包括同义突变和错义突变，错义突变导致氨基酸的替换，由此引起蛋白质结构和功能的改变，导致疾病。Leber视神经病（LHON）： G11778A（在ND4基因），G3460A（在ND1基因）1、点突变 2）tRNA基因的点突变，可以降低线粒体内蛋白质的生物合成的能力，从

9、而影响线粒体氧化磷酸化的功能，导致疾病的发生。MELAS综合征（线粒体脑肌病乳酸酸中毒及卒中样发作）：A3243G (80%), T3271C（在tRNA Leu(UUR)基因）四、线粒体病的分子生物学检验标志2、单核苷酸多态性位点单个核苷酸变异引起的mtDNA序列的多态性，与不同人群有关。3、线粒体单体群 在进化过程中，母系遗传的mtDNA为适应环境所形成的碱基位点多态性集合。（二） mtDNA缺失或插入片段 大片段重组包括缺失和重复，以缺失较为常见。 大片段的缺失往往涉及多个基因，可导致线粒体OXPHOS功能下降，产生的ATP减少，从而影响组织器官的功能。 常见缺失： 848313459：

10、Kearns-Sayre综合症（KSS）、缺血性心脏病 ； 863716073：与衰老有关的退行性疾病； 438914812：能量代谢受到严重破坏 。（二） mtDNA拷贝数的变化mtDNA拷贝数可作为评价线粒体功能的指标，当拷贝数减少时导致细胞能量缺乏，由此引发疾病，在胃癌、食管鳞癌等肿瘤细胞中mtDNA拷贝数下降，有可能成为一种新的肿瘤标志物。第二节线粒体病分子生物学检验技术及质量控制一、线粒体病分子生物学检验策略二、线粒体病的分子生物学检验技术（一）PCR-RFLP技术PCR-RELP的质量控制（1）模板DNAD的制备和引物设计：设计合适的引物扩增目的模板DNA（2）酶的选择：去除干扰物

11、质，根据酶活性要求选择适宜的缓冲液、活性剂等，酶的用量不超过总体积的10%。（3）PCR扩增体系和酶切反应条件：优化保证PCR产物的纯度和精度，设计好酶切反应体系，根据内切酶活性，适时终止反应。（4）结果分析：根据酶解片段选择不同浓度的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，染色后观察扩增基因的变异情况。二、线粒体病的分子生物学检验技术（二）变性高效液相色谱法在部分变性的条件下，通过杂合与纯合二倍体在柱中保留时间的差异，发现DNA突变。异源双链DNA与同源双链DNA的解链特性不同，在部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，在色谱柱中的保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，在色谱图中表现

12、为双峰或多峰的洗脱曲线。 DHPLC检测的质量控制1、 DHPLC检测的样本要求（1）片段大小：最好在200-500bp.敏感性最好。（2）样品质量：检测前不许纯化，核苷酸和引物会很早被洗脱，模板大分子在样品峰后洗脱。引物二聚体和非特异性扩增及碱基数类似的污染物需优化PCR去除。（3）样品含量：PCR浓度必须足够大，要求2微升产物经琼脂糖凝胶电泳可见清晰条带，相当于浓度至少20ng/ul.（1）PCR引物的设计：引物长度200-500bp范围，且只有一个溶解区域，无错配的PCR片段（2）PCR反应条件的优化，控制好温度和时间达到模板双链完全变性、复性（3）DHPLC检测上样前要验证PCR产物质

13、量，以保证结果准确性。（4）结果分析：在部分变性条件下出现异源双链峰，表明异质性突变位点，反之则为同源单峰。建议购买阳性质控品。2、DHPLC检测的条件优化二、线粒体病的分子生物学检验技术（三）DNA芯片技术略（四）DNA测序技术略三、线粒体病的分子生物学检验应用（一）MELAS综合征11月23日，读初三的晓炎从学校回家后，顾春娜就感觉女儿脸色不好，以为晓炎在学校吃的没有营养，就赶紧给女儿做了顿好饭。可晓炎吃过饭后不久，就开始呕吐。当晚凌晨2点钟，晓炎出现了全身抽搐的症状，看到女儿四肢颤抖，嘴眼歪斜，顾春娜赶紧拨打120，急救车将女儿送到医院救治。入院后的晓炎，直接被送进了ICU重症监护室。经

