结核病实验室诊断措施标准化和其注意事项

1、结核病实验室诊断措施标准化和其注意事项现代结核病控制策略DOTS政府承诺开展以痰检为主的病人发现工作应用标准短程化疗并实施督导管理建立正规的药物供应系统建立监测系统我国结核病控制目标 2005年全球结核病控制目标2003年全国现状2004年全国目标2005年全国目标 DOTS 策略覆盖率（%）1008595100涂阳病人发现率（%）7045 60 70涂阳病人治愈率（%）85858585结核病细菌学实验室在国家结核病控制规划（NTP)中起到举足轻重的作用应当得到各级政府、领导和有关单位的高度重视！分枝杆菌生物学概述分枝杆菌属裂殖菌纲，放线菌目，种类甚多，目前已命名的有50多种，一般可分为缓慢生

2、长和快速生长两大类。结核分枝杆菌是1882年郭霍（Robert Koch）从肺结核病人痰标本中发现。是人类结核病的主要病原菌。分枝杆菌呈分支状生长， 营养要求比普通细菌高，是一种生长缓慢的革兰氏阳性杆菌。经石炭酸复红染液染色后，可以抵抗盐酸酒精脱色，故称此类细菌为抗酸菌。分枝杆菌分类结核分枝杆菌结构 在电子显微镜下可见菌体微细结构。结核分枝杆菌由细胞壁、细胞膜、细胞质、核物质组成。细 胞 壁厚度为1035nm，较一般细菌的细胞壁厚。含有大量脂类，具有坚韧性和疏水性。功能：保护细菌的固有形态抵抗酸碱物质及宿主细胞对细菌的破坏和 杀伤如果细胞壁有缺陷，细菌只能在高渗环境下生存，则称此类细菌为L型细

3、菌。细 胞 膜细胞壁内层围绕于细胞质外的富于弹性的半透膜。主要成分是脂类（磷脂）和蛋白质。功能：细菌与外界环境进行物质交换在细胞内一系列代谢活动中起重要作用细 胞 质是带粘滞性的液体，充满了细胞膜内的整个空间。细胞浆内含有核糖体及其他多种颗粒。功能：细胞合成蛋白质和核酸等生命活性物质的 场所细菌对营养物质进行同化作用和异化作用的场所核 质由单一双股DNA组成。电镜下由极细的纤维物质所组成，与细胞质不分开，无核膜、核仁。功能：细胞遗传的物质基础。 菌体主要成分 脂类 多糖 蛋白质 核酸 盐类 脂 类（1）结核菌体脂类含量比其他细菌高，占细胞壁干重的60，是引起结核病特征性变化与表现的物质基础。脂

4、质含量与细菌毒力相关，毒力强的结核分枝杆菌（Mtb）含脂最高。脂质主要有磷脂、脂肪酸、蜡质等成分，多与蛋白质、多糖以结合形式存在。脂 类（2）磷脂：刺激机体单核细胞增生，增强菌体成分诱导机体致敏的作用。索状因子：与Mtb毒力密切相关。硫脂：含有S元素的脂类，与细菌抵抗力有关。蜡质：占脂质总量48，分A、B、C、D。结核菌酸：促进机体形成结核结节。分枝菌酸：为结核菌菌体的重要成分，与结核菌的抗酸性有关。多 糖由阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖、甘露聚糖和葡聚糖等组成。多以脂类、蛋白质和核酸等结合形式存在。是免疫反应的重要抗原物质。蛋 白 质Mtb含多种蛋白质组分，由不同菌体蛋白及活菌在分泌过程中分

5、泌于细胞外的多种蛋白组成。结核菌的主要抗原性物质。结核菌素(OT)、纯蛋白衍生物（PPD）为多种蛋白的复合抗原，可刺激机体免疫应答。核 酸RNA含量比DNA高45倍。RNA分布于细胞质内，DNA存在于细胞核区域内。DNA是遗传物质，将遗传信息传给子代，并指导RNA的合成。RNA是蛋白质和其他细胞成分合成所必须的物质。盐 类钙、钾、镁、铁、磷等，约占菌体成分的 6。 营养与发育结核菌是兼性需氧菌，在有氧和含有比较低氧的环境下均能生存，比如骨结核，淋巴结核。在少量二氧化碳的环境中生长的也很好。结核菌生长的适宜温度和人体相近为370C结核菌生长所必需的元素有氧、碳、氮、氢、磷、钾、镁等。结核分枝杆菌

