微生物工程代谢调控h

1、第 三 章 微生物的代谢调节与代谢工程1第 三 章 微生物的代谢调节与代谢工程第一节 微生物代谢的自我调节第二节 微生物的代谢调控第三节 代谢工程2第一节 微生物代谢的自我调节3微生物代谢是受到高度调节的，如下事实可以说明1）微生物生长在含单一有机化合物为能源的合成培养基中，所有大分子单体（如氨基酸）的合成速率同大分子（如蛋白质）的合成速率协调一致，不会浪费能量去合成那些他们用不着的东西。2）任何一种单体的合成，如能从外源获得并能进入细胞内，单体的合成自动停止，参与这些单体生成的酶的合成也会停止；3）微生物只有在有某些有机基质（如乳糖）存在时，才会合成异化这些基质的酶；4）如存在两种有机基质，

2、微生物会先合成那些能异化更易利用的基质的酶，待易利用的基质耗竭才开始诱导分解较难利用的基质的酶；5）养分影响生长速率，从而相应改变细胞大分子的组成（如RNA含量） 4微生物自我调节的部位： 1、养分吸收分泌的通道大多数亲水分子难于透过细胞膜，需借助一些负责运输的酶系统（如透酶）才得以实现；有些是需能的。2、限制基质与酶的接近 在真核生物中，各种代谢库的基质分别存在于由胞膜分隔的细胞器内，如在链孢霉中精氨酸存在于细胞质和液泡内，这两处参与精氨酸代谢的酶量有很大的差别。 原核生物的控制方式不同，其中有些酶是以多酶复合物或以细胞膜结合的方式存在，类似于酶的固定化形式，使它不能自由活动。3、代谢途径通

3、量的控制微生物控制代谢物流的方法有两种： 调节现有酶的量、改变已有酶分子的活性 微生物自我调节的三个部位实际上也就是三个类型，但都涉及到酶促反应调节。 酶促调节的方式包括酶活性调节和酶合成调节两大类。5原核生物真核生物6一、酶活性调节（一）酶的激活作用和酶的抑制作用 -两个矛盾的过程；普遍存在于微生物代谢中 表3-1 大肠杆菌糖代谢中酶的激活剂与抑制剂 酶 激活剂 抑制剂磷酸果糖激酶 ADP 、GDP PEP丙酮酸脱氢酶 PEP、AMP、GDP NADH 、乙酰CoA7天冬氨酸转氨甲酰酶ATP激活图3-1 嘧啶生物合成的限速酶调节方式8大肠杆菌酵解和TCA循环中的促进与抑制位点促进抑制9一、酶

4、活性调节（二）酶活性的 调节方式变(别)构效应共价修饰缔合与解离竞争性抑制101、变构控制变构或别构(allosterism)效应 是指一种小分子物质与一种蛋白质分子发生可逆的相互作用，导致这种蛋白质的构象发生改变，从而改变这种蛋白质与第三种分子的相互作用。 变构蛋白是表现变构效应的蛋白，如阻遏蛋白 具有变构作用的酶称作变构酶11变构调节理论：1）变构酶具有一个以上的结合位点，除了结合底物的活性中心外，在同一分子内还有一些分立的效应物结合位点（副位点）；2）主位点和副位点可同时被占据；3）副位点可结合不同的效应物，产生不同的效应；4）效应物在副位点上的结合可随后引起蛋白质分子构象的变化，从而影

5、响酶活性中心的催化活性；5）变构效应是反馈控制的理论基础，是调节代谢的有效方法。122、共价修饰指蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团共价连接或解开，使其活性改变的作用。化学基团：磷酸基、腺苷酰基、甲基、乙基等蛋白质的共价结合部位一般为丝氨酸残基的-CH2OH 共价修饰分可逆和不可逆两种13有些酶存在活性和非活性两种状态，它们可以通过另一种酶的催化作共价修饰而互相转换。如: 糖原磷酸化酶 通过激酶和磷酸酯酶来调节活性 磷酸化形式 有活性 去磷酸化形式 无活性 1）可逆共价修饰14磷酸化酶E-CH2-OH(无活性) 磷酸化酶E-CH2-O-P(有活性) H2OPi磷酸酯酶 ATPADP