14、过医院的多次检查，也没有最终确诊，院方建议顾春娜带晓炎去北京治疗。到了北京儿童医院，终于确诊晓炎患上的是一种因遗传基因的缺陷而导致的线粒体结构和功能的异常，病症名称为线粒体脑肌病。MELAS综合征发病特点母系遗传1040岁发病，10岁前发育正常。首发症状为运动不耐受、卒中样发作、偏轻瘫、失语、皮层盲或聋。并有肢体无力、抽搐或阵发性头痛、智能低下痴呆及乳酸血症MELAS基因已发现4种点突变与大多数MELAS病例有关，其中2种分别在第A3243G、T3271C位核苷酸，最常见其中80%是A3243G的突变45399bp307bp92bpM Un-cut 143B 43B 1 2 A3243G 为异

15、质性突变PCR-RFLP（限制酶Apa）PCR-DHPLCWTA3242Gmt3243 突变DNA序列测定 3243正常序列突变杂合子三、线粒体病的分子生物学检验应用（二）Leber遗传性视神经病变Leber遗传性视神经病是以德国眼科医生Theodor Leber的名字命名的，又称Leber视神经萎缩，为一种急性或亚急性发作的母系遗传病，男女病人比例5:1，至今尚未发现一个男性患者将此病传给后代。视神经与视网膜神经元退化，发病较早，表现急性亚急性视力减退，中心视野丧失明显，导致失明。突变位点基因同质性/异质性首次报道*G3316AND1同质性Saillard et al.(2000)T3394

16、CND1同质性Hofmann et al.(1997)G3460A*ND1同质性/异质性Huoponen et al.(1991)C3497TND1同质性Kong et al.(2003）G3733AND1同质性/异质性Valentino et al.(2004)C4171AND1同质性/异质性Kim et al.(2002)T4216CND1同质性Torroni et al.(1994）A4435GtRNAMet同质性Herrnstadt et al.（2002）G7444ACO同质性Huoponen et al.（1993）T10663CND同质性Brown et al.(1995)G11

17、696AND4同质性/异质性Zhou et al.（2006）G11778A*ND4同质性/异质性Wallace et al.(1988)T12338CND4同质性Wong et al.（2002）G14459AND6同质性/异质性Jun et al.(1994)C14482G/AND6同质性/异质性Howell et al.(1998)T14484C*ND6同质性/异质性Johns et al.(1992)A14495GND6异质性Chinnery et al.(2001)T14502CND6同质性Ozawa et al.（1991）C14568TND6同质性Wissinger et al.

18、(1997)A14693GtRNAGlu同质性/异质性Tzen et al.（2003）A15951GtRNAThr同质性Li et al.（2006）School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College49原发性突变：G3460A， G11778A，T14484C的突变，占全部LHON的 80-90继发性突变：T3394C ，T4216C ，C4019T，G5244A ，C4777T，G9438A ，G13708A ，G15257A新突变： A4435G 位于tRNAMet 基因可以调节ND4 G11778A 突变的外显率与Leber遗

19、传性视神经病变相关的mtDNA突变11778GA 90. 9%,3460GA 1. 8%, 14484TC 7. 3% 是目前公认的致病性最强的三种原发性突变11778GA发病时视力多低于0.1，视力预后也最差；14484TC发病时视力及视力恢复情况明显好于11778GA患者 11778GA导致编码NADH脱氢酶亚单位4(ND4)中第340位的Arg精His组，改变ND4空间构型，NADH脱氢酶活性降低，线粒体产能效率下降，视神经细胞提供能量不能长期维持视神经完整结构，导致神经细胞退行性变、死亡。11778 GA3460GA(ND1) 14484TC(ND6)Leber病变相关的mtDNA突变