6、形态结核菌是兼性需氧菌，无鞭毛、荚膜，无运动能力；形状：0.3 - 0.61 - 4微米的细长杆状，直或稍弯，镜下常堆积成团、成束、排列杂乱无章，也有呈串珠样、链状、索状者。革兰氏染色阳性，萋-尼氏染色镜下的抗酸杆菌为淡兰色背景下的红色或粉红色细长杆菌。荧光染色镜下的抗酸杆菌在暗色背景下呈黄绿色或橙色荧光。抗 酸 性分枝杆菌不易着色，一旦着色可以抵抗盐酸酒精的脱色，称为“抗酸性”。抗酸性是分枝杆菌的重要特征。其化学基础是分枝菌属的细胞壁脂质含量较高，并含有大量分枝菌酸。抗酸性与细菌细胞壁的完整性关系密切，若菌体自溶（如标本保存时间过长、温度过高）、结核菌的异型性（如：L-型菌、干酪或脓液中的结

7、核菌）可能失去抗酸性。生 长 特 性生长适宜温度37C，。营养要求较高。在常用的罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基上生长的菌落粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，乳白色或米色，不透明。结核菌生长缓慢，在一般培养基上分裂一代需要10-18小时，根据接种菌量的多少，一般10-30天肉眼可见菌落生长。结核病细菌学诊断结核病细菌实验室布局原则1、结核病细菌学检查要有独立的实验室，不得与其他实验室混用；2、培养基制备、洗刷等相对洁净的操作与涂片镜检、培养前处理、药敏试验等污染操作要有独立分开的场所，最好分别在专用的房间进行；3、基层只从事涂片镜检的实验室只拥有一间独立房舍的

8、情况下，相对洁净区（镜检区、登记区）与污染区（涂片、染色区）要有明显区分。基层镜实验室布局范例染色池收集标本用的桌子工作台采光用窗户（固定）实验室门试剂柜显微镜记录用的桌子可以开关的窗户痰标本的收集和运送干酪痰、血痰或粘液痰为合格标本，痰量应为3-5毫升。难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查，但应注明标本性状，以供分析结果时参考。收集标本的容器应采用国家参比室推荐的标准痰瓶，或采用直径4厘米、高2厘米的广口塑料（或蜡纸）的可密闭容器。容器上应注明与检验单一致的病人姓名、编号及日期。需送上一级实验室检查的痰标本应置4C冰箱保存，外送前认真核对检验单与痰瓶上标注，放专用的冰盒内运送，或用纸袋、塑

9、料袋封装扎牢后顺序放入包装盒，盒外注明请勿倒置标志。废弃标本和污染物的处理废弃标本、痰盒和污染物均须经高压蒸汽灭菌后方能丢弃或清洗；如需焚烧处理，须置于焚烧炉内彻底焚化。焚化不彻底或暴露焚烧是危险的；专业化处理试验操作工作面应以3%石炭酸或其他可靠的消毒液擦拭，再用紫外线灭菌灯照射2小时，痰涂片检查的重要性发现结核病人、特别是传染性肺结核病人评价传染性肺结核病人的化疗效果为结核病疫情的流行病学统计服务痰涂片镜检操作流程涂痰膜自然干燥复红加热初染5分钟自然干燥镜检流水冲洗美兰复染30秒盐酸酒精脱色流水冲洗流水冲洗痰涂片镜检报告方式0条/300视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阴性1-8条/300视野：实报

10、菌数3-9条/100视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性（+）1-9条/10视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阳性（2+）1-9条/1视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阳性（3+）10条/1视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阳性（4+）痰涂片镜检注意事项选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分涂片阳性率较高；一张玻片只涂一份标本，玻片一次性使用，防止交叉污染；打开痰盒、涂抹痰膜、烧灼接种环时容易产生气溶胶，应注意正确操作和自身防护；石炭酸复红初染时必须加温。痰涂片镜检的优点是直接发现原菌的检查方法，适用于痰、尿、便、体液、组织等几乎一切标本，有重要的临床诊断价值。是发现和确定传染源的途径，是考核和评价疗效的重要指标，有重要的流行病学意义