6、磷酸化酶激酶15酶可逆共价修饰的意义：1） 因酶构型的转换是由酶催化的，故可在很短的时间内经信号启动，触发生成大量有活性的酶；2）这种修饰作用可更易控制酶的活性以响应代谢环境的变化。 这一系统具有能随时响应的特性，因而经常在活化与钝化状态之间来回变换。 需消耗能量，但只占细胞整个能量消耗的一小部分162）不可逆共价修饰 典型的例子是酶原激活无活性的酶原被相应的蛋白酶作用，切去一小段肽链而被激活 (胰蛋白酶原的活化靠肠肽酶从其N-端切去一个己肽 Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)肠肽酶胰酶原胰酶弹性蛋白酶原的活化弹性蛋白酶原的活化弹性蛋白酶原的活化自身催化 信号放大 酶完成使命后

7、便被降解，关闭酶活性 酶原变为酶是不可逆的17二、酶合成的调节 凡是能促进酶合成的调节称为诱导；而能阻碍酶合成的调节称为阻遏。 酶合成的调节是一种通过调节酶的合成量进而调节代谢速率的调节机制，这是一种在基因水平上（在原核生物中主要在转录水平上）的代谢调节。 同调节酶的活性的反馈抑制等相比，通过调节酶的合成而实现代谢调节的方式是一类较间接而缓慢的调节方式；其优点是通过阻止酶的过量合成，有利于节约生物合成的原料和能量。18（一）酶合成调节的类型诱导阻遏末端产物阻遏分解代谢产物阻遏19组成酶 不依赖于酶底物或类似物的存在而合成 如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶诱导酶依赖于某种底物或底物的结构类似物

8、的存在而合成 如大肠杆菌乳糖利用酶1、酶合成的诱导（induction）20 诱导剂可以是诱导酶的底物，也可是底物的结构类似物 如：乳糖是大肠杆菌-半乳糖苷酶合成的诱导剂，也是此酶的底物 诱导剂也可以不是该酶的作用底物 如异丙基- -D-硫代半乳糖苷（IPTG）是-半乳糖苷酶合成的极佳诱导剂，但不是作用底物； 酶的作用底物不一定有诱导作用 如对硝基苯-L-阿拉伯糖苷是-半乳糖苷酶的底物，但不能诱导该酶的合成。21酶的诱导可分两种：1）同时诱导 2）顺序诱导当诱导物加入后，同时或几乎同时诱导几种酶的合成；主要存在于短的代谢途径中。如将乳糖加入到E.coli培养基后，可同时诱导出-半乳糖苷透性酶、

9、 -半乳糖苷酶、半乳糖苷转乙酰基酶；不管诱导强度如何，所以这三种蛋白以同一比例合成。 （因为三者的基因组成同一操纵子）先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。22苯乙醇胺苯乙酮酸苯乙醛苯甲酸顺，顺-粘康酸-酮己二酸L-犬尿氨酸O-氨基苯甲酸L-色氨酸N-甲酰犬尿氨酸-酮己二酰CoA乙酸+琥珀酸儿茶酚丙氨酸甲酸假单孢菌芳香氨基酸降解酶类的顺序诱导232、酶合成的阻遏(repression)末端产物阻遏 (end-product repression)分解代谢物阻遏 (catabolite repression)24 指由某代谢途径末端产物过量积累而

10、引起的阻遏。1）末端产物阻遏 (end-product repression) 对直线式途径来说，末端产物阻遏的情况较简单，即产物作用于代谢途径中的各种关键酶，使之合成受阻；对于分支代谢途径而言，情况较复杂，每种末端产物仅专一地阻遏合成它的那条分支途径的酶。代谢途径分支点以前的“公共酶”仅受所有分支途径末端产物的阻遏（多价阻遏作用）。 末端产物阻遏在代谢调节中有重要作用，保证细胞内各种物质维持适当的浓度；普遍存在于氨基酸核苷酸生物合成途径中。252）分解代谢物阻遏 (catabolite repression)是指两种碳源（或氮源）分解底物同时存在时，细胞利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物