20、常用检测技术PCR-RFLP技术PCR-SSCP技术DHPLC技术DNA测序技术School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College52G3460A， G11778A，T11484C原发性突变测序图三、线粒体病的分子生物学检验应用（三）药物性耳聋突变位点基 因同质性/异质性疾 病首次报道aT961delT+C(n)ins961insC12S rRNA同质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Bacino et al.(1995)Tang et al.(2002)T1095C12S rRNA同质性/异质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Thyagaraja

21、n et al. (2000)C1494T12S rRNA同质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Zhao et al.(2004)A1555G12S rRNA同质性/异质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Prezant et al.(1993)G1606AtRNAVal异质性综合征型耳聋Tiranti et al.(1998)A3243GtRNALeu(UUR)异质性综合征型耳聋van den Ouweland, et al.(1992)G7444ACO1/ tRNASer(UCN)同质性/异质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Pandya et al.(1999)A7445GCO1/ tRNASer(UCN)

22、同质性/异质性非综合征型耳聋Reid et al.(1994)7472insCtRNASer(UCN)同质性/异质性综合征型耳聋Tiranti et al.(1995)T7511CtRNASer(UCN)同质性/异质性非综合征型耳聋Sue et al.(1999)T7512CtRNASer(UCN)同质性/异质性综合征型耳聋Nakamura et al. (1995)A8344GtRNALys异质性综合征型耳聋Shoffner et al. (1990)G8363AtRNALys异质性综合征型耳聋Santorelli et al. (1996)T14709CtRNAGlu同质性综合征型耳聋Ri

23、goli et al.(2001)G15927AtRNAThr同质性药物性耳聋/非综合征型耳聋Wang et al.(2008)第二节 线粒体基因组与耳聋耳聋相关的mtDNA突变的检测PCR-RFLP技术DHPLC技术DNA测序技术基因芯片技术55检测位点引物序列(53)退火温度() 产物长度(bp)A1555GC1494TCGA TCA ACC TCA CCA CCT CT58802TGG ACA ACC AGC TAT CAC CAA7445GACG CCA AAA TCC ATT TCA CT58987CGG GAA TTG CAT CTG TTT TT三、线粒体病的分子生物学检验应用（

24、四）线粒体糖尿病线粒体糖尿病美国糖尿病协会(1997)/世界卫生组织(1999)制定了新的糖尿病分型标准，将线粒体基因缺陷型糖尿病列为特殊类型糖尿病，属于细胞功能遗传缺陷型糖尿病，约占糖尿病总数的13据浙江省糖尿病防治中心提供的数据，浙江省糖尿病患病率为2.96%线粒体DNA突变与糖尿病突变位点累及基因同质性/异质性疾病首次报道C1310T12S rRNA同质性糖尿病临床表型Guan et al. (2010)A1438G12S rRNA同质性糖尿病临床表型Vawter et al.(2009)A3243G*tRNA Leu (UUR)异质性糖尿病合并耳聋Van den et al.(1992

25、)C3254AtRNA Leu (UUR)异质性妊娠糖尿病Ng et al. (2000)T3264CtRNA Leu (UUR)异质性糖尿病Matsuoka et al.(1997)T3271CtRNA Leu (UUR)异质性糖尿病Jaksch et al. (1995)G3316AMT-ND1同质性非胰岛素依赖性糖尿病Ogihara et al. (1995)T3394CMT-ND1同质性非胰岛素依赖性糖尿病Wallace et al. (1995)T3398CMT-ND1同质性糖尿病合并耳聋Jaksch et al. (1995)A3399TMT-ND1同质性妊娠糖尿病Ng et al

26、.(2000)T4291CtRNA Ile同质性糖尿病临床表型Lifton et al. (2004)A4833GMT-ND2同质性非胰岛素依赖性糖尿病Onaya et al. (2000)A7472CtRNA Ser (UCN)同质性糖尿病合并耳聋Hanna et al. (2005)A8296GtRNA Lys同质性/异质性糖尿病合并耳聋Ohsawa et al. (1998)A10398GMT-ND3同质性2型糖尿病Kato et al. (2003)A12026GMT-ND4同质性糖尿病Onaya et al. (1998)C12258AtRNA Ser (AGY)异质性糖尿病合并耳聋

