生物化学与分子生物学实验：2-GFP的基因克隆

1、一、 获取外源基因（PCR）二、构建重组DNA（T连接）三、重组DNA的转化四、重组DNA的筛选（蓝白斑）五、重组DNA的鉴定（酶切）实验思路PCR转化筛选鉴定T连接一、获取外源基因1.碱裂解法提取质粒2.PCR扩增目的基因GFP（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅（二）材料：含pEGFP-N1质粒的大肠杆菌DH5（三）试剂： LB培养基（液体、固体）Bioteke质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）溶液 S1 裂解液 S2中和液 S3 洗涤液W(去蛋白)洗脱液仪 器 材 料 基本原理 1、碱裂解法基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；高碱性条件下，染色

2、体DNA和质粒DNA变性；当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉定去除；50mmol/L 葡萄糖25mmol/L TrisCl(pH8.0)10 mmol/L EDTA (pH8.0)2 mg/mL溶菌酶作用：溶菌酶，水解细菌细胞壁EDTA,鳌合金属离子使金属酶失活葡萄糖，维持渗透压注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块溶液 SI 0.2 mol/ L NaOH1% SDS作用：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的，加入S2，该系统pH值高达12.6，促使染色体DNA与质粒DNA的变性。要温和操作，避免

3、基因组DNA断裂。该步骤可看到菌液逐渐变清亮。注意：时间勿太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次溶液 S2 5mol/L 乙酸钾 60 ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml作用：调pH值到中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐有利于变性的大分子染色体DNA,RNA,以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀。该步骤会出现白色絮状沉淀。注意：复性时间不宜过长溶液 S3 2、离心层析柱基本原理 硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA；去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱；菌液离心13000rpm,1min弃上

4、清瞬时离心彻底弃上清加250l 溶液S1旋涡振荡悬浮沉淀加250l 溶液S2加350l 溶液S3颠倒数次放置3-5min离心13000rpm,10min取上清600l加到吸附柱中离心13000rpm,1min弃滤液，加入600l洗涤液W113000rpm,1min离心（1）（2）（3）（4）（5）（6）（7）（8）（9）弃滤液，加入600l洗涤液W2（10）离心13000rpm,1min放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加40l洗脱液离心13000rpm,1min（13）PCR扩增 / -20保存备用操作步骤 颠倒数次弃滤液（12）空柱离心13000rpm,2minPCR转化筛选鉴定T连接

5、一、获取外源基因（PCR）PCR反应体系H2O 6l质粒DNA（pEGFP-N1）2l引物GFP1 (10M)1l引物GFP2 (10M)1lPremix Taq10l总体积20l取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)： 如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上 .PCR转化筛选鉴定T连接一、获取外源基因（PCR）PCR参数设置 94预变性5分钟后开始以下循环 94 30 秒 56 30 秒 30 循环 72 1 分钟 72 7 分钟 4 保温实

6、验过程约1小时50分钟PCR转化筛选鉴定T连接一、获取外源基因（PCR）琼脂糖凝胶电泳凝胶准备胶床准备铺胶静置胶床置于电泳槽中加电泳缓冲液拔梳子上样电泳取出凝胶拍照PCR转化筛选鉴定T连接一、获取外源基因（PCR）+-1234每组上1个样品1. DL2000 DNA Marker（ 5 l ）2. PCR产物 （ 5 l ）琼脂糖凝胶电泳操作琼脂糖凝胶的制备上样：每孔上一个样品，加样前，样品先与6上样缓冲液混匀(如预加有染料物质，可省此步)电泳 ：电压80120v；2030min结果观察：凝胶成像仪 PCR转化筛选鉴定T连接一、获取外源基因（PCR）琼脂糖凝胶电泳试剂说明Loading Buf

7、fer上样缓冲液DL2000 DNA Marker组成： EDTA甘油 增大溶液密度 溴酚蓝指示剂二甲苯胺蓝指示剂0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中，迁移率为溴酚蓝=300bp双链线状DNA二甲苯胺蓝=4kbp双链线状DNATAKARA pMDTM18T Vector Cloning KitPCR转化筛选鉴定T连接二、构建重组DNA（T连接）连接反应体系16反应30分钟实验组对照组pMDTM18T Vector1 l1 lPCR扩增产物1 lControl Insert DNA1 l超纯水-ddH2O3 l3 lSolution I 5 l5 l总体积10 l10 lPCRT连接筛选鉴

8、定转化实验流程：转化三、重组DNA的转化感受态细菌100 l连接产物10 l冰浴中30分钟混匀42水浴 90秒冰浴1-2分钟 涂板培养过夜勿动加入800l LB培养液37振荡培养45分钟热激感受态细菌的制备离心4000rpm，30秒弃500ul上清，余下部分混匀用于涂板第二天早上观察结果，置于4冰箱PCRT连接筛选鉴定图示转化过程：转化三、重组DNA的转化生长培养基感受态细胞100 l37培养45分钟PCRT连接筛选鉴定涂板：取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟，倒置平皿37培养过夜。转化三、重组DNA的转化选择培养基选择培养基成份

9、：Amp、X-gal、IPTG的LBPCRT连接筛选鉴定转化三、重组DNA的转化对照试验的设计实验组连接对照组对照组对照组对照组DNAPCR产物/蓝白T载体连接产物Control DNA/蓝白T载体连接产物纯质粒DNA感受态细菌100l100l100l100l100l平板LB/Amp+/IPTG/X-galLB/Amp+/IPTG/X-galLB/Amp+/IPTG/X-galLB/Amp+LB/Amp-预期蓝白斑蓝白斑菌落多无菌落有菌落作用成功检测T载体试剂检测转化效率检测抗生素活性及感受态有无污染检测感受态活性PCRT连接筛选鉴定附：感受态细菌的制备（CaCl2法）转化三、重组DNA的转化