11、的有关分解酶合成的现象。or当培养基中同时存在有多种可供利用的底物时，某些酶的合成往往被容易利用的底物所阻遏，这就是分解代谢阻遏。26 最典型的例子是细胞通过最易利用的碳源（如葡萄糖）的分解产物来抑制一些酶的合成。 这个现象最早在青霉素的生产中发现，可快速利用的葡萄糖致使青霉素产量特别低，而缓慢利用的乳糖却能较好地生产青霉素。 进一步的研究表明，乳糖并不是青霉素合成的特殊前体，它的价值仅在于缓慢利用。被快速利用的葡萄糖的分解产物阻遏了青霉素合成酶的合成。27把大肠杆菌培养在含有葡萄糖和乳糖的培养基中，可明显看到大肠杆菌经历了两个对数期。葡萄糖在第一个周期中被利用。在葡萄糖代谢初期，-半乳糖苷酶

12、和半乳糖苷透性酶的合成受阻遏，使乳糖不被利用。葡萄糖被消耗完后，乳糖代谢所需的酶开始合成，于是出现了利用乳糖的第二个生长周期。28 阻遏作用并非快速利用的碳源（或氮源）本身作用的结果；而是其分解代谢过程中所产生的中间代谢物引起； 这种抑制青霉素合成及乳糖利用的现象，起初认为只有葡萄糖才会产生，故称为葡萄糖效应。 所有可以迅速利用或代谢的能源，都能阻遏异化另一种被缓慢利用能源所需酶的合成 分解代谢阻遏涉及到的是一些诱导酶29（二）酶合成调节的机制目前认为，由Monod和Jacob提出的操纵子假说能较好地解释酶合成的诱导和阻遏操纵子(operon)启动基因(promoter)操纵基因(operat

13、or)结构基因(structural gene)RNA聚合酶结合部位操纵基因位于启动基因和结构基因之间，能与阻遏物（一种调节蛋白）相结合，以此来决定结构基因的转录能否进行结构基因为一组功能相关的基因诱导型操纵子（inducible operon）阻遏型操纵子（repressible operon）只有当存在诱导物时其转录水平才最高,并随之转译出诱导酶 负责基质分解 如 乳糖操纵子只有当缺乏辅阻遏物时其转录频率才最高，即只有通过去阻遏作用才能启动所编码酶的合成 负责某些物质合成 色氨酸操纵子30调节基因(regulator gene) 一般位于相应操纵子的附近，也可远离操纵子; 编码组成型调节蛋

14、白 调节蛋白(regulatory protein)是一类变构蛋白，有两个特殊位点，其一可与操纵基因结合，另一位点可与效应物结合。能在没有诱导物时与操纵基因结合只能在辅阻遏物存在时才能与操纵基因结合阻遏物(repressor): 阻遏物蛋白（aporepressor）调节蛋白(可分两种)31效应物(effector)指一类低分子质量的信号物质（如糖类及其衍生物、氨基酸、核苷酸等）。诱导物(inducer)辅阻遏物(corepressor)321.单一效应物调节-酶的诱导机制：（乳糖操纵子） E.coli乳糖操纵子由lac启动基因(lacP)、lac操纵基因(lacO)和三个结构基因(lacZ、

15、Y、A)所组成，三个结构基因分别编码-半乳糖苷酶、透过酶和转乙酰酶。 乳糖操纵子是负调节的代表，在缺乏乳糖等诱导物时，由调节基因(lacI)编码的调节蛋白（即lac阻遏物）一直结合在操纵基因上，抑制着结构基因转录的进行。 当有诱导物如乳糖存在时，乳糖与lac阻遏物相结合，使后者发生构象变化，不能继续结合在操纵子上，操纵子的“开关”被打开，结构基因的转录、翻译可顺利进行。 当诱导物耗尽后，lac阻遏物可再次与操纵基因结合，这时转录的“开关”又被关闭，酶就无法合成，细胞内酶的合成速度急剧下降。33lacIPlacZlacYlacA调节基因结构基因控制部分转录mRNA-半乳糖苷酶透过酶转乙酰基酶利用