27、Turnbull et al. (1998)T14709C*tRNA Glu同质性/异质性糖尿病合并耳聋Moraes et al. (1995)T16189CMT-DLOOP同质性2型糖尿病Poulton et al. (1998)School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College5758携带tRNA Leu(UUR) A3243G突变的糖尿病家系School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College59399bp307bp92bpM Un-cut 143B 43B 1 2 A324

28、3G 为异质性突变RFLPDNA SequencingDHPLCControl A3243GA3242GWTSchool of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College60School of Laboratory Medicine, Wenzhou Medical College 第十六章 肿瘤的分子生物学检验技术滨医附院检验科 袁笑常见肿瘤标志物与肿瘤 前列腺癌PSAEAP睾丸癌AFP, hCG胰腺癌CA 199乳房癌CA 153卵巢癌CA 125肝癌AFP肝癌AFP 肿瘤 首选标志物 补充标志物 肺癌 CEA、NSE、CYFRA21-1 TP

29、A、SCC、ACTH、降钙素、TSA肝癌 AFP AFU、GT、CEA、ALP乳腺癌 CA15-3、CEA CA549、hCG、降钙素、铁蛋白 胃癌 CA72-4 CEA、CA19-9、CA242前列腺癌 PSA、f-PSA PAP结肠直肠癌 CEA CA19-9、CA50 胰腺癌 CA19-9 CA50、CEA、CA125 卵巢癌 CA125 CEA、hCG、CA19-9 睾丸肿瘤 AFP、hCG宫颈癌 SCC CA125、CEA、TPA 膀胱癌 无 TPA、CEA 骨髓瘤 本-周蛋白、2-M 常用肿瘤标志物联合检测的临床应用肿瘤的分子诊断肿瘤从本质上来讲是基因出现了问题，本质上是一种基因病

30、同一种肿瘤其驱动基因可能完全不同，对治疗的反应，肿瘤的发展以及预后可能完全不同不同的肿瘤其驱动基因可能相同，对相同的针对性治疗方案反应相似因此，针对肿瘤的分子诊断愈发重要第一节肿瘤的分子生物学检验策略一、肿瘤的分子生物学检验策略1、检测肿瘤相关基因包括癌基因、抑癌基因、肿瘤转移相关基因等。2、检测肿瘤相关病毒的基因致瘤性DNA病毒：HPV,HBV,EBV等致瘤性RNA病毒：人类T细胞白血病/淋巴瘤病毒1和HCV.3、检测肿瘤标志物基因或Mrna在血液中的含量能反应恶性肿瘤的发生发展以及对治疗的反应二、肿瘤的分子生物学检验技术1、标本的来源： 容易获得（无创或微创）2、分析方法的选择：敏感性高、

31、特异性强，适合相应样本的检测方法分析DNA,RNA仍然是分子杂交、PCR、基因测序。3、新技术产生：基因芯片，高通量测序，分子病理学，分子显像技术，高通量质谱技术等。68肿瘤分子诊断的常用方法染色体数目异常：荧光原位杂交技术FISH致病基因结构异常检测（1） 斑点杂交（dot blot hybridization）（2）等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（ASO） （3）单链构象多态性（SSCP） （4）限制性内切酶图谱（restriction map）分析 （5）限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism ,RFLP ）（6）DNA 分

32、子杂交（Southern blot）致病基因表达异常检测（1） mRNA检测 定量PCR（2）蛋白检测免疫组化：定性、半定量、定位Western blot ：定量第二节肿瘤诊断的生物标志物70肿瘤诊断的生物标志物的发展第1阶段（1963-1978）：癌胚性抗原1963年 Abelev AFP1965年 Gold & Freeman CEA第2阶段（1979-1989）：糖链抗原为主1980年 Koprowski CA19-9（1116-NS-19-9）1981年 Bast CA125（OC125）第3阶段（1990以后）：基因标志肿瘤基因标志71一、肿瘤相关的染色体异常1、数目异常：某个癌细胞