10、挑取一DH5单菌落于2.5ml LB培养液中37过夜培养取其中500 l菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37振摇培养至OD600值达到0.3-0.4之间（旋转摇床200300r/min，培养液调零，每隔2030min测量）取50ml菌液置于离心管内，4 4500g离心5分钟加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟4 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成100 l的小份，暂且不用的贮存于-70可保存半年。 取其中一份进行转化。PCRT连接筛选鉴定图示

11、：感受态细菌的制备（CaCl2法）转化三、重组DNA的转化37振荡培养过夜37振荡培养至OD600=0.30.4分装冻存PCRT连接转化鉴定蓝白斑筛选（ -互补,IPTG/X-gal ）四、重组DNA的筛选（蓝白斑）筛选PCRT连接转化鉴定四、重组DNA的筛选（蓝白斑）筛选-互补蓝白筛选PCRT连接转化鉴定四、重组DNA的筛选（蓝白斑）筛选37振荡培养过夜接种于4mlLB/Amp+培养液中挑单菌落扩大培养PCRT连接转化筛选从扩大培养的菌液中提取重组质粒DNA，再进行限制性内切酶酶切，琼脂糖凝胶水平电泳，观察结果。五、重组DNA的鉴定（酶切）鉴定PCRT连接转化筛选五、重组DNA的鉴定（酶切）

12、鉴定12000rpm1 min菌体沉淀溶液S1250 l剧烈震荡裂解液S2250 l颠倒混匀4-6次350 l温和地颠倒混匀6-8次12000rpm10 min室温静置35min至出现白色絮状沉淀取600 l上清至吸附柱管12000rpm30s12000rpm 30s10000rpm2 min取吸附柱至另一新EP管洗脱液50 l12000rpm1 min室温静置1min弃滤液空柱收集洗脱液备用弃滤液2. 悬浮细胞1. 收集细胞3. 裂解细胞4. 中和7. 洗脱5. 过柱分离中和液S3菌液质粒DNA的提取弃滤液600 l 洗涤液W12000rpm 30s600 l 洗涤液WPCRT连接转化筛选五

13、、重组DNA的鉴定（酶切）鉴定H2O6 l10 M 酶切缓冲液2 l 重组质粒DNA 10 l (5001000ng)Hind III1 l EcoR I1 l 总体积20 l 在一个洁净的离心管中混匀下列反应物： 混合后37 水浴12h质粒DNA的酶切分析操作PCRT连接转化筛选五、重组DNA的鉴定（酶切）鉴定+-1234每组上2个样品1. DL5000 DNA Marker( 5 l )2. 提取的重组质粒DNA ( 5 l )3. 重组质粒DNA酶切产物 ( 5 l )琼脂糖凝胶电泳操作琼脂糖凝胶的制备上样：加样前，样品先与6上样缓冲液混匀电泳 ：电压80120v；2030min结果观察

14、：凝胶成像仪 PCRT连接转化筛选五、重组DNA的鉴定（酶切）鉴定琼脂糖凝胶电泳试剂说明Loading Buffer上样缓冲液DL5000 DNA Marker组成： EDTA甘油 增大溶液密度 溴酚蓝指示剂二甲苯胺蓝指示剂0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中，迁移率为溴酚蓝=300bp双链线状DNA二甲苯胺蓝=4kbp双链线状DNAPCRT连接转化筛选五、重组DNA的鉴定（酶切）鉴定插入740bpDNA片段质粒大小为:2692bp+740bp=3432bp酶切片段大小为 ?酶切位点酶切位点琼脂糖凝胶电泳结果预期分析PCRT连接转化筛选附：五、重组DNA的鉴定（酶切）鉴定质粒DNA三种构

15、型：1.共价闭环超螺旋2.线性3.开环的双链环状在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率：共价闭环超螺旋DNA线性DNA开环的双链环状DNA1: DL5000 DNA marker28: pEGFP-N1PCRT连接转化筛选附：琼脂糖凝胶电泳方法五、重组DNA的鉴定（酶切）鉴定1. 凝胶准备 称2g琼脂糖置三角瓶中，加0.5TBE 200ml ； 盖上牛皮纸，用橡皮筋捆紧 微波炉加热n次，直至融解，1min/次，中高温（一般35次）；2. 胶床准备 将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙； 将胶床放在调整好的水平台上；铺胶：将冷却至60的凝胶加入20 l荧光染料(有 毒)倒入准备好的胶

16、床内，凝胶厚度约5 mm；PCRT连接转化筛选五、重组DNA的鉴定（酶切）鉴定室温下静置凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极；向电泳槽中加入0.5TBE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可；轻轻拔出固定在凝胶中的梳子；样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的6Loading Buffer，用加样器轻轻混匀；上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为510 l ；盖上电泳槽，接通电源，开始电泳； 电泳条件：电压80120v，时间2030分钟；电泳结束后，切断电源，取出凝胶。电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带； 取出凝胶，置于凝胶成像仪中观察结果。PCRT连接转化筛选五、重组DNA的鉴定（酶切）鉴定胶浓度（）线性DNA分子大小（kb）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.13琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶PCRT连接转化筛选五、重组DNA