16、乳糖生长阻遏蛋白RNA聚合酶O诱导物无活性乳糖操纵子(lac operon) 酶的诱导机制342.单一效应物调节-阻遏机制:(色氨酸操纵子)色氨酸操纵子的阻遏是对合成代谢酶类进行正调节的典例 E.coli色氨酸操纵子也由启动基因、操纵基因和结构基因（5个）三部分组成。5个结构基因分别编码色氨酸合成途径中的5种酶。调节基因(trpR)远离操纵基因，编码阻遏物蛋白；其为由4个亚基组成的四聚体；单独的四聚体不能和操纵基因(trpO)结合，只有先结合了色氨酸分子后改变了四聚体的分子构象才能与trpO结合。当细胞内色氨酸浓度高时，色氨酸与阻遏物蛋白结合，形成完全阻遏物，与操纵基因结合，阻止结构基因转录（

17、色氨酸为辅阻遏物）。当细胞内色氨酸缺乏或不足时，则导致阻遏物脱离操纵基因，使操纵基因“开关”打开，结构基因的转录又可正常进行。35trp ROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBtrpAP邻氨基苯甲酸合成酶-亚基邻氨基苯甲酸合成酶 -亚基吲哚甘油磷酸合成酶Trp合成酶-亚基Trp合成酶-亚基分支酸邻氨基苯甲酸磷酸核糖基邻氨基苯甲酸吲哚甘油磷酸色氨酸羧苯氨基脱氨核糖磷酸36trp ROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBtrpAP阻遏物蛋白（无活性）阻遏物阻遏物（有活性）RNA聚合酶结构基因转录翻译色氨酸合成色氨酸转录将重新开始373.两种效应物的共同调节: (乳糖操纵子的调

18、节与大肠杆菌内的cAMP浓度有关) E.coli 含有一个代谢产物活化蛋白CAP (catabolite activated protein)，也称cAMP受体蛋白CRP；CAP 和cAMP都是lac mRNA合成所必需的。 CAP能与cAMP形成复合物， cAMP- CAP复合物结合在lac 操纵子的启动基因上，可促进转录的进行，实现正调节。 葡萄糖分解代谢的中间代谢物能抑制腺苷酰环化酶活性并活化磷酸二酯酶，从而降低cAMP浓度，此时CAP不能被活化形成cAMP- CAP复合物，从而抑制了lac的转录。双重调控38lacIPlacZlacYlacA调节基因结构基因控制部分阻遏蛋白RNA聚合酶

19、O诱导物乳糖操纵子(lac operon) 分解代谢阻遏 CAPcAMP-CAP复合物cAMP腺苷酰环化酶磷酸二酯酶葡萄糖分解转录 转 录 394.RNA水平的调节机制: 弱化调节 Yanofsky 1973年研究大肠杆菌色氨酸合成时发现；当细胞内有色氨酸存在时，可使转录过程在未到终点之前，便有80%-90%的转录停止。这种调节方式不是使正在转录的过程全部在中途停止，故称弱化作用(attenuation) 弱化调节是通过操纵子的引导区内类似于终止子结构的一段DNA序列实现的，这段序列称为弱化子或衰减子(attenuator) 当细胞内某种氨基酰-tRNA缺乏时，该弱化子不表现为终止子功能；当细

20、胞内某种氨基酰-tRNA充足时，弱化子表现为终止子功能，但这种终止作用并不使所有正在转录中的mRNA全部都中途停止，而只是部分中途停止转录。40 弱化调节方式是在mRNA水平上起作用的； 较为广泛地存在于氨基酸合成操纵子调节中，是细菌辅助阻遏作用的一种精细调控； mRNA含有一引导区（在第一个结构基因的上游），显示出一种不平常的氨基酸密码子的堆积。 如:色氨酸操纵子 两个Trp密码子相邻地位于引导区41trp ROtrpLatttrpEtrpDtrpCtrpBtrpAP？组氨酸操纵子弱化子中存在7个组氨酸密码子；苯丙氨酸操纵子弱化子中存在7个苯丙氨酸密码子42游离mRNA中1与2，3与4配对低