33、的染色体共104条，包括许多异常的染色体 722. 染色体结构异常易位、缺失、重复、环状染色体和双着丝粒染色体 例：Ph染色体（费城1号染色体），慢性粒细胞性白血病（CML） ，9号和22号染色体长臂易位 9号原癌基因abl和22号bcr基因组合成融合基因增高的酪氨酸激酶活性。 Ph临床意义在于：95的CML都是Ph阳性，可以作为诊断的依据。有时Ph先于临床症状出现，故又可用于早期诊断。 73二、肿瘤相关基因表达异常 原癌基因: sis、VEGF、EGFR、c-myc抑癌基因: APC、BRCA、p53、Rb细胞周期调节基因: cyclins、CDKs、CKIs细胞凋亡相关基因: Bcl-1、

34、p53、bcr-abl基因组稳定相关基因(DNA修复基因): APE1肿瘤转移相关基因:nm23、WDNM、sis、p53肿瘤血管生成相关基因: VEGF 、EGFR、p53（一）原癌基因普遍存在于人类或其他动物固有的一类基因，其在生物进化过程中高度稳定，对细胞无害，而且在控制细胞生长和分化中起重要作用。在环境致癌因素作用下，原癌基因发生点突变、易位激活、原癌基因扩增、癌基因甲基化程度降低被激活成活性形式的癌基因才引起细胞癌变。(一)原癌基因点突变(point mutation) 癌基因在编码顺序的特定位置上的某一个核苷酸发生突变，使其表达蛋白质中相应的氨基酸发生变化，从而获得了转化细胞的活性

35、 75mutation (二)基因易位或重排使原癌基因激活 基因易位（translocation）基因重排（rearrangemant）： 有些癌基因从其染色体的正常位置转移到另一染色体的某个位置，由于调控环境发生变化，导致从相对静止状态变成激活状态，使原癌基因表达产物显著增加而导致肿瘤的发生 76(三)原癌基因获得外源启动子而激活 肿瘤细胞中原癌基因的表达水平可以其转录的mRNA或翻译产物蛋白质的含量来表示 在原癌基因的上游插入外源性启动子或增强子可激活原癌基因，使其表达产物增多 病毒的增强子常位于5端的长末端重复序列(1ong terminal repeat，LTR)内。如果增强子插入到原

36、癌基因的附近或远处，均使之激活，促使癌基因的表达比正常表达增高几十甚至上百倍 77 (四)原癌基因甲基化程度降低而激活 DNA分子中的甲基化(methylation)对阻抑基因的转录具有重要作用 78（二）抑癌基因又称肿瘤抑制基因，为一类可编码对肿瘤形成起阻抑作用的蛋白质基因，正常情况下抑制细胞增殖、促进细胞分化。抑癌基因失活方式： 1）DNA点突变或缺失导致一个等位基因失活。 2）DNA甲基化和组蛋白去乙酰化抑制一个等位基因表达。（三）细胞周期调节基因细胞周期：正常连续分裂的细胞从前一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂完成所经历的连续动态过程，也是多阶段多因子参与的精确而有序的调控过程。特点：1

37、）单向性：G1 S G2 M 2）阶段性：因某种原因停滞下来，条件好转，进入下一时项 3）检查点：细胞各时项交叉处存在检查点，通过检查点才能进入下一个时项。细胞周期运行的动力主要来自细胞周期蛋白依赖性激酶，它的活性受细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂调控。这些调控方式相互制约，形成一个复杂的细胞周期分子调控网络。1、细胞周期依赖性蛋白激酶CDK1-132、细胞周期蛋白CCND13、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CDK4、细胞周期检查点Chk1(三)细胞周期调节基因（四）细胞凋亡相关基因大致分为三组1、促进细胞凋亡基因2、抑制细胞凋亡基因3、细胞凋亡过程中表达的基因（五）维持细胞基因组稳定

