实验一酶蛋白的定量测定及纯度检测

1、实验一 酶蛋白的定量测定及纯度检测1.考马斯亮蓝法定量测定木瓜凝乳蛋白酶2.SDS-凝胶电泳检测木瓜凝乳蛋白酶 纯度1实验目的1、掌握考马斯亮蓝法测定酶蛋白含量的原理 和方法2、掌握SDS-凝胶电泳检测酶蛋白纯度的原 理和方法2一、实验原理 考马斯亮蓝法：根据蛋白质与染料特异性结合原理设计的。考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm处；当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为蓝色，这个结合主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。1 木瓜凝乳蛋白酶含量测定3其结合物在595nm左右波长下

2、有最大光吸收,而且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。该结合反应在2min左右的时间内达到平衡，且在室温下1h内保持稳定。该法具有操作简便、反应灵敏、稳定性强的优点。适用测定蛋白质浓度的范围为01 000gmL。 4二、实验材料1.考马斯亮蓝G-2502.标准蛋白液：0.5mg/mL牛血清白蛋白3.NaCl溶液4.木瓜凝乳蛋白酶纯化酶5.分光光度计5三、实验方法上述溶液摇匀，室温反应2分钟，在595nm处测定吸光度，以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线；并同时测定木瓜凝乳蛋白酶的吸光度，在标准曲线上求出木瓜凝乳蛋白酶的含量。6四、实验结果1、做出标准曲线并求出

3、其相关系数2、求出木瓜凝乳蛋白酶含量（g/mL ）7 2. SDS-凝胶电泳检测木瓜 凝乳蛋白酶的纯度8一、实验原理聚丙烯酰胺凝胶：是由丙烯酰胺和交联剂甲叉丙烯酰胺在催化剂作用下，聚合而成的凝胶，凝胶具有网状立体结构和具有分子筛效应，因此可用此凝胶为支持物进行电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳有2种形式：第一种，非变性聚丙烯酰胺凝胶：蛋白质在电泳中保持完整的状态，在电泳过程中影响蛋白迁移速率的因子包括：蛋白大小、蛋白形状和蛋白所带电荷。 9第二种，变性聚丙烯酰胺凝胶：在非变性凝胶电泳中加入SDS和巯基乙醇变性剂，SDS能破坏蛋白质分子之间的非共价键，在巯基乙醇或二硫苏糖醇的作用下，蛋白质分子内的二硫键

4、被打开并解聚成多肽链。 10蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，该复合物具有3个特点:A.所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异；B.在溶液中的形状像一个长椭圆棒，消除了蛋白质间分子形状的差异。C.不同蛋白质所形成的椭圆棒的短轴是相同的（约18m），但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS系统中的电泳迁移率主要取决于蛋白质分子量的大小。当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS可以分离、鉴定蛋白质，也可检测其纯度。11二、试剂与材料1、10%过

5、硫酸铵溶液 （新鲜配制） 2、 TEMED（四甲基乙二胺）（避光保存） 3、分离胶缓冲液：1.5M Tris-HCl,pH8.8 4、浓缩胶缓冲液：0.5M Tris-HCl, pH6.8 5、染色液：0.05%考马斯亮蓝甲醇溶液 6、脱色液：7%冰醋酸7、蛋白标准、木瓜凝乳蛋白酶样品8、材料：电泳仪电源、 垂直电泳槽12四、实验方法 配制电泳凝胶（包括分离胶和浓缩胶） 上样（上样量为10 l ,注意不留空槽） 电泳（浓缩胶150V电压，分离胶180V） 电泳胶处理（染色、脱色、拍照保存）13分光光度计PC3100使用注意事项： 测蛋白含量用“含量测定”模式注意事项： 1、制胶时操作戴PE手套 2、玻璃板必须擦干