21、浓度色氨酸使核糖体停留在1部位，转录得以完成高浓度色氨酸使核糖体到达2部位，3与4配对，转录终止43三、分支生物合成途径的调节1、同工酶（isoenzyme）调节某一分支途径中的第一步反应可由多种酶催化，但这些酶受不同的终产物的反馈调节. (酶的分子结构不同)如：大肠杆菌的天门冬氨酸族氨基酸的合成途径中，有三个同工酶：天门冬氨酸激酶、，分别受赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸的反馈调节442、协同反馈调节(concerted feedback regulation)需有一种以上终产物的过量存在方有明显的效果单个终产物过量，不产生或只产生很小的影响ABCDEFG453、累加反馈调节 (cumulative

22、 feedback regulation) 每一种末端产物过量只能部分抑制或阻遏，总的效果是累加的BACDEFG30%40%58%464、增效反馈调节 (cooperative feedback regulation) 代谢途径中任一末端产物过量时，仅部分抑制共同反应中第一个酶的活性，但两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各末端产物产生的抑制作用的总和。BACDEFG15%20%90%475、顺序反馈调节 (sequential feedback regulation) 分支途径中几个末端产物抑制分支点后面第一个酶，使分支点产物积累，结果分支点产物又反馈抑制共同途径中的第一个酶，最后使整个

23、代谢途径停止。486、联合激活或抑制调节 由一种生物合成的中间产物参与两个完全独立的、不交叉的合成途径的控制。这种中间体物质浓度的变化会影响这两个独立代谢途径的代谢速率。49肠细菌氨甲酰磷酸合成酶的联合激活和抑制肠细菌中精氨酸和嘧啶核苷酸的合成途径是完全独立的，但它们有一共同的中间体氨甲酰磷酸。负责合成该中间体的酶氨甲酰磷酸合成酶可以被嘧啶代谢途径的代谢物UMP反馈抑制，也可被精氨酸合成途径中的中间体鸟氨酸激活。氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸50四、能荷调节能荷（energy charge）指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可为代谢反应供能的高能磷酸键的量度。能荷调节指细胞通过改变ATP、ADP、AM

24、P三者比例来调节其代谢活动，也称腺苷酸调节。51 能荷不仅调节形成ATP的分解代谢酶类（如磷酸果糖激酶、异柠檬酸脱氢酶、柠檬酸合成酶等）的活性，也调节利用ATP的生物合成酶类（如柠檬酸裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶等）的活性。R代表ATP合成的酶系统U代表ATP消耗的酶系统 5253第 二 节 微生物的代谢调控54 在工业生产中却往往需要单一地积累某种产品，这些产品的量又经常是大大地超出了细胞正常生长和代谢所需的范围； 要达到过量积累某种产品的目的，提高生产效率，必须使原有的调节系统失去控制，在保证微生物适当生存的条件下，建立起新的代谢方式，使微生物代谢产物按照人们的意志积累。 代谢反应的协调是

25、通过细胞自身的代谢调控系统对细胞机能实行精细控制来达到的； 对于生命过程来说，代谢反应的协调是必要的；概述55一、克服反馈抑制和反馈阻遏的调控反馈调节反馈抑制反馈阻遏克服反馈调节，可从以下两方面着手： 降低末端产物浓度 应用抗反馈突变株561、降低末端产物浓度1）营养缺陷型的利用 营养缺陷型是指原菌株因基因突变致使合成途径中断，丧失了合成某种必须物质的能力，而必须在培养基中加入相应物质才能正常生长的突变菌株。 营养缺陷型突变株的代谢流受阻，末端产物减少，解除了末端产物参与的反馈调节，可使代谢途径中的某一中间产物积累。57例1：利用营养缺陷型积累直链代谢途径中间代谢产物58ABCDEEaEbEc