38、相关基因DNA修复基因及基因组不稳定性基因（六）促进和抑制肿瘤转移的相关基因（七）肿瘤血管生成相关基因VEGF(血管内皮生长因子)84三、肿瘤相关单核苷酸多态性1. SNP与肿瘤肿瘤易感基因、肿瘤药物治疗相关基因肿瘤个体化诊疗2. SNP的研究思路研究对象差异性研究技术：PCR、芯片研究难点：样本采集85四、肿瘤相关表观遗传异常 （一）表观遗传（epigenetics）是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。（二）分子机制：1、基因印记丢失，一对等位基因只表达来自亲本一方的

39、等位基因，而与性别无关。 2、DNA甲基化：例如启动子区域的CpG岛高甲基化所致抑癌基因转录沉默 3、组蛋白修饰与染色体重塑86五、肿瘤相关miRNA1、 miRNA与肿瘤miRNA与肿瘤发生、发展、诊断、治疗、预后2、miRNA类肿瘤标志物的研究思路研究对象：实体瘤、细胞、循环血、其他研究技术：定量PCR、western blot、芯片、免疫组化、细胞培养（增殖、迁移、浸润）等等第三节肿瘤分子生物学检验的临床应用 肺癌肺癌的分子遗传特征1、细胞色素P450家族，绝大多数的致癌物包括内源性和外源性都需经过P450转化，研究最多的CYP1A12、谷胱甘肽转移酶（GST）家族,使致癌物失活3、NA

40、T2家族，解毒作用90肺癌的分子生物学检验1、EGFR（原癌基因表皮生长因子受体）基因检测 大多数在NSCLC中过表达且是重表皮生长要是治疗靶标，EGFR是表皮生长因子相关酪氨酸受体家族的成员，通过与配体的结合，受体同源和异源二聚体化，从而激活受体内源性的酪氨酸激酶，并引发下游信号级联反应，主要包括Ras-Raf-MAP激酶信号通路、P3K-Akt信号通路和STAT通路。这些信号通路对细胞的增值、分化、迁移和血管生成有很强的刺激效应。91肺癌的分子生物学检验2、K-ras检测 ras基因，特别是K-ras基因，与肺癌的发生及预后有 关。有20%-30%的NSCLC患者存在K-ras基因突变。8

41、0%-90%的突变是12密码子G-T引起的，导致K-ras蛋白组成性活化， NSCLC患者伴随K-ras突变与预后不良有关， K-ras突变与EGFR突变是相互排斥的。伴随K-ras突变的NSCLC患者EGFR-TK3药物敏感性较差92肺癌的分子生物学检验3、甲状腺转录因子1（TTF-1）是一种分子量为38-40的核蛋白，在胎儿肺组织及成人型肺泡上皮中存在，而在型肺泡上皮中不表达，TTF-1高表达则EGFR突变率高，是服用EGFR-TK3药物的优势人群。93肺癌的分子生物学检验4、癌胚抗原（CEA） 表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，用于检测上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。靶向EGFR的抗肿

42、瘤药物类别一：小分子酪氨酸激酶抑制剂（ EGFR TKI) 作用机制：抑制EGFR胞内区酪氨酸激酶活性，阻断EGFR信号通路； 药物代表：吉非替尼（阿斯利康）；厄罗替尼（罗氏）。类别二：单克隆抗体(mAb) 作用机制：与EGFR胞外区结合，阻断配体与EGFR的结合； 药物代表：西妥昔（默克）；贝伐单抗（罗氏）。 乳腺癌乳腺癌基因检测的意义BRCA1:1990年研究者发现一种直接与遗传性乳腺癌有关的基因，命名为BRCA1，1994年又发现另外一种与乳腺癌有关的基因，称为BRCA2。乳腺癌遗传检测适宜人群 (如果有以下因素，强烈建议接受乳腺癌BRCA检查)1、一个或多个直系亲属有乳腺癌史，如母亲或