11、；操作简便，价格低廉，适于各级实验室开展；快速，数小时可报告结果。痰涂片镜检的缺点敏感性低：通常每毫升含5000-10000条以上抗酸菌才可得到阳性结果；特异性较低：只能报告“抗酸菌阳性”，不能区分结核和非结核分枝杆菌；镜下只能观察菌体形态，不能辨别死、活菌。分离培养的重要意义是结核病病原学诊断的“金标准”是开展进一步检测的基础分离培养的操作流程 涡旋振荡1-2分钟痰标本中加入1-2倍体积4%NaOH分别接种前处理液至2只培养基斜面接种后3天、7天观察，此后每周观察一次置37C温箱培养有菌落生长需经抗酸染色确认，至第8周无菌落生长报告阴性室温静置15分钟4325671分离培养的注意事项选择痰标

12、本中脓性、血样、干酪样的部分进行培养阳性率较高；从加入前处理液到接种的时间不得多于20分钟，否则影响阳性率；涡旋振荡、离心、倾倒上清液、接种时容易产生气溶胶，应注意使用安全仪器，正确操作。发现培养基上菌落生长需经抗酸染色确认后方可报告阳性。分离培养的结果报告方式 培养基斜面无菌落生长： 分枝杆菌生长阴性（-） 培养基斜面上菌落数少于20个：报实际菌落个数； 菌落约占斜面面积1/4： 分枝杆菌生长阳性（+） 菌落约占斜面面积1/2： 分枝杆菌生长阳性（2+） 菌落约占斜面面积3/4： 分枝杆菌生长阳性（3+） 菌落满斜面或菌苔样生长： 分枝杆菌生长阳性（4+）分离培养的优点敏感性较直接涂片法高，

13、理论上10-100条菌/毫升可检出阳性；特异性较直接涂片法高，可以从菌落生长速度、色素产生初步判断非结核分枝杆菌；分离出具有活力的纯培养物，为进一步试验提供基础。分离培养的缺点需时长，根据接种量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可见菌落。结果受标本保存运送时间、培养基成分和质量、前处理方法等影响， 操作较直接涂片法复杂，需经严格培训 。需培养基凝固灭菌器、离心机、涡旋振荡器、恒温培养箱等设备。成本是直接涂片法的7-8倍。药物敏感性测定的重要意义临床治疗的重要参考流行病学的重要指标药物敏感性试验常用标准方法绝对浓度法：由德国科学家于1963年首先提出，是我国三十多年来一直沿用的药敏试验方法。比例法

14、：由法国科学家和 首先提出，是WHO耐药监测项目推荐药敏试验方法。抗性比率法：由英国科学家 首先提出，由于方法比较繁琐，现已不多用。药敏试验流程：2-3周新鲜纯培养物报告结果磨菌，制备1mg/ml菌悬液37C培养4周稀释至适当浓度接种适当菌量至含药培养基和无药对照斜面药敏试验注意事项培养基制备：（1）药物称量、效价计算、溶解、稀释要准确；（2）用标准化的仪器和材料：培养基蒸汽凝固灭菌器、螺旋盖培养管；（3）凝固灭菌时间、温度严格掌握；（4）每次制作培养基应标明批次，使用时同时用H37RV作为敏感对照考核含药培养基质量。药敏试验注意事项试验操作：应在生物安全操作台内进行操作；要使用标准化的磨菌管

15、、吸管、接种环进行稀释和接种；要使用新鲜菌落，取菌落时要刮取整个斜面，不要只取单个菌落；菌液制备、稀释、接种要力求准确，以保证接种量在要求范围内；注意观察温箱温度。药敏试验方法局限性在得到纯细菌的培养物后仍需4周可报告结果，远远滞后于临床诊治的需要； 试验比较繁琐，结果受多种因素影响，可重复性较差；实验室耐药与临床耐药之间的有一定差距。结核病实验室服务的质量保证我国结核病实验室工作网络国家结核病参比实验室National Reference Laboratory (NRL)省级结核病参比实验室Provincial Reference Laboratory (PRL)地市级结核病实验室Prefecture Laboratory (PL)县级结核病实验室County Laboratory (CL) 乡镇卫生院查痰点Sputum smear examination sites at township卫生部国家CDC 国家参比实验室省卫生厅 地市卫生厅 县卫生局 省CDC 地市CDC县结核病防治机构 省参比实验室 地市参比实验室 县结核病实验室 NTP我国结核病实验室工作网络的组织管理以往痰涂片质控模式以结核病实验室工作网络为基础