26、Ed 若要积累C，首先要获得缺失酶c 的营养缺陷型。 酶c缺失后，物质C便不再转变成物质D，不再合成物质E。 由于这种突变体已不能合成末端产物E，所以就解除了E对酶a和酶b的反馈调节。反馈抑制反馈阻遏Ec缺陷C59 但是，完全不能合成产物E的突变体，因为不能利用E去进一步合成必须的细胞物质，所以无法正常生长。为了保证突变体的正常生长，培养时须提供低浓度的、不足以引起反馈调节的物质E。这样高浓度的中间产物C就能积累起来了。例如：利用枯草杆菌的精氨酸缺陷型生产瓜氨酸，利用大肠杆菌的赖氨酸缺陷型生产苏氨酸，都是这个道理。60例2：利用营养缺陷型积累分支代谢途径中的中间产物61ABCDEFGHIJMN

27、KL末端产物L和N共同对酶a施以反馈;此外， L抑制酶J1，N抑制酶J2J1J2选用缺失酶J1的突变株，则L的合成受阻。L和N共同对酶a的反馈被解除。又由于酶J2还受到N的调节，只有少量的J能转变成N，于是中间产物J大量积累。J1缺陷J 62谷氨酸棒杆菌的IMP合成途径和代谢调节工业上用谷氨酸棒杆菌的腺苷酸缺陷型生产肌苷酸（IMP）即是此例的应用。63在分支途径中，如果减少某一末端产物的浓度，常常可以积累另一末端产物。例3：利用营养缺陷型积累分支代谢途径末端产物工业上应用的重要例子是赖氨酸发酵64C. glutamicum 的代谢调节与赖氨酸生产 天冬氨酸半醛生成高丝氨酸的途径受阻之后，苏氨酸

28、的生成减少。 苏氨酸与赖氨酸合作进行的反馈抑制便被打破，于是赖氨酸能够大量积累。652）渗漏缺陷型的利用渗漏缺陷型是一种特殊的营养缺陷型，是遗传性代谢障碍不完全的突变型。其特点是酶活力下降而不完全丧失，并能在基本培养基上少量生长。 不会产生过量的末端产物，因而可以避开反馈调节，但它又能合成微量的末端产物，用来进行生物合成；在培养这种突变体时，可不必在培养基中添加相应的物质，就能积累所需的产物。66渗漏缺陷型的获得方法：把大量营养缺陷型菌株接种在基本培养基平板上，挑选生长特别慢而菌落小的即可。应用实例:利用渗漏型育成天门冬氨转甲酰酶活力提高500倍的菌株该菌株为尿嘧啶渗漏缺陷型，当培养基中少量的

29、尿嘧啶消耗后，为尿嘧啶所反馈抑制的天门冬氨转甲酰酶活力增加500倍673）提高细胞渗透性 细胞内合成的发酵产物若要分泌到培养基中，必须经过细胞膜和细胞壁。如果产物不易分泌出细胞，而积累在细胞内，则会引起反馈调节。 改变细胞膜和细胞壁的通透性，使其有利于产物的分泌，也是降低末端产物浓度的一种途径。68 谷氨酸生产菌的细胞膜磷脂含量高时，细胞的通透性较差，磷脂含量低时，通透性较好。 通常在培养基中添加一些控制因素，以达到影响细胞膜磷脂含量的目的。如可使用青霉素来使细胞壁的完整合成受阻。 细胞壁和细胞膜的通透性增大后，产物易于泄出，于是就降低了谷氨酸在细胞内的积累。692、抗反馈调节突变株的利用 在

30、以积累末端产物为目的的发酵生产中，如果代谢途径单一无分枝，往往不能选用营养缺陷型突变株。要提高产量，最好采用抗反馈调节突变株。 抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产。70 抗反馈突变株由于基因突变，它们的酶或无活性的原阻遏物不再与末端产物结合，从而不再发生酶的变构及阻遏物的活化，或者活性阻遏物不能再与发生了突变的操纵基因结合，因此反馈调节被打破，即使在末端产物过量的情况下，也同样可以积累高浓度的末端产物。71 末端产物类似物和末端产物结构类似，因而能够引起反馈，但是它们不能参与生物合成。 在培养基中添加末端产物类似物后