43、姐妹 2、家族成员里有早发乳腺癌患者，发病年龄早于40 3、家族成员里两代以上出现乳腺癌患者 4、家族成员有双侧乳腺癌患者 5、家族成员里有卵巢癌患者 6、家族成员有男性成员乳腺癌患者 7、一个或多个家族成员携带BRCA基因突变，即遗传检测阳性 乳腺癌的分子生物学检测1、c-erb B-2/HER2基因的检测是乳腺癌中较常见，易激活的原癌基因c-erb B-2/HER2基因高表达往往生存率低，恶性程度高2、雌激素受体和孕激素受体的检测ER和PR阳性的乳腺癌可以进行内分泌治疗肿瘤生物学行为决定乳癌治疗选择NegativePositiveER / PgRHER-2NegativePositive

44、化疗 Avastin内分泌治疗抗Her-2治疗 白血病1、白血病相关基因突变（1）C-KIT基因突变（2）FLT3基因突变 (3) NPM基因突变 （4）N-ras基因突变 （5）NOTCH1基因突变2、白血病相关基因异常表达（1）WT1基因异常表达，为抑癌基因的一种，是急性白血病独立的预后因子（2）HOX11基因异常表达，此类患者预后较好，化疗效果佳。3、白血病融合基因 染色体易位使位于9q34的c-abl基因转移到第22对染色体上，重排形成bcr-abl融合基因，使表达增高，蛋白质产物也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增加，导致慢性粒细胞白血病的发生 染色体易位使位于9q3

45、4的c-abl基因转移到第22对染色体上，重排形成bcr-abl融合基因，使表达增高，蛋白质产物也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增加，导致慢性粒细胞白血病的发生 104 染色体易位使位于9q34的c-abl基因转移到第22对染色体上，重排形成bcr-abl融合基因，使表达增高，蛋白质产物也由p145变成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大为增加，导致慢性粒细胞白血病的发生 结直肠癌大肠癌靶向治疗敏感基因EGFR的传导通路大肠癌靶向治疗敏感性基因检测K-RAS基因检测已经成为大肠癌患者治疗前必做的常规检查，是目前医生了解大肠癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法K-RAS基因检测可以

46、筛选出对抗EGFR(表皮生长因子受体)靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而达到良好的预后。早期检测K-RAS还可以通过该基因的状态了解到病人的复发转移风险，为将来选择最佳治疗做好准备。 第十七章 药物代谢与毒副作用相关基因 的分子生物学检验技术滨医附院检验科 袁笑是药三分毒？ 你吃错药啦!你药吃多啦！不合理用药导致严重不良反应 全球死亡患者中，三分之一是由于不合理用药，而并非死于自然疾病本身。 WHO（联合国世界卫生组织）美国每年有10万人死于药物不良反应，直接和间接经济损失达120亿美元。FDA(美国食品和药物管理局)根据药监局和食品药品管理局等机构的统计：1、中国每

47、年有5000万的住院病人，其中至少250万与药物不良反应有关，20多万人因此而死亡。2、我国住院病人中有20是由于不合理用药造成二次住院。传统用药的弊端 症状体征及仪器检查诊断药物治疗经验处方药物治疗A药B药C药D药传统经验性用药代价1、耗时多2、花费大3、疗效差4、不良反应多5、毒副作用几率大药物代谢因人而异生物转化肝脏药物药物重吸收代谢产物排泄药物重吸收肾脏药物毒性但有效药物毒性且无效药物无毒性且有效药物无毒性也无效同种同量药物治疗一种类型的药并不适合所有人药物代谢酶决定药物反应的因素体重/身高性别老人/小孩/孕妇病史并发症环境因素遗传因素（基因）不同人群药代动力学药效动力学药物疗效和毒性的个体差异基因组基因变异(单核苷酸多态性)药物靶点药物转运体药物代谢酶约59%的药物不良反应与遗传相关基因变异决定药物反应个体差异 决定性因素单核苷酸多态性（S