31、，未突变的细胞将由于代谢途径受阻而不能获得生物合成 所需的该种末端产物，从而导致细胞死亡。 那些对类似物不敏感的突变体，则由于原来受反馈控制的酶的结构，或是酶的合成系统已经发生了改变，它们不再受抑制或阻遏的影响，在类似物充斥的情况下照常能合成该种末端产物。72 在工业上，生产氨基酸、嘌呤、嘧啶和维生素的生产菌种大都是抗反馈突变株。例如，用类似物D-精氨酸选出的谷氨酸棒杆菌的抗反馈突变株可使L-精氨酸的产量得到提高。 73二、克服分解代谢阻遏的调控生产中要克服分解代谢阻遏可采取下列措施741、避免使用有阻遏作用的碳源和氮源可采用相对来说不引起分解代谢阻遏的碳源或氮源，如乳糖、多元醇、有机酸和黄豆

32、饼粉等。如：用甘露糖代替半乳糖培养荧光假单胞菌，由于克服了半乳糖的分解代谢阻遏，结果在细胞中所产生的纤维素酶提高了1500倍。752、流加碳源或氮源在考虑经济效益而必须使用有阻遏作用的碳源或氮源时，缓慢流加碳、氮源可使分解代谢产物维持在较低的水平上，而不至于产生阻遏。76如调节基因发生突变，使产生的阻遏蛋白失活，不能与末端分解代谢产物结合；或操纵基因发生突变使阻遏蛋白不能与其结合，都能获得抗分解代谢阻遏的突变株。3、利用抗分解代谢阻遏的突变体77筛选方法： 在以酶受阻遏的底物为唯一氮源的培养基上，选择能正常生长的菌落。例如： 把鼠伤寒沙门氏菌培养在葡萄糖-脯氨酸琼脂上，因为脯氨酸氧化酶被葡萄糖

33、阻遏，所以采用脯氨酸为唯一氮源。 未突变菌株的脯氨酸氧化酶被阻遏，而无法利用脯氨酸作为氮源，菌株不能生长；抗分解代谢阻遏突变株则能够利用脯氨酸而正常生长。78三、对诱导调节的控制 在生产上为了提高诱导酶的产量，对诱导调节控制的常用手段有：791、添加诱导物类似物 在诱导物就是酶的底物的情况下，添加底物类似物来加强诱导作用是最好的。 因为底物类似物不易被所形成的酶分解，而在细胞中始终保持较高的浓度，能够持续地诱导酶的合成，获得较高浓度的酶。例如: 用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导-半乳糖苷酶的合成802、添加辅酶或辅助因子在有些情况下，必须在培养基中添加辅酶才会产生诱导作用例如：丙酮酸脱羧

34、酶的合成需有硫胺存在813、利用组成型突变株 突变可以除去酶合成时对诱导物的依赖组成酶突变株在没有诱导物存在时，能照常合成诱导酶 在生产中使用组成酶突变株时，可不必在发酵液中添加诱导物，且产生的诱导酶活性也比原菌株强。82例如 把大肠杆菌半乳糖苷酶的诱导型菌株经诱变处理后，先在含乳糖的培养基中培养，由于组成型突变株半乳糖苷酶的合成不需诱导即能产生，因此可较诱导型的出发菌株较早开始生长，在一定时间内菌数的增加便较快。 如持续进行培养，由于诱导酶形成后，原菌株生长速率亦逐渐增加，这种选择性造成的差别就会减少。 可用交替在乳糖、葡萄糖培养基中进行培养的方法。两者利用葡萄糖时的生长速率是相同的，乳糖为

35、碳源造成的组成型菌株的优势生长会持续下去。83 在平板上识别组成型突变株的方法，主要是利用在无诱导物存在时进行培养，它能产生酶，加入适当的底物进行反应显示酶活以识别。 如甘油培养基平板上培养大肠杆菌时，诱导型菌株不产酶，组成型菌株可产生半乳糖苷酶。菌落长出后喷布邻硝基苯半乳糖苷，组成型菌株的菌落由于能水解它而呈现硝基苯的黄色，诱导型则无颜色变化。 通常使用酶解后可以有颜色变化的底物，便于迅速检出组成型菌落。8485第 三 节 代 谢 工 程86一、代谢工程概述1、代谢工程的基本定义代谢工程(Metabolic Engineering) 利用生物学原理，系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术

36、合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科。87 1974年，Chakrabarty在假单胞菌属的两个菌种中分别引入几个稳定的重组质粒，从而提高了对樟脑和萘等复杂有机物的降解活性。这是代谢工程技术应用的第一实例。1991年 James E. Bailey (California Institute of Technology) 首次使用该术语又称 途径工程(Pathway engineering)882、代谢工程的基本过程1）靶点设计 最后，根据代谢流分布和控制的分析结果确定途径操作的合理靶点。 通常包括拟修饰基因的靶点、拟导入途径的靶点或拟阻断途径的靶点等。至少包括三个

37、基本过程 正确的靶点设计必须对现有的代谢途径和网络信息进行更深入的分析。 首先，根据化学动力学和计量学原理定量测定网络中的代谢流分布（即代谢流分析; Metabolic flux analysis, MFA），其中最重要的是细胞内碳和氮元素的流向比例关系。 其次，在代谢流分析的基础上调查其控制状态、机制和影响因素（即代谢流控制分析；Metabolic flux control analysis, MCA）。892) 基因操作 利用代谢工程战略修饰改造细胞代谢网络的核心是在分子水平上对靶基因或基因簇进行遗传操作。 其中最典型的形式包括基因或基因簇的克隆、表达、修饰、敲除、调控以及重组基因在目标细

38、胞染色体DNA上的稳定整合。903）效果分析 一次性的代谢工程设计和操作往往不能达到实际生产所要求的产量、速率和浓度，因为大部分实验涉及的只是单一代谢途径有关的基因、操纵子或基因簇的改变。 通过对新代谢进行全面的效果分析，这种由初步途径操作构建出来的细胞所表现出的限制与缺陷，可以作为新一轮实验的改造目标。913、代谢工程的基本原理代谢工程是多学科高度交叉的新型领域，涉及诸多基本原理：1）涉及细胞物质代谢规律及途径组合的化学原理，它提供了生物体的基本代谢图谱和生化反应机制。2）涉及细胞代谢流及其控制分析的化学计量学、分子反应动力学、热力学和控制学原理，这是代谢途径修饰的理论依据。3）涉及途径代谢

39、流推动力的酶学原理，包括酶反应动力学、别构抑制效应、修饰激活效应等。4）涉及基因操作与控制的分子生物学和分子遗传学原理，它们阐明了基因表达的基本规律，同时也提供了基因操作的一整套技术。925）涉及细胞生理状态平衡的细胞生理学原理，它为细胞代谢机能提供了一个全景式的描述，因此是一个代谢速率和生理状态表征研究的理想平台。6）涉及发酵或细胞培育的工艺和工程控制的生化工程和化学工程原理，它为速率过程受限制的系统分析提供了独特的工具和经验。7）涉及生物信息收集、分析与应用的基因组学、蛋白质组学原理，为代谢途径设计提供信息，是代谢工程技术迅猛发展和广泛应用的最大推动力。93二、代谢工程的研究对象简单地说，代谢工程的研究对象就是代谢网络细胞分解代谢途径、合成代谢途径和膜传输系统的有序组合构成代谢网络。广义的代谢网络包括物质代谢网络和能量代谢网络。94 代谢网络分流处的代谢产物称为节点（Node） 其中对终产物合成起决定作用的少数节点称为主节点。 主节点不是固定不变的。95根据网络节点处代谢物流量的调控机制和特性节点分为：柔性节点 （flexible node）刚性节点 